Poli (bütilenadipat-ko-tereftalat) (PBAT)-bazlı nanotopografik fibröz doku iskelelerinin üretimi ve hücresel davranışların incelenmesi

Sunulan tez çalışmasının amacı doku mühendisliğinde göreceli olarak daha yeni bir polimer olarak kullanım bulan poli(bütilenadipat-ko-tereftalat) (PBAT) temelli ve nanotopografik yüzey özelliklerine sahip fiberlerin ve fibröz matrikslerin kök hücrelerin mekanotransdüksiyon mekanizması ve hücre davranışları üzerindeki etkilerinin incelenmesidir. Nanotopografik fiberler faz ayırım mekanizmalarıyla desteklenen elektroeğirme yöntemiyle üretilmiş, matrikslerin, fiziksel, kimyasal ve morfolojik yapıları karakterize edilmiştir. İnsan göbek kordonu mezenkimal kök hücrelerinin (GK-MKH) matriksler ve tek fiberler ile etkileşimi hücre kültüründe incelenmiştir. Mekanotransdüksiyon mekanizmasının araştırıldığı hücre kültürü çalışmaları kapsamında nanotopografinin yanısıra polimer kimyasal yapısının da etkisini belirlemek üzere ε-polikaprolakton (PCL) nanotopografik tek fiberler PBAT tek fiberler ile karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Nanotopografik morfolojilere sahip fiberleri oluşturmak için kötü çözücüyle indüklenen faz ayrılması (NIPS), buharla indüklenen faz ayrılması (VIPS), nefes şekilleri (BF) ve termal olarak indüklenmiş faz ayrılması (TIPS) mekanizmaları kullanılmıştır. PBAT için, tetrahidrofuran (THF), diklorometan (DCM), 1,1,1,3,3,3-hekzafloro-2-propanol (HFIP) çözücüleri iyi çözücü olarak, dimetilsülfoksit (DMSO) çözücüsü kötü çözücü olarak seçilmiştir. İkili bileşimde THF çözücüsü DMSO ile, DCM çözücüsü HFIP ile eşleştirilmiştir. THF/DMSO grubu için polimer konsantrasyonu % 12 (w/v), çözücü hacim oranları 9/1 (v/v) olarak, DCM/HFIP grubu için ise polimer konsantrasyonu % 10 (w/v), çözücülerin hacim oranları ise 8/2 (v/v) olarak belirlenmiştir. Bu bileşimler sonucu üretilen fiberlerin gözenekli, buruşuk ve oluklu morfolojide oldukları, HFIP çözücüsü kullanılan gruplardaki fiberlerin ise pürüzsüz morfolojide oldukları, taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile belirlenmiştir. Ortalama fiber çapları SEM görüntülerinden hesaplanmıştır. Gelişigüzel ve hizalanmış formülasyonlar için ortalama çap değerleri 2141 ± 860 nm ve 867 ± 487 nm arasında değişmiştir. İki farklı yüzey nanotopografisine sahip PBAT doku iskelerinin (THF/DMSO-buruşuk ve HFIP-pürüzsüz) biyolojik performansları 14 gün boyunca araştırılmıştır. Hücre kültür çalışmaları kapsamında GK-MKH'lerin bu iskeleler üzerindeki morfolojileri, tutunma, çoğalma davranışları; SEM, F-aktin/DAPI immünofloresan boyama (ICC), Alizarin Red boyama ve MTT analizleri ile incelenmiştir. Analiz sonuçlarından, buruşuk nanotopografideki iskeleler üzerindeki hücrelerin tutunma-yayılma davranışının daha belirgin olduğu ve mineralizasyonun daha yoğun olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca bu iskelelerde, osteojenik farklılaşmayı temsil eden belirteçler olan RUNX2, OPN ve OCN için bağıl gen ifadelerinin istatistiksel olarak daha yüksek bir ekspresyon seviyesine ulaştığı RT-PCR analiz sonuçlarından görülmüştür. Çalışmanın mekanotransdüksiyon çalışmaları kapsamında, PBAT ve PCL tek fiberler kendi bazal membranları üzerine faz ayırım destekli elektroeğirme yöntemiyle desenlenmiştir. GK-MKH'lerin polimerik tek fiberlerin nanotopografilerine verdikleri cevap F-aktin/DAPI, fibronektin ve integrin ICC boyamaları ile ortaya konulmuştur. Mekanotransdüksiyon mekanizmasında önemli bir rol oynayan YAP (Yes ile ilişkili protein)'ın görüntülenmesi için ICC boyamaları gerçekleştirilmiştir. ImageJ-FIJI yazılımı ile örneklerin floresan görüntülerinden çekirdek ve sitoplazma boy/en oranları; YAP sinyal oranları ve integrin-fibronektin alanları için sayısal veriler elde edilmiştir. Elde edilen analiz sonuçları istatistiksel olarak karşılaştırılmıştır. Bu aşamada elde edilen bulgular sonucunda, PBAT-bazlı buruşuk nanotopografik yüzeylerde kuvvetli hücre-yüzey etkileşimine bağlı lamellipodia yapılarının belirginleşmesi, integrin ve fibronektin miktarının artması ve özellikle YAP'ın sitoplazmadan çekirdeğe geçişi belirgin bir şekilde gözlenmiştir. Bu durum aktin boyama ve çekirdeğin daha büyük boy/en oranı vermesi ile desteklenmiştir. Çalışmada kullanılan pürüzsüz fiberlerde hücrelerin daha az uzama ve yayılma gösterdiği, hücre iskeletinin çoğunlukla çekirdek etrafında lokalize olduğu görülmüştür. Çalışma kapsamında elde edilen PBAT-bazlı fiber yapılardaki morfolojik değişimlerin ve kimyasal yapının sinerjik etkisi ile hücre tutunma, yayılma gibi pek çok hücresel fonksiyonun daha etkin bir şekilde indüklendiği görülmüştür. Hücresel aktiviteler ve mekanotransdüksiyon üzerinde en etkili olan polimerik yapı PBAT ve en iyi morfoloji de buruşuk nanotopografi olarak belirlenmiştir. Elde edilen bulguların klinik çalışmalarda kullanılabilecek, 3B nanofibröz iskelelerin tasarımına, mekanotransdüksiyonla ilişkili konularda ilgili literatüre ve uygulamalara katkı sağlaması beklenmektedir. Anahtar Kelimeler: Elektroeğirme, ε-polikaprolakton (PCL), poli(bütilenadipat-ko-tereftalat) (PBAT), nanotopografi, mekanotransdüksiyon, insan göbek kordonu mezenkimal kök hücreler (GK-MKH).