Polietilen tereftalat (PET) türü plastiği parçalayan petaz enziminin escherichia coli'de biyoteknolojik olarak üretimi

Polietilen tereftalat (PET), dünya üzerinde en çok kullanılan ve dolayısıyla en çok çevre kirliliğine sebep olan plastik türlerinden biridir. PET'in, geri dönüştürülmesi için kullanılan ve birçok dezavantaja sahip fiziksel ve kimyasal yöntemler ile karşılaştırıldığında biyolojik geri dönüşüm, plastik materyalin bozunurluğunu artırmayan, toksik etkisi bulunmayan, düşük maliyetli ve etkin bir çözüm olarak öne çıkmaktadır. Ideonella sakaiensis bakterisi; salgıladığı Polietilen tereftalat hidrolaz (PETaz) ve Monoetilen tereftalat hidrolaz (MHETaz) enzimleriyle PET'i karbon kaynağı olarak kullanmak üzere monomerlerine parçalar. Günümüzde fiziksel ve kimyasal yöntemlerle geri dönüştürülen PET türü plastiğin biyoteknolojik yöntemler aracılığıyla geri dönüştürülmesi konusu özellikle son 10 yıldır yoğun bir biçimde çalışılmakta olup, diğer PET parçalayıcı enzimlere oranla sahip olduğu yüksek aktivite ve substrat özgüllüğü gibi avantajları nedeniyle PETaz enzimi bu alanda güçlü bir alternatif oluşturmaktadır. Bu tez çalışmasında I. sakaiensis bakterisi tarafından üretilen PETaz enziminin, verimli ve etkin şekilde üretimi amacına yönelik olarak PETaz geninin biyoinformatik tasarımı ve E. coli'de biyoteknolojik olarak üretimi amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda; biyoinformatik yolla (1) PETaz geninde kodon optimizasyonun yapılması, (2) ekspresyon vektörü pET26b'ye klonabilmesi için gene, restriksiyon enzim kesim bölgelerinin eklenmesi, (3) üretilecek rekombinant proteini periplazmik alana yönlendiren, plazmite ait pelB sinyal dizisinin restriksiyon enzimlerinin sınırları içinde tutulması, (4) enzim üretimi sonrası saflaştırma yapılabilmesi için gene Histidin etiketinin eklenmesi ve biyoinformatik yolla tasarlanmış sentetik sentetik genin rekombinant DNA teknolojisi ile ekspresyon vektöründe klonlanması, ardından da PETaz enziminin hücre sitoplazmasında yüksek aktivitede üretilmesi amacıyla, ürettiği DsbC proteini sayesinde disülfit bağlarını sitoplazma içerisinde yapma yeteneğindeki E.coli SHuffle bakterisine aktarılması hedeflenmiştir. Belirlenen hedefler doğrultusunda bu tez çalışmasında I. sakaiensis'e ait orijinal PETaz geninin, aktif ve verimli olarak üretilebilmesi amacıyla, biyoinformatik olarak yeniden tasarımı gerçekleştirildi. Bu kapsamda; kodon optimizasyonu ile, tasarlanan sentetik PETaz geninde GC içeriği %68,73'ten %56.78'e düşürülürken, Kodon Adaptasyon Endeksi (CAI) 0.64'ten 0.80'e çıkarıldı. Genin 5' ucuna NdeI, 3' ucuna HindIII restriksiyon enzimlerinin tanıma bölgeleri ile gen anlatımı sonrası üretilen enzimin bakteriden saflaştırılabilmesi için genin 3' ucuna 6'lı Histidin etiketine ait nükleotit dizisi eklendi. Tasarlanan PETaz geni pTZ57R/T plazmiti içerisinde sentetik olarak elde edildi ve transformasyon yolu ile transformasyon etkinliği: 4,5x102 CFU/g olacak şekilde E. coli DH5α bakterisinde başarıyla çoğaltıldı. PETaz geni, E. coli DH5α'dan izole edilen pTZ57R/T-PETaz plazmit DNA'sından HindIII ve NdeI restriksiyon enzimleri ile çıkarıldı. E. coli DH5α'ya transformasyonla aktarılarak (transformasyon etkinliği: 3,08x102 CFU/g) çoğaltılmış ve izole edilmiş disülfit bağlı enzimlerin yüksek verimde üretilmesine olanak veren yüksek kopya sayılı bir ekspresyon vektörü olan pET26b ekspresyon plazmiti de aynı restriksiyon enzimleri ile kesildi. Agaroz jelde ayrılıp jelden saflaştırılmış beklenen boyutlardaki PETaz geni ve pET26b plazmit omurgasının T4 DNA Ligaz ile ligasyonu gerçekleştirilerek pET26b-PETaz rekombinant plazmiti elde edildi. Rekombinant plazmit, E. coli DH5α'da çoğaltılarak (transformasyon etkinliği: 1,62x102 CFU/g), disülfit bağı taşıyan PETaz enziminin sitoplazmada üretilebilmesi için disülfit bağlarını yapabilme yeteneğindeki E. coli SHuffle bakterisine de 1,24x103 CFU/g etkinliğinde transformasyon ile aktarıldı. Koloni PCR ile rekombinant plazmiti içerdiği saptanan 4 koloniden kurulan kültürlerde 100 mM IPTG ile gen anlatımı indüklendi. Bu kültürlerin 3'ünden PETaz enzimi, polihistidin etiketli proteinlerin izolasyonunu sağlayan manyetik saflaştırma sistemi ile saflaştırıldı. Enzim saflığı 280 nm dalga boyunda spektrofotometrik olarak absorbans ölçümü ve Bradford Yöntemi ile analiz edildi. Rekombinant hücrelerden yüksek verimle izole edilen bu 3 örnekteki saf protein konsantrasyonları sırasıyla 0.935, 0.56 ve 0.59 mg/mL olarak belirlendi. İndüksiyon sonrası toplanarak lizize uğratılan 4. kültüre ait homojenattaki toplam protein konsantrasyonu ise 3.9544 mg/mL olarak belirlendi. Protein izolasyonu sonrası elde edilen en düşük ve en yüksek saf protein konsantrasyonlarının, Chlamydomonas reinhardtii'den elde edilen saf protein konsantrasyonlarından1.44 ile 2.44 kat, total protein miktarının da E.coli'ye ait en düşük ve en yüksek total protein miktarlarından 29 ile 60 kat daha fazla olduğu saptandı. Bu tez çalışmasında, PETaz geninin pET26b ekspresyon plazmitinde klonlanarak verimli bir şekilde çoğaltılabilmesi ve sitoplazma içerisinde disülfit katlanmalarını yapabilen E.coli SHuffle bakterisinde yüksek konsantrasyonda enzim üretilip saflaştırılabilmesi; PETaz enziminin biyoinformatik tasarımının ve uygulanan genetik mühendisliği yaklaşımlarının başarıyla gerçekleştiğini ortaya koymaktadır. Elde edilen bulgular, PET türü plastiğin biyoteknolojik yolla geri dönüştürülmesinde önemli bir potansiyele sahip olan PETaz enziminin büyük ölçekte üretimi için kullanılabilir.