DnaK nükleotit bağlanma domeninin oluşturduğu konformasyonal popülasyonların araştırılması

Proteinler, canlıların yaşamı açısından önemli olan makromoleküllerdendir. Proteinler çeşitli görevlere sahiptirler ve bu görevleri yerine getirebilmeleri için doğru 3-boyutlu konformasyonu kazanmaları gerekmektedir. Küçük proteinlerin bazıları başka bir proteine ihtiyaç duymadan katlanabilirken, uzun zincirli proteinler ribozomun dar yapısından dolayı ribozomun içinde katlanamazlar ve katlanabilmek için moleküler şaperon olarak adlandırılan ısı şok proteinlerine ihtiyaç duyarlar. Hatalı katlanan proteinler, diğer proteinlerin katlanmasını geciktirir ya da engellerler. DNA kontrolünde sentezlenen proteinlerin üçüncül yapılarını kazanmasını sağlamak ısı şok proteinlerinin görevidir. Hem hücre içinde hem de hücre dışında bulunabilen ısı şok proteinleri (Hsp) hücre membranlarında da gözlemlenirler. Isı şok proteinlerinin sentezi sadece normal koşullarda gerçekleşmez, aynı zamanda yüksek sıcaklık, pH değişimi, ağır metal, oksidatif ve kimyasal stres koşullarında sentezlenmeleri hızlanır. Isı şok protein çalışmaları 1960 yılının başlarında Ferruccio Ritossa'nın öncülüğünde, meyve sineği Drosophila melanogaster ile başlamıştır. Isı şok proteinleri (moleküler şaperon) ailesinden olan 70 kDa ısı şok proteinleri (Hsp70s), evrimsel açıdan yüksek derecede korunmuş proteinlerdir. Hsp70'in, bakteriden ökaryotlara kadar bütün canlı organizmalarda önemli rolleri bulunmaktadır. Yeni sentezlenen proteinlerin katlanması, proteinlerin kümeleşmesinin engellenmesi, denatürasyondan korunması, yanlış katlanmış proteinlerin yeniden katlanması, proteinlerin translokasyonlarının sağlanması, hasara uğramış proteinlerin yıkılması Hsp70 tarafından gerçekleştirilir. Katlanmamış proteinlerin hidrofobik bölgeleri açığa çıkar ve Hsp70, katlanmamış proteinlerin hidrofobik bölgelerine hidrofobik etkileşim ile bağlanarak yanlış katlanmayı engeller. Bu sayede hidrofobik etkileşimden kaynaklanan kümeleşmeler engellenmiş olur. Hsp70 hücre içerisinde edindiği görevler dışında hücre homeostazisinde de görev alır. Tüm bu görevlere bakıldığında Hsp70'in hücrenin bekçisi gibi görev aldığını görüyoruz. Proteinlerin yanlış katlanması, kümeleşmesi ya da çökmesi Alzheimer, Huntington, Parkinson, Kennedy gibi bazı nörodejeneratif hastalıklara sebep olabilir. Amiloid yapısındaki proteinler sinir sisteminde birikmeye başladıkları zaman nörodejeneratif hastalıklara sebep olduğu görülmüştür ve beta amyloid birikimini Hsp70 aktivitesinin engellediği keşfedilmiştir (Dou ve ark., 2003; Labrador-garrido ve ark., 2010). Parkinson hastalığına sebep olan α-sinüklein proteininin kümeleşmesinde Hsp70'in koruyucu olarak rol aldığı görülmüştür (Labrador-garrido ve ark., 2010). Alzheimer hastalarında yanlış katlanan tau proteinlerinin çözünürlüğü Hsp70 tarafından arttırıldığı görülmüştür (Dou ve ark., 2003). Aynı zamanda Hsp70'in apoptoz yolağında anti-apoptotik protein olarak görev alır. Çalışmamızda Escherichia coli Hsp70 homoloğu DnaK kullanıldı. DnaK amino (N) ucunda nükleotit bağlanma bölgesi (NBD) ve karboksil (C) ucunda substrat bağlanma bölgesi (SBD) olmak üzere iki temel bölgeden oluşur. Bu iki temel bölgeyi birbirine bağlayan evrensel olarak oldukça korunmuş hidrofobik bir bağlaç bulunur. N ucunda bulunan 44 kDa'lık NBD ATPaz aktivitesi gösterirken, C ucunda bulunan 25 kDa'lık SBD substrat bağlar. Kristalografik yapılarına bakıldığı zaman NBD'nin iki ana lobdan oluştuğu ve bu lobların ise iki alt bölgeye, toplamda IA, IIA, IB, IIB olmak üzere 4 alt domene ayrıldığı görülür. SBD'in kristalografik yapısı incelendiğinde α-heliks ve β-tabaka olmak üzere iki kısım görülür. β-tabakasında substrat bağlama yarığı bulunurken, α-heliks kapak görevi görür ve substrat yarığa gelip tutunduğu zaman SBD'in üzerine kapanır. NBD ve SBD arasında hidrofobik bağlacın sağladığı allosterik bir etkileşim vardır. ADP-bağlı durumda bu iki bölge birbirinden bağımsız davranırken, ATP-bağlı durumda birbirleriyle iletişime geçerek sıkı bir şekilde birbirlerine bağlanırlar. ATP-bağlı durumda NBD dengeli hale gelir, substrat bağlanma afinitesi düşer ve bu sırada SBD'in α-heliks kapak yapısı açıktır. ATP hidrolizlenip Pi ve ADP'ye dönüştüğünde substrat bağlanma afinitesinde artış gözlenir. ADP-bağlı durumda SBD'in α-heliks kapak yapısı SBD üzerine kapanır. Bu döngüye yardım eden iki çeşit ko-şaperon bulunur; ATP hidrolizini hızlandıran Hsp40 (DnaJ) ve oluşan nükleotitin değişimini sağlayan, Hsp70'i yeni döngüye hazırlayan nükleotit değişim faktörlerinden olan GrpE'dir. Gerçekleşen allosterik etkileşimde anahtar olarak rol alan bağlaç bölgesi bulunmaktadır. Bu bağlaç bölgesinin yapısı ve görevi tam olarak aydınlatılamadığı için SBD ve NBD arasındaki sinyal iletimi bilinmemektedir. DnaK392 proteininin NMR analizleri yapıldığında yapısında bulunun (388VLLL392) dizisinin NBD bölgesinin IA ve IIA lobları arasındaki yarığa bağlandığı gözlemlenmiştir (Zhuravleva and Gierasch, 2011). NMR sonuçlarında DnaK392 proteininin yapısının substrat ile indüklenmiş yabanıl tip DnaK'nin yapısına benzediği ortaya çıkmıştır. Bu sebepten dolayı araştırmalarda yabanıl tip DnaK kullanmak yerine DnaK392 proteininin kullanılması tercih edilmiştir. Swain ve arkadaşları tarafından 2007 yılında gerçekleştirilen çalışmalarda, NBD bölgesi ve 9 amino asit içeren bağlayıcı bölgenin tamamını (383GDVKDVLLL392) içeren, SBD içermeyen DnaK392 proteini kullanılmıştır. DnaK392, bağlaç bölgesinde içerdiği (388VLLL392) dizisi sayesinde substrat tarafından uyarılmış yabanıl tip DnaK'yi taklit ettiği ve benzer pH-bağımlı profil oluşturduğu görülmüştür. DnaK392 proteininin aksine bağlaç bölgesinde (388VLLL392) dizisini içermeyen DnaK388 proteininin sonuçlarını bakıldığında, ATPaz aktivitesinin peptit bağlı olmayan yabanıl tip DnaK gibi davrandığı ve pH-bağımlı profillerinin benzer olduğu görülmüştür. DnaK392 ve DnaK388 proteinlerinin incelenmesiyle (388VLLL392) dizisinin SBD ve NBD bölgeleri arasındaki sinyal iletim mekanizmasını nasıl etkilediği gözlemlenmiştir. Çalışmanın sonucuna bakıldığında hidrofobik bağlaç bölgesinin (388VLLL392) dizisini içermesi allosterik etkileşimi sağlamakta, dizinin varlığında ve yokluğunda görevlerin farklı olduğu anlaşılmaktadır. Bu çalışmada, daha önceki çalışmalarda olduğu gibi yabanıl tip DnaK392 ve DnaK388 plazmiti DnaK geni içermeyen Escherichia coli BB1553 kompetan hücrelerine transformasyon ile aktarılıp IPTG ile indükledi. Art arda gerçekleştirilen anyon değişim kromatografisi ve afinite kromatografisi ile proteinlerin saf hali elde edildi. DnaK proteininin ATP'ye bağlanma özelliği olduğu için afinite kromatografisi adımında bu özellik kullanılarak ATP-agaroz kolonu kullanıldı. Dairesel dikroizm (CD) ışığı, hem sağ hem sol dairesel polarize ışığa dönüştürülür ve proteinin peptit bağlarının ışığı emmesiyle eliptiktik değeri bulunur. CD spektroskopi kullanılarak DnaK392 ve DnaK388 proteinlerinin ikincil yapısı ve kararlılığının önceki çalışmalar ile benzerlik gösterdiği görüldü. DnaK392 ve DnaK388 için ATPaz aktivite ölçümleri yapılarak literatürde gösterilmiş olan pH'a bağımlı ATPaz aktivitesine etkilerinin olup olmadığı kanıtlanmaya çalışılmıştır. DnaK392'nin, substratla uyarılan DnaK formuna benzer bir ATPaz aktivitesine sahip olduğu bildirilmiştir. Aksine, DnaK388, uyarılmamış DnaK durumu ile benzer bir ATPase aktivitesine sahiptir. Bu çalışmada, denge durumunda (388VLLL392) dizisinin ATPaz bölgesinin farklı uyarlanabilir uyumlarını tespit etmek istiyoruz. Bu sonuca ulaşmak için doğal kütle spektrometresi ve iyon-hareketlilik kütle spektrometrisi yöntemleri kullanılmıştır. İyon-hareketlilik kütle spektrometresi (IM-MS), iyonları elektrik alanı etkisi altında kütle/yük oranlarına göre ayıran analitik tekniktir. IM-MS'de elektrik alanı iyonları hızlandırırken, taşıyıcı tampon gazı ile iyonların çarpışması hızlarını yavaşlatır. İyonların dedektöre ulaşma süreleri biyomoleküllerin büyüklükleriyle orantılı olduğu için, biyomoleküller ne kadar büyük olursa dedektöre ulaşma süreleri de o kadar fazla olur. Deneysel bulgularda, DnaK392'nin doğal kütle spektrometresi ile yük dağılımına bakıldığında pH değerinin 7.5'in altındayken DnaK392'nin en etkin yükü olan +13'ün yük durumu kayması sonucu +14 olduğu gözlemlenmiştir. DnaK392'nin aksine, pH değerinin bazikliği arttıkça DnaK388 en etkin olduğu yükünü korumuş kimyasal kayma gözlemlenmemiştir. DnaK392 ile farklı pH denemeleriyle yapılan IM-MS çalışmalarında, pH 7.5'in altındayken ağırlıklı olarak tek popülasyon gözlemlenmiş, pH 7.5'in üzerindeyken belirgin iki farklı konformasyon belirlenmiştir. DnaK388 için pH 6.5 ve 8.5 aralığında büyük konformasyonel değişikliklere neden olmadığı gözlenmiştir. Bu sonuçlar ışığında, bağlaç bölgesinde, (388VLLL392) dizisini içeren popülasyonun allosterik olarak aktif DnaK olduğu IM-MS ile gösterilmiştir.