Isı stresine dayanıklı ve hidrojen üretim kapasiteleri farklılaşmış Rhodobacter capsulatus mutant suşlarının proteomik ve genetik analizleri

Fosil yakıtların yenilenebilir olmaması ve kullanımlarından kaynaklı ortaya çıkan; sera gazı salımı, hava kirliliği ve denizlerde asiditenin artması gibi çevresel sorunlar, bilim insanlarını alternatif enerji kaynaklarını araştırmaya yönlendirmektedir. Hidrojen, enerji sistemlerindeki önemi özellikle son yirmi yılda artan temiz bir enerji taşıyıcısıdır. Hidrojenin önemi; doğada en yaygın bulunan element olması, yakılması sonucunda sadece su buharı oluşturması ve birim ağırlık başına yüksek enerji verimliliği bulunmasından kaynaklanmaktadır. Hidrojen günümüzde çoğunlukla fiziko-kimyasal yöntemlerle üretilmekte, fakat bu yöntemlerin sera gazı açığa çıkarıyor olmasından dolayı alternatif enerji üretim prosesleri aranmaktadır. Bu amaçla, hidrojenin biyolojik yollarla üretilmesi en temiz alternatif olarak göze çarpmaktadır. Fotoheterotrofik mikroorganizmaları kullanarak biyolojik hidrojen üretimi, hidrojen üretiminin en temiz yöntemlerinden biridir. Bu tip hidrojen üretimi, kapalı alan fotobiyoreaktörleri ve açık alan fotobiyoreaktörleri olmak üzere iki farklı reaktör sisteminde gerçekleştirilir. Açık alan foto biyoreaktörleri ışık kaynağı olarak gün ışığını kullandıkları için işletme maliyeti açısından kapalı alan fotobiyoreaktörlerine karşı avantajlı konumda bulunmaktadır. Fakat açık alan koşullarında çevresel etmenlerin kontrolü mümkün olmadığından, ilgili biyoreaktör içerisinde bulunan mikroorganizma kültürleri sezona ve gün devinimine bağlı olarak ısı şokuna maruz kalmaktadır. Açık alan fotobiyoreaktörlerinde aşırı ısınmaya bağlı verim kaybını gidermek için ısıya dirençli mikroorganizmalar arzu edilir. Bu çalışmada, daha önceki bir çalışmada yönlendirilmiş evrim yaklaşımıyla elde edilmiş olan, ısıya dirençli Rhodobacter capsulatus A52 ve B41 adlı, sırasıyla düşük ve yüksek hidrojen üretim kapasitesine sahip mutant suşların karşılaştırmalı tüm genom dizi, proteomik ve transkriptomik analizleri gerçekleştirilerek; istenilen daha yüksek hidrojen üretim kapasitesi ve ısı direnci ile ilgili mutasyonlar ve ekspresyon farklılıkları tespit edilmiştir. Yönlendirilmiş evrimle geliştirilen bakteri suşlarında arzu edilen bir fenotipik özellik; öncelikle bakteri popülasyonu üzerinde mutasyon oranını artıracak bir ajan kullanılıp genetik çeşitliliğin arttırılmasına, sonrasında ilgili popülasyon üzerine artan stres koşulları uygulanarak arzu edilen fenotipe sahip organizmaların seçilmesine dayanır. Bu yöntem, istenilen fenotipin geliştirilmesi için çok uygun bir yöntem olmasına karşın, ilgili fenotipi oluşturan genetik faktörler bilinmediği için mutantların tam bir genomik, protemik ve transkriptomik karakterizasyonunu zorunlu kılmaktadır. R. capsulatus bakterisinde hidrojen üretimi sadece azotun limitli olduğu fotosentetik koşullarda gerçekleşmektedir. Bu koşullar altında elektron taşıma zinciri elemanlarının bulunduğu hücre membranı aşırı derecede indirgenerek hücre redoks dengesi bozulur. R. capsulatus, redoks dengesini sağlayabilmek için karbon xxiv fiksasyonu (RubisCO) ve azot fiksasyonu (Nitrojenaz) mekanizmalarını aktive eder. R. capsulatus hidrojen üretimi nitrojenaz enzimi elemental azotu amonyağa indirgerken yan ürün olarak oluşmaktadır. Bu nedenle; gerçekleştirilen genomik, proteomik ve transkriptomik analizlerde, özellikle bu iki sistemi kodlayan veya ifade düzeylerini kontrol eden genler ve proteinler üzerindeki varyasyonlar dikkate alınmıştır. Bu çalışmada karakterizasyon analizlerine genomik analizlerle başlanmıştır. Genom analizleri, yeni nesil dizileme teknolojisi kullanılarak gerçekleştirilmiş olup, elde edilen veriler; ısı-stresine dayanıklı mutant suşların ve yaban-tip DSM1710 suşunun de novo genom birleştirmeleri ve mutant suşların yaban tiple karşılaştırılmasıyla genetik varyasyonların tespiti için kullanılmıştır. Genomik analizler, doğrudan hidrojen üretim metabolizması ile ilişkili küçük bir mutasyon grubuna işaret etmektedir, bu mutasyonların bir kısmı ilgili gen bölgelerinin içerisinde diğerleri de gen ifadesinin regülasyonunda görevli bölgeler üzerinde bulunmaktadır. Mutant B41 genomunda mutasyonlar; nifD, nifJ, glnD, nifBl, ccpA, hupD, dmsA ve cbbR1 genlerinde; A52 mutantında mutasyonlar, nifB2, rnfF, nifJ, cbbO, anhH, amt, moeA ve hupD genlerinde karakterize edilmiştir. Genomik analizleri takiben ilgili mutant ve yaban-tip suşlar üzerinde proteomik analizler gerçekleştirilmiştir. Proteomik analizler, LC-MS/MS sıralı kütle spektrometrisi ve iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforezi yöntemleri kullanılarak gerçekleştirilmiş ve ilgili mutant suşlar ile yaban-tip DSM1710 suşu arasındaki protein ifade düzeyi farklılıkları tespit edilmiştir. Proteomik analizler, R.capsulatus'un hidrojen üretim metabolizmasında, RCAP_rcc03215, RCAP_rcc03277 ve RCAP_rcc00730 varsayımsal proteinlerinin olası düzenleyici işlevlerini ortaya koymuştur. Tüm genom dizi analizleri ve proteomik analizler sonucunda elde edilen veriler glnD, cbbR1, hupD ve dmsA genleri üzerindeki mutasyonların B41 suşunun yüksek hidrojen verimine sahip olmasındaki temel sebepler olduğunu, A52 suşunun hidrojen üretiminin düşük olmasının temel sebeplerinin de nifA ve nifH genlerindeki mutasyonlar olduğunu göstermektedir. İlgili mutasyonların etkisinin transkriptomik düzeydeki etkilerinin belirlenmesi için gerçek-zamanlı kantitatif ters-transkripsiyon PZR analizleri gerçekleştirilmiştir. Hidrojen üretimi açısından azot metabolizmasına bağlı mutasyonların etkileri nifA geninin (diğer azot fiksasyon genlerinin aktivatörü), nitrojenaz yapısal gen nifH, nitrojenaz regülatörü ntrC geni, RubisCO yapısal genleri cbbL, cbbS ve cbbO, nitrojenaz demir proteini kodlayan anhH geni, hidrojenaz olgunlaştırma proteazı kodlayan hupD, molibdopterin biyosentez proteini kodlayan moeA, amonyum taşıyıcı gen amt ve dimetil sulfoksit redüktaz A altbirimini kodlayan dmsA genleri üzerinde sınanmıştır. Yapılan analizler nifA, nifH ve glnD ifade düzeylerinin B41 mutantında önemli derecede arttığını (yaklaşık olarak 2 kat, glnD için 7 kat), öte yandan A52 mutant suşunda ciddi ölçüde azaldığını (10-16 kat azalma) ortaya koymuştur. Karbon metabolizması için önem arz eden cbbL ve cbbS genlerinin ifadelerinde mutant suşlar arasında önemli bir farklılaşma görülmemesine karşın, RubisCO aktivatörü cbbO ifade düzeyinin B41 mutantında önemli ölçüde azaldığı, yani karbon metabolizmasının ilgili mutantta yavaşladığı tespit edilmiştir. Bu durum, elektron havuzundaki elektronların nitrojenaz sistemine aktarıldığını ve bunun, bu mutant suştaki hidrojen üretiminin artmasındaki sebeplerden biri olduğu şeklinde ortaya koyulmuştur. Proteomik ve genomik analiz verileriyle uyumlu olarak; en umut verici mutasyonlar, ısıya dirençli mutantlar arasında yüksek hidrojen üreten suş olan B41 suşunun glnD ve cbbR1 genlerinde bulunan mutasyonlardır. Sonuç olarak bu çalışmada, ilgili mutant suşların moleküler karakterizasyonu gerçekleştirilmiş ve R. capsulatus'un biyohidrojen üretimini arttırmak için gelecekte yapılacak çalışmalara yönelik yeni hedef genler tespit edilmiştir.