Fibrozun şeffaflaştırılmış insan ve fare karaciğer dokularında slaytsız bir yöntem kullanarak ışık tabakalı floresan mikroskobu ile kantifikasyonu

Plan ve amaç: Karaciğer fibrozu, her türlü karaciğer hasarında gelinen ortak bir son noktadır. Karaciğer biyopsisi, fibroz derecesini belirlemek ve ardından hastalara uygun tedaviyi sağlamak için kullanılan tek güvenilir yöntemdir. Ancak, karaciğer biyopsisinin bazı sınırlamaları vardır. Numune alma hatası, gözlemci değişkenliği ve yarı kantitatif değerlendirme, hepatik fibrozun doğru şekilde değerlendirilmesini sınırlandırabilecek yöntemin önemli bir kısıtlamalarıdır. Buna ek olarak, küçük parça numunelerin kullanımı da derecelendirme yanlışlığını artırabilir. Hepatik fibroz değerlendirmesindeki sorunlar, özellikle NASH klinik çalışmalarında etkili biyobelirteçlerin ve terapötiklerin gelişimini sınırlandırmaktadır. Şeffaflaştırılan karaciğer biyopsinin kesit alınmadan değerlendirilmesi, karaciğer fibrozunun doğru şekilde tayinine yardımcı olabilir. Bu amaçla, insan ve fare karaciğer dokularında hepatik fibrozun miktarını belirlemek için modifiye edilmiş CLARITY ve özel olarak üretilmiş bir ışık tabakalı floresan mikroskop kullanarak bir platform geliştirdik. Materyal ve yöntem: Bu çalışmaya insan gönüllülerinden yüz altmış sekiz karaciğer örneği dahil edilmiştir. Kohort elli yedi NAFLD, otuz sekiz viral hepatit hastası ve on üç iyi huylu karaciğer hastalıkları nedeniyle hepatik rezeksiyon geçirmiş olguyu içeriyor. Sirius-Red boyalı fare ve insan karaciğer kesitleri, karaciğer fibrozunun 2B değerlendirilmesi için uzman patolog tarafından incelenmiş ve kolajen orantısal alan (CPA) ölçümleri hesaplanmıştır. Karaciğer numuneleri, modifiye ediliş CLARITY yöntemi kullanılarak temizlenmiş ve özel olarak hazırlanmış bir ışık levhası mikroskopuyla görüntülenmiştir. Yöntemin fibrozun ara aşamalarında uygulanabilirliğini test etmek için C57Bl/6 farede beş farklı karaciğer hastalığı modeli geliştirilmiştir. Kollajen tip I ve Elastin proteinleri, özel olarak hazırlanmış ışık tabakalı mikroskop aracılığıyla kesitsiz bir yaklaşım kullanılarak, temizlenmiş insan karaciğer dokularında miktarları belirlenmiştir. Kolajen orantılı hacmi (CPV) ve elastin orantılı hacmi (EPV) hesaplamak için tüm karaciğer numunelerinin birden fazla optik kesit kullanılmıştır. Bulgular: Bu projede hepatik fibrozun volümetrik değerlendirilmesi için şeffaf karaciğer dokuları elde ettik. Modifiye edilmiş CLARITY yöntemi, insan ve fare karaciğer dokularını etkili bir şekilde şeffaflaştırmıştır. Karaciğer fibrozunda en çok üretilen ECM proteinleri, kolajen tip I ve Elastin, insan NAFLD ve viral hepatit kohortlarında miktarları belirlenmiştir. CPV ve EPV kesme değerleri, insan NASH kohortunda her bir fibrotik aşama için belirlenmiştir. Analizler, volümetrik görüntüleme verilerinin optik kesitleri arasında önemli kesitsel değişkenlik olduğunu göstermiştir. Varyasyon katsayısı analizi varyasyon derecesini belirlemiş ve F3-4 NAFLD gruplarının CPV ve EPV kesitleri için %84.6 ara ve yüksek seviyeli varyasyon bulmuştur. CPV ve EPV için belirlenmiş kesme değerlerine sahip optik kesitlerinin 3B derecelendirmesi, optik kesitlerinin yalnızca %44 ve %47'sinin F3 ve F4 için aynı şekilde derecelenebileceğini göstermiştir. Sonuç: Özel olarak üretilmiş bir ışık tabakalı mikroskop kullanarak hepatik fibrozun 3B patolojisini değerlendirmek için slaytsız bir yöntem geliştirdik. Tüm karaciğer biyopsileri hacimsel görüntü analizi, biyopsi içinde önemli heterojenite olduğunu ortaya çıkardı. Hepatik fibrozda hücre dışı matriks proteinlerinin kapsamlı profillemesi ve kesitsiz ve tahrip etmeyen bir yöntemle miktarının belirlenmesi derecelendirme doğruluğunu artırabilir. Bu nedenle, bu yöntemin kullanılması NASH klinik çalışmalarına katkı sağlayabilir.