Ratlarda deneysel subaraknoid kanama ile oluşturulan serebral vazospazm etyopatogenezinde rol oynayan apopitozis ve lipid peroksidasyonunun önlenmesinde sildenafil'in rolü

Subaraknoid kanama sonrası gelişen vazospazmın meydana gelişi ve oluşum mekanizmaları ile ilgili yapılan klinik ve labaratuar çalışmalar neticesinde, bu patolojik durumun multifaktöriyel ve içiçe girmiş bir çok biyokimyasal reaksiyonlar sonucunda oluştuğu düşünülmektedir. Ancak anevrizma rüptürü neticesinde subaraknoid alana olan kanamada eritrositlerin hemolizi sonucunda ortaya çıkan oksihemoglobinin, vasküler ve nöronal yapılarda patolojik süreci başlatan bir çok reaksiyonda rol alması nedeniyle vazospazmın oluşumuna neden olan en önemli faktörlerden biri olduğu kabul edilmektedir. Bununla beraber hemoglobine olan affinitesi oksijenden 1000 kat daha fazla olduğu tespit edilen Nitrik oksid adlı moleküler yapının keşfiyle beraber, SAK sonrası miktarının azalmasının, vazospazm gelişiminde çok önemli bir faktör olduğu ileri sürülmektedir(1). Oksihemoglobinin ve diğer kan hücrelerinin kanama sahasında başlattığı inflamasyon, serbest radikal üretimi, lipid peroksidasyonu ve apopitoz, vasküler yapılarda vazospazma neden olarak damarsal yapıların konstrikte olmasına ve nöronal ve vasküler yapıların iskemiye girmesine neden olmaktadır. Vasküler endotelyal hücrelerde olan bu hasar ve serbest radikal üretimi nedeniyle NO'in hem yapımı azalmakta hemde varolan NO tüketilerek damarlar konstrikte olmaktadır. Bu amaçla vazodilatatör, antienflamatuar, antioksidan ve serebral kan akımı regülasyon özellikleri olan NO'in miktarının arttırılmasının vazospazmda iyi bir tedavi seçeneği olacağını düşündük. Bu amaçla fosfodiesteraz V inhibitör etkisi ile NO-cGMP yolağının artımına neden olan, klinikte erektil disfonksiyon ve pulmoner hipertansiyon tedavisinde kullanılan sildenafil sitratın vazospazm tedavisindeki etkilerini araştırmak amacıyla deneysel çalışmamızı gerçekleştirdik. Bu çalışmada 7 adet Sprague-Dawley cinsi ağırlıkları 245-550 gr arası olan erkek ratlardan oluşan 4 grup oluşturuldu. Grup 1'de yer alan ratlara hiç bir işlem uygulanmadan sakrifikasyon uygulandı. Grup 2'de yer alan ratların sisterna magnalarına 0.4 cc/kg'a otolog arteryal kan verilerek deneysel subaraknoid kanama oluşturuldu. Grup 3'te yer alan ratlara aynı şekilde subaraknoid kanama oluşturularak kanamadan hemen sonra 5 mg/kg/gün sildenafil oral olarak verildi. Grup 4'te yer alan ratlarada aynı usulde deneysel v subaraknoid kanama oluşturularak kanamadan hemen sonra 15 mg/kg/gün sildenafil oral verildi. Deneyde, östrojenin iskemide eksitoksisiteyi, glutamat reseptör etkinliğini ve immun enflamasyonu azaltarak akson myelinizasyonunu sinaptogenezisi ve dendritik dallanmayı arttırarak nöroprotektif etki göstermesi nedeniyle erkek rat kullanıldı(2). Subaraknoid kanama yapılan tüm ratlar 48.saatte sakrifiye edildi. Tüm ratların baziller arterlerinden 3'er kesit alınarak baziller arterin çapı freeware imaj analiz sistemleri (ImageJ, version 1.341; National Institutes of Health, Bethesda, MD) bilgisayar programı ile ölçüldü. Lipid peroksidasyon değerleri için baziller arterin beslediği serebellumdan örnekler alındı ve tiyo barbitürik asit yöntemi ile nmolTBA/g yaş doku olarak hesaplandı. Gruplardaki baziller arter kesitlerindeki apopitozu göstermek amacıyla In Situ Cell Detection Kit, POD (Roche, Germany) kullanıldı. Apopitotik indeks immünreaktif nukleusların total endotel hücre sayısına oranı ile hesaplandı. Sonuçlar yüzde olarak ifade edildi. Buna göre boyanma saptanmayan kesitler Grade 0, %0-24 oranında apopitoz Grade 1, %25-49 arasındakiler Grade 2, %50-74 arasındakiler Grade 3 ve %75-100 oranında arteriyal apopitotik hücre boyanması gösterenler Grade 4 olarak ifade edildi. In Situ Cell Detection Kit ile yapılan çalışmalarda apopitotik hücrelerle beraber nekrotik hücrelerde de TUNEL reaksiyonunun yanlış pozitif reaksiyona neden olmasından dolayı kaspaz 3, kaspaz 8, p53 ve sitokrom c adlı apopitotik markerlarda çalışılmıştır(3). Çalışmamızda sitokrom c'yi apopitotik mitokondriyal yolağı, kaspaz 8'i kaspaz bağımlı yolağı, kaspaz 3'ü kaspaz bağımlı ve bağımsız yolun ortak ürünü, p53'ü ise tüm apopitotik sürecin en önemli markerı olduğu için kullandık(100,101). Buna göre SAK grubundaki ratların baziller arterler kesit alanlarının kontrol grubuna göre %57 oranında daraldığı, sildenafil 5mg/kg/gün verilen grupta ise daralmanın kontrol grubu olan grup 1'e göre %16.8 olduğu tespit edildi. Sildenafil 15 mg/kg/gün verilen grupta ise bu daralmanın %7.1 olduğu görüldü. Elde edilen kesit alanları istatiksel açıdan Post Hoc Tukey testi ile karşılaştırıldığında sildenafilin vazospazma karşı koruyucu etkisinin olduğu saptandı (p<0.0001). Lipid peroksid değerlerine bakıldığında SAK oluşturulan Grup 2'deki lipid peroksid değerinin kontrol grubu olan grup 1'e göre belirgin olarak arttığı görüldü. Tedavi gruplarındaki lipid peroksid miktarlarının grup 2'deki değerlere göre anlamlı derecede azaldığı tespit edildi (p<0.0001). Gruplardaki In Situ Cell Detection Kit (POD (Roche, Germany) ile yapılan immunohistokimyasal boyama yöntemi ile apopitotik hücre oranlarına baktığımızda grup 2, 3 ve 4'teki apopitotik hücre yüzdelerinin sırasıyla %88, %83 ve %81 olduğu, kontrol grubundaki apopitotik hücre vi yüzdesinin %0 olduğu saptandı. Kaspaz 3, kaspaz 8, sitokrom c ve p53 ile yapılan incelemede herhangi bir işlem yapılmayan kontrol grubu grup 1de endotelyal hücrelerde apopitotik bir boyanma saptanmazken, tedavi grupları ile SAK grubu arasında apopitotik endotelyal hücreler incelendiğinde herhangi bir fark saptanmadı. Tedavi gruplarının apopitoz üzerinde herhangi bir etkisinin olmadığı görüldü. Sonuçlar dahilinde sildenafilin vazospastik damarlar üzerindeki iyileştirici etkisi ve lipid peroksidasyonunu önlemedeki anlamlı sonuçları nedeniyle yakın gelecekte vazospazm tedavisinde yer alabilecek bir ilaç olduğuna inanıyoruz. Apopitozu engellemenin vazospazm oluşumunu engellemeyeceğini, vasküler ve nöronal hücreleri canlı tutmada yeterli olmadığını, tedavinin amacının ve asıl önem verilmesi gereken konunun kan pıhtısının kimyasal reaksiyonlarını engellemek, lipid peroksidasyon oluşumunu önlemek ve NO miktarını arttırmak olduğunu düşünüyoruz. Anahtar kelimeler: Subaraknoid kanama, Vazospazm, apopitoz, lipid peroksidasyonu, sildenafil.