Rekombinant antikor fragmentlerinin üretimi ve genetik modifikasyonuyla sitokin ölçümüne yönelik immünoassay geliştirilmesi

İmmün yanıtın ve inflamasyonun düzenlenmesinde önemli rol oynayan sitokinler, birçok hastalığın tanısında biyobelirteç olarak kullanılırlar. Patojenlere ya da hastalıklara karşı gelişen bu immün yanıt sırasında sitokin derişimleri hızla değişir ve kontrol altına alınamazsa sepsis gibi ağır bir duruma sebep olabilir. Bu sebeple, sitokin seviyelerinin ölçümü erken tanı ve tedavide büyük önem taşımakta, hassas, hızlı ve ekonomik testlerin geliştirilmesi gerekmektedir. Biyolojik örnekler içerisindeki bileşenlerin ölçümünde en hassas ve spesifik yöntemler, antikorların tanıyıcı molekül olarak kullanıldığı immünosensörlerdir. Yüksek afinite ve özgüllükleri sebebiyle biyosensörlerde tanıyıcı molekül olarak kullanılan monoklonal antikorlar (mAb), teşhis ve tedavide önemli bir yere sahiptir; fakat üretim maliyetleri yüksektir. Küçük, glikozillenmemiş antikor fragmentlerinin prokaryotlarda yüksek verimle üretilebilmesi, gerekli zaman ve maliyeti azaltır. Bu bağlamda, tek zincirli değişken fragmanı adı verilen scFv'ler, küçük boyutlu (25 kDa), mAb ile benzer özgüllük ve afiniteye sahip proteinlerdir. ScFv'ler, boyutları sebebiyle IgG'ye kıyasla daha kolay modifiye edilebildiğinden, sensör yüzeylerine immobilizayonlarında farklı yöntemler kullanılabilmesine olanak sağlar. ScFv'lerin yüzeye daha yüksek yoğunlukta ve yönlendirilerek bağlanabilmesi, fonksiyonel antijen bağlanma bölgelerinin sayısını arttırır ve bu şekilde, biyosensörlerin hassasiyeti de arttırılabilir. Bu tez çalışmasında, çeşitli anti-sitokin scFv'lerin, Escherichia coli (E. coli) bakterisinde rekombinant üretimi ve yüksek hassasiyetli immünoassaylerin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bakteriyel üretimin avantajları (düşük maliyet, proses kontrol kolaylığı) kullanılarak kolay, hızlı, hassas ve düşük maliyetli bir immünoassay üretimi temel hedeftir. Sınırlı sayıda çalışmada üretilmiş anti-TNFα, anti-IL6, anti-IL1β ve anti-IFNγ scFv'lerde, verim, geri kazanım, stabilite, bağlanma aktivitesi ve çözünürlük problemleri görülmektedir. Çözünürlük, stabilite, bağlanma aktivitesi ve üretim verimlerinin iyileştirilmesi amacıyla, E. coli SHuffle® T7 Express suşunun kullanımı, daha az oksitleyici sitoplazmik ortamı sayesinde çözünür formda scFv üretimi için ilk hedef olmuş; klonlama adımları gen kasetinin tasarımları doğrultusunda başarıyla tamamlanmıştır. Gen ve proses düzeyinde yapılan optimizasyonlar sonucunda bakteriyel rekombinant protein üretiminde sıkça görülen düşük protein çözünürlüğü ve düşük saflaştırma verimi elde edilmiş; problemin çözümü için sarkozil ile inkülüzyon cisimlerinden aktif protein eldesi sağlanmıştır. Bu yöntemde denatüre edici ajanlar kullanmadan ve tekrar katlama gibi zahmetli deneyler yapılmadan daha yüksek verimde protein elde etme avantajı doğmuştur. İnklüzyon cisimlerinden protein üretim veriminin, çözünür fraksiyondan protein eldesine kıyasla 8-10 kat fazla olduğu görülmüş ve literatürle karşılaştırıldığında yüksek verim ve saflıkta scFv'ler elde edilmiştir (>%95 saflık, 23 mg/mL). Bu teknik, anti-sitokin scFv'ler haricinde, E. coli'de üretilecek diğer rekombinant proteinlerde de kullanılabilecektir. Üretim sonrası immobilize metal afinite kromatografi (IMAC) ile saflaştırılan scFv'lerin SDS-PAGE, Western Blot ve ELISA ile karakterizasyonları yapılmış; sonrasında ilk etapta AuNp ile işaretlenmiş ve yatay akışlı immünosensörler üretilmiştir. Test bölgesinde non-spesifik bağlanmanın görülmesi sebebiyle ELISA tabanlı testlerin üretimi tercih edilmiştir. Sonuç olarak, sitokin ölçümü için kullanılan ticari mAb-temelli kitlerde genel olarak kullanılan ELISA yönteminde mAb fragmentleri (scFv) kullanılmış, teşhis limiti (LoD) 49 pg/mL ve Kd=0,77 µM afiniteye sahip stabil testler üretilmiş ve birçok hastalığın tanısında rol oynayabilecek bir biyoteknolojik ürün için literatüre katkı sağlanmıştır.