Extracellular production of recombinant microbial transglutaminase enzyme in Pichia pastoris

Biyoteknolojik gelişmeler hızla ilerlerken, enzimler gıda sektöründe ve diğer pek çok alanda üretimin iyileştirilmesi, verimlilik ve kalite artışı için kullanılmaktadır. Transglutaminaz enzimi uzun zamandır biyoloteknoloji alanında gıda katkı maddesi olarak kullanılan ve pek çok organizma tarafından sentezlenebilen bir enzimdir. Metilotrofik bir maya olan Pichia pastoris (P. pastoris) ekspresyon sistemi, son yıllarda birçok rekombinant proteinin üretiminde hem araştırma hem de endüstriyel amaçlarla başarıyla kullanılmaktadır ve en etkili heterolog protein ekspresyon sistemlerinden biridir. Bu çalışmada, Streptomyces mobaraensis mikrobiyal transglutaminaz (MTGaz) enziminin P. pastoris'te alkol dehidrojenaz (ADH) promotoru kontrolünde hücre dışı ekspresyonu yapılmıştır. Bu amaçla, öncelikle pADH2α-proMTGase ekspresyon vektörü oluşturulmuş ve P. pastoris KM71 suşuna transforme edilmiştir. Zeosin antibiyotikli agar plakalarda seçilen transformant Pichia klonları ile çalkalamalı erlenmayer ölçeğinde standart Pichia gelişim koşulları altında (28 °C sıcaklık, pH 6.0) protein ekspresyonu çalışması yapılmış ve protein ürettiği SDS-PAGE ile doğrulanan klon ile çalışmaya devam edilmiştir. Düşük sıcaklığın MTGaz proteininin üretiminde uygun olduğu daha önce ekibimiz tarafından yapılan çalışmada belirlenmiştir. Bu yüzden sıcaklık 20°C'de sabit tutularak üç farklı pH (3.0, 5.0 and 7.0) değerinde üretim tekrarlanmıştır. Çalkalamalı erlenmayerde 96 saatlik protein ekspresyonu sonucunda en iyi üretim pH 7.0 değerinde elde edilmiş ve ulaşılan protein miktarı 396 ng/mL olarak hesaplanmıştır. Enzim aktivitesi ise pH 7.0 için 10200 U/mL olarak belirlenmiştir. Bu tez çalışması kapsamında Streptomyces mobaraensis MTGaz enzimi ilk kez P. pastoris'te ADH promotoru kontrolünde rekombinant olarak üretilmiştir. MTGaz enziminin üretiminde ADH promotorunun uygun bir promotor olduğu yapılan çalışma ile gösterilmiştir.