Antisens RNA kullanarak vankomisin hassasiyetinin restorasyonu ve vankomisin dirençli Enterokok ile enfekte farelerde etkinliğinin araştırılması

Amaç: vanA/vanB genlerini hedefleyen plazmid-kodlu antisens RNA (asRNA) yaklaşımları kullanarak vankomisin-dirençli Enterococcus suşlarında duyarlılığı geri kazandırmak ve deneysel fare modeliyle in vivo etkinliğini incelenmesi amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: vanA ve vanB genleri sırasıyla klinik E. faecium VRE50 ve E. faecalis V583'ten PCR ile çoğaltılmıştır, ardından restriksiyon enzim bölgeleri vasıtasıyla antisens RNA'lar üretmek için pUC19 plazmidine ters klonlanmıştır. Ters yönlendirilmiş genlere sahip bu oluşturulmuş plazmidler E. coli DH10B'ye transforme edilmiştir. Daha sonra, vanA ve vanB için asRNA'lar izole edilmiş ve vankomisin duyarlılığını geri kazandırma yetenekleri vankomisin varlığında in vitro test edilmiştir. Vankomisin MİK'i asRNA ile veya asRNA olmadan yapılmıştır ve 24 saatlik OD595 ölçümleri büyüme eğrileri oluşturmak için alınmıştır. İn vivo analiz için, lipozom kapsüllenmiş ve serbest asRNA'lar vankomisin ile VRE ile enfekte CD-1 farelerine intraperitoneal olarak uygulanmış ve tedavi sonuçları periton sıvısındaki bakteri yüklerini hesaplamak için CFU ölçülerek değerlendirilmiştir. Ek olarak, farelerin fare sepsis skorları günlük olarak kaydedilmiştir ve belirlenmiştir. Bulgular in vitro sonuçlara göre antibiyotik duyarlılık testleri, klinik VRE50 suşunda vanA-antisens RNA'yı ifade eden füzyon plazmidi aracılığıyla, vahşi tip suşta >256 µg/mL olan vankomisin MIC değerinin 32 µg/mL'ye düştüğünü gösterirken; vanB-antisens RNA ile E. faecalis V583'ün 64 µg/mL olan vankomisin MIC değeri 16 µg/mL'ye düşmüştür. Büyüme kinetiği analizleri, antisens RNA'yı ifade eden VRE suşlarında gecikme fazının uzadığını ve büyüme hızının azaldığını ortaya koyarak, direnç gen ekspresyonunun fonksiyonel olarak baskılandığını desteklemiştir. Fare sepsis modelinde intraperitonal antisens RNA ve vankomisin kombinasyonu ile tedavi edilen farelerde peritoneal sıvıdaki bakteri yükü anlamlı derecede azalmış ve klinik skorlar kontrol gruplarına kıyasla iyileşmiştir. Liposom formülasyonları in vivo uygulama için test edilmesine rağmen, muhtemelen yetersiz alım ya da gecikmeli salım nedeniyle terapötik etkinlikleri sınırlı kalmıştır. Birlikte değerlendirildiğinde, bu bulgular antisens RNA konstrüksiyonlarının hem in vitro hem de in vivo ortamda van gen fonksiyonunu etkin bir şekilde baskılayarak antibiyotik duyarlılığını geri kazandırdığını ve enfeksiyon şiddetini azalttığını göstermektedir. Sonuç: Bu çalışma, vanA ve vanB genlerini hedefleyen plazmid kaynaklı antisens RNA'ların hem in vitro hem de in vivo ortamlarda vankomisin dirençli Enterococcus suşlarını yeniden antibiyotiğe duyarlı hale getirebildiğini göstermektedir. Genom düzenleme gerektirmeyen, geri dönüşümlü ve özgül bir baskılama mekanizması sunan antisens RNA teknolojisi, antimikrobiyal dirençle mücadelede yeni ve umut verici bir yaklaşım olarak öne çıkmaktadır. Bu strateji, sadece VRE'ye karşı değil, çoklu ilaca dirençli diğer patojenlerdeki direnç genlerine karşı da potansiyel uygulama alanlarına sahiptir.