Site-directed mutagenesis of highly conserved residues in Helix IX of subunit I of cytochrome cbb3 oxidase from Rhodobacter capsulatus

Oksijen redüktazlar; mitokondri, birçok aerobik bakteri ve arke'lerin solunum zincirinin son halkasını oluşturmaktadır. Yönlendirilmiş mutagenez deneyleri ve aa3-tipi oksijen redüktazların kristal yapıları oksijen redüktazların D- ve K- kanalı olarak adlandırılan iki proton transfer kanalına sahip olduğunu göstermektedir. Aspartik asit 361 (D361), glutamat 380 (E380) ve lizin 387 (K387) aa3 ve ba3-tipi oksijen redüktazların I. alt ünitelerinde (numaralandırma R. capsulatus' a göre) oldukça korunmuş olarak bulunan amino asitlerdir. 380 glutamat bölgesindeki mutasyonlarının oksijenin indirgenmesi reaksiyonu ve proton alınımını durdurması, bu rezidünün aa3 tip oksidazların katalitik mekanizmasında önemli rol oynadığını göstermektedir. D361 and K387 amino asitlerinin de özellikle aa3 tip oksidazlarda oldukça korunmuş olduğu ve enzim aktivitesi üzerinde önemli roller oynadığı düşünülmektedir.Bunun dışında oksijen redüktaz'ların redoks merkezinin spektroskopik ve termodinamik özellikleri, bu üç rezidünün birçok enzimlerde de görülen histidine/glutamat/aspartat yapısal motifi için önemli olduğunu ortaya koymaktadır. Ancak katalitik alt ünitelerin amino asit dizi analizleri bu rezidülerin cbb3-tipi oksijen redüktazların VIII. heliks'inde korunmadığını göstermektedir. Bununla beraber, homoloji modellemeleri cbb3-tipi oksijen redüktazların I. alt ünitesinin IX. heliks'inde tamamen korunmuş olan D361, E380 ve K387' nin bu fonksiyonu yerine getirdiğini düşündürmektedir.Bu çalışmada ayrıca proton pompalama kanalının moleküler mekanizmasını anlamak için, R.capsulatus'tan elde edilen cbb3-tipi oksijen redüktaz'ın I. alt ünitesindeki IX. heliks'te yer alan korunmuş olan aspartik asit, glutamat ve lizin amino asitleri yönlendirilmiş mutagenez tekniği kullanılarak sırasıyla asparjin (N), glutamin (Q) ve metiyonin (M)' e dönüştürülmüştür. Mutasyonun enzim aktivitesi üzerindeki etkisi NADİ boyama ile tayin edilmiş ve E380Q mutantının tamamıyla inaktifken, D361N ve K387M mutantlarının yaban tip enzim aktiviteye sahip oldukları bulunmuştur. Sonuçlar cbb3-tipi oksijen redüktazların aa3-tipi oksijen redüktazlardaki D-kanalına benzer bir proton iletim kanalına sahip olduğu önerisini desteklemektedir.