Santral sinir sistemi infeksiyonu etkeni olan enterovirüslerin saptanmasında hücre kültürü yöntemi ve rt-pcr yöntemlerinin karşılaştırılması

Santral sinir sistemi (SSS) infeksiyonları; menenjit, ensefalit ve ensefalomiyelitten beyin apselerine kadar geniş bir klinik dağılım gösterir. Hızlı ilerleme potansiyeli, kalıcı nörolojik hasar olasılığı ve ölüme yol açabilmesi nedeniyle çoğu infeksiyonda acil tanı ve tedavi yaklaşımı gerekmektedir. Aseptik menenjit, inflamatuvar bir beyin zarı hastalığı olup, birçok etkenle gelişebilmektedir. Aseptik menenjitin en sık saptanan etkeni viruslardir ve %80-95'inden enterovirüslar (EV) sorumludur. Viral ensefalitlerin yaklasık %10-20'si de enterovirüs kaynaklıdır. Enterovirüs infeksiyonlarını saptamada hücre kültürü, serolojik testler ve nükleik asit amplifikasyon testleri (NAT) kullanılmaktadır. Enterovirüs infeksiyonu tanısında hücre kültürü standart yöntemdir ancak NAT tanıda daha yaygın olarak kullanılmaktadır. Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi (ADÜTF) Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Laboratuvarında santral sinir sistemi infeksiyonu etkeni virusların saptanmasında mültipleks Real-Time PCR yöntemi kullanılmaktadır. İlgili örneklerin laboratuarımızda rutinde Real-Time PCR yöntemi yanısıra hücre kültürü yöntemi ile de çalışılmasının enterovirüs yakalama oranını arttırabileceği ve olası yanlış pozitif ve yanlış negatif sonuçların yorumlanmasına katkı sağlayabileceği düşünülmektedir. Bu çalışmaya, ADÜTF hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarlarına viral SSS enfeksiyonu şüphesi olan hastalardan, Real-Time PCR testi istemiyle, 01.11.2018 ile 01.11.2019 tarihleri arasında, klinik açısından viral SSS infeksiyonu şüphesi olan hastalardan, nükleik asit testi ile viral menenjit paneli çalışılması için gönderilen, 20 adet BOS örneği çalışmaya dahil edilmiştir. Ayrıca Enterovirüs üremesi olan hücre kültür hattı süpernatantından 20 adet, 2 katlı, seri dilüsyon hazırlanmıştır. Farklı miktarlarda enterovirüs içeren dilüsyonların herbiri iki alikota ayrılmıştır ve hem hücre kültürü yöntemiyle hem de Real-Time PCR yöntemiyle, eş zamanlı çalışılmıştır. Hücre kültürü çalışması, "shell vial" yöntemi ile Vero (African green monkey kidney-fibroblastbenzeri hücre; Refik Saydam Hıfzıssıhha, Ankara), HEp-2 (Human laringeal carsinoma-epitelyal hücre; Japonya Hücre Bankası) ve RD (Human rabdomyosarkoma-kas hücresi;DSMZ, Almanya) hücre hatları kullanılarak yapılmıştır. Bu çalışmada menenjit şüpheli hastalara ait 20 adet BOS örneği arasından, altı örnekte (%30) real-time PZR ile EV RNA saptanmıştır ve bir örnekte (%5) hücre kültürü ile enterovirüs üremesi saptanmıştır. Hücre kültürü yönteminde doğru sonuç için örnekte bulunan virüsün canlı olması gerekmektedir. Bu çalışmada yöntemler arası saptama oranı farklılığının hücre kültürü çalışmasının saklanmış örneklerde yapılması ve saklama sırasında da virüsün canlılığını kaybetmesine bağlı olabileceği düşünülmüştür. Örnek miktarının az olması nedeniyle test tekrarına gidilememiştir. Hücre kültüründe EV üreyen BOS örneğininin süpernatantından MEM sıvısında hazırlanan 2 katlı dilüsyon örneklerinde (20 adet dilüsyon 1/2 - 1/4 - 1/8…) ise 20 dilüsyon örneğinin 17(%85)'sinde, hücre kültüründe EV üremesi saptanmıştır ve 15(%75)'inde ise real-time PZR testi ile EV RNA saptanmıştır. Bu çalışmada hücre kültüründe üreme olan vialin süpernatantından dilüsyonla hazırlanan, EV içeren örnekler işlemlendiğinde hücre kültüründe NAT'a göre daha yüksek oranda (%85/%75) EV pozitiflği sapanmıştır. Dilüsyonlu örneklerin, bekletilmeden ekilmesi nedeniyle virüs canlılığını yitirmeden viallere inoküle edilebilmiştir. Bu durum hücre kültürü yönteminde örneğin transferi ve saklama koşullarının etken izolasyon oranını büyük oranda etkilediğini göstermiştir. Rutin tanıda kullanılan NAT'ların validasyon kriterleri ve saptayabildikleri EV tipleri yönünden özenle seçilmesinin önemi vurgulanmalıdır. Hücre kültürü yöntemi zaman alıcı ve fazla miktarda örnek inokülasyonu gerektirmesi gibi nedenlerle rutin uygulama açısından pratik değildir ancak rutin tanı laboratuvarlarında NAT negatif çıkan BOS örneklerinde, shell vial yöntemiyle hücre kültürü yapılarak tanının desteklenmesinin, tanı duyarlılığını arttırmada önemli olduğu düşünülmüştür. Anahtar kelimeler: Enterovirüs, Hücre kültürü, Real-Time PCR