Şeker otunda (Stevia rebaudiana Bertoni) anter kültürü yoluyla haploid embriyo uyartımı ve bitki rejenerasyonu

Stevia rebaudiana'nın yapraklarından elde edilen doğal bir tatlandırıcı olan Stevia, sıfır kalorili, tatlılığı ve sağlığa faydaları nedeniyle popülerlik kazanmıştır. Anter kültürü yoluyla haploid üretimi, Stevia rebaudiana'da genetik iyileştirmeyi artırmak ve ıslah programlarını hızlandırmak için umut verici bir tekniktir. Bu çalışmada, T1 ila T7 olarak etiketlenen yedi farklı ortam formülasyonunun etkileri, her biri belirli bileşimlere sahip olarak incelenmiştir: T1 (MS), T2 (MS+0.5 mg l-1 NAA + 0.5 mg l-1 BAP), T3 (MS+1.0 mg l-1 NAA + 0.5 mg l-1 BAP), T4 (MS+2.0 mg l-1 NAA + 0.5 mg l-1 BAP), T5 (MS+0.5 mg l-1 NAA + 0.5 mg l-1 Kin), T6 (MS+1.0 mg l-1 NAA + 0.5 mg l-1 Kin), and T7 (MS+2.0 mg l-1 NAA + 0.5 mg l-1 Kin). Ek olarak, Levent 93, Turgut 82 ve Tütüncü gibi üç stevia çeşidi, embriyogenik kallus, embriyo üretimi ve anter kültürü yoluyla bitki rejenerasyonu üzerindeki etkilerini belirlemek için araştırılmış ve her deneme üç kez gerçekleştirilmiştir. Daha sonra, M1 (MS), M2 (MS + 0.25 mg l-1 BAP), M3 (MS + 0.5 mg l-1 BAP) ve M4 (MS + 1.0 mg l-1 BAP) olarak belirlenen dört ortamda sürgün çoğalması gerçekleştirilmiştir. Sürgün üretiminin ardından, sürgünler üç farklı ortamda köklendirilmiştir (1/2 MS, 1/2 MS+1 mg l-1 NAA ve 1/2 MS+1 mg l-1 IBA). Son olarak, üretilen bitkiler aklimatize edilmiş ve ploidi seviyeleri kloroplast sayısı, stoma sayısı, stoma boyutu ve kromozom sayısı ile belirlenmiştir. Anterler, yeşilimsi bir renk, kırılganlık ve çok sayıda mikrospor içeren iki lob ile karakterize edilen tek çekirdekli aşamada kültüre alınmıştır. Filamentler kültürden önce tamamen uzaklaştırılmıştır. Kültüre alındıktan sonra, anterler on gün boyunca karanlıkta tutulmuştur. Bu sürenin ardından, (T1) MS içerenler hariç, ortamların çoğunda embriyogenik kalli başlatmışlardır. Anter duvarı yarılmış, mikrosporların embriyogenik kalli ve embriyo oluşumunu başlatmasına izin vermiş ve bazı durumlarda doğrudan bitkiciklere dönüşmüştür. Elde edilen sonuç ve gözlemlere göre, tüm çeşitler ve ortamlar iyi tepki göstermiştir. Ancak, aralarında önemli farklılıklar bulunmaktadır. İlk denemede, ortalama kallus oranı, ortalama embriyo sayısı ve kallus başına ortalama embriyo yüzdesi Levent 93'te diğer çeşitlere kıyasla daha yüksek olmuştur. Uygulamalarla ilgili olarak, ortalama kallus oranı T4'te daha yüksekken, bunu T2, T3 ve T5 takip etmiştir. Embriyo üretim sayısı ve oranı T4, T7, T5 ve T2 ortamlarında daha yüksek görülmüştür. İnteraksiyon sonuçları, Levent 93'ün T4'te en yüksek ortalama kallus üretimi, ortalama embriyo sayısı ve yüzdesi sahip olduğunu göstermiştir. Aynı uygulamada, Tütüncü ve ardından Turgut 82 en yüksek kallus üretimini göstermiştir. İkinci denemede, ortalama kallus oranı, kallus başına ortalama embriyo sayısı ve yüzdesi Levent 93 ve Turgut 82'de Tütüncü'ye kıyasla daha yüksek olmuştur. Benzer şekilde, T4 kallus üretimi, embriyo sayısı ve yüzde açısından daha iyi bir tepki göstermiştir. T4 ortam, embriyo sayısı ve yüzdesi açısından T7 ile önemli bir fark göstermemiştir. Turgut 82 ortalama kallus üretimi, embriyo sayısı ve yüzdesi için T4'te iyi sonuçlar göstermiştir. Onu aynı ortamda Levent 93 ortalama kallus üretimi için takip etmiştir. Ancak, T4 ortamındaki Turgut 82 ile T7, T6 ve T4 ortamlarındaki Levent 93 arasında embriyo sayısı ve yüzdesi açısından önemli bir fark bulunmamıştır. Üçüncü denemede, ortalama kallus üretimi Levent 93 ve Turgut 82'de Tütüncü'ye kıyasla daha yüksek olmuştur. Bununla birlikte, embriyo sayısı ve yüzdesi tüm çeşitler arasında önemli farklılıklar göstermemiştir. Ortalama kallus üretiminde, T4, T2'ye benzer şekilde olumlu bir yanıt göstermiş ve bunu T3 izlemiştir. Ancak üçüncü denemede, embriyo üretim sayıları ve oranlarında önemli bir fark görülmemiş, T4, T2, T5, T6 ve T7 benzer sonuçlar göstermiştir. Turgut 82, T4 ve T2'de Turgut 82, T2'de Tütüncü ve T6'da Levent 93 ile karşılaştırıldığında T3'te daha yüksek ortalama kallus üretimi sergilemiştir. Ortamlar ve çeşitler arasındaki etkileşime bağlı olarak embriyo üretim sayıları ve oranlarında önemli bir farklılık görülmemiştir. Çeşitler arasında sürgün çoğalmasında önemli bir farklılık gözlenmemiştir. Bununla birlikte, M3 ortamı tüm çeşitlerde diğer ortamlara kıyasla önemli ölçüde daha yüksek sürgün üretmiştir. Sürgünler 1/2 MS ortamlarda başarılı bir şekilde köklenmiştir. Ancak, diğer ortamlarda sürgünlerin köklenmesi daha düşük olmuştur. MS ortamının yarısı doğrudan kökten sürgün üretirken, hormon içeren MS ortamı önce kallus ve daha sonra çoklu kök üretmiştir. Aklimatizasyon 20 gün içinde gerçekleşmiştir. Stoma analizi, in vitro anter kültüründen elde edilen bitkiler ile kontrol arasındaki farklılıkları ortaya koymuş ve anterden elde edilen bitkiler arasında haploid ve diğer ploidi seviyelerinin varlığını göstermiştir. Özet olarak, bu çalışmada Stevia rebaudiana'da haploid bitki elde etmek için anter kültürünün potansiyeli araştırılmıştır. Yedi ortam formülasyonunun ve üç çeşidin değerlendirilmesiyle kallus üretimi, embriyo oluşumu ve kök gelişiminde önemli farklılıklar gözlenmiştir. T4, birden fazla parametrede üstün sonuçları teşvik etmede özellikle etkili olarak ortaya çıkmıştır. Başarılı iklimlendirme ve ploidi değerlendirmesi, bu biyoteknolojik yaklaşımın stevia yetiştiriciliğindeki pratik uygulamalarının altını çizmektedir. Bu çalışma, stevia üretimini daha da ilerletmek için ortam formülasyonlarını optimize etmeyi ve genetik stabiliteyi sağlamak amacıyla gerçekleştirilecek olan gelecekteki araştırmalar için kaynak potansiyeli taşımaktadır.