Osteosarkoma karşı aptamerlerin hücre-selex yöntemi ile seçimi ve sınanması

Osteosarkom, en sık görülen malign mezenkimal kök hücrelerden, endokondral ossifikasyon yoluyla gelişen kemik tümörü olarak bilinir. Bu tür agresif pediatrik kemik kanserinin erken teşhisi dolayısıyla erken tedavisi, hastanın sağ kalma yüzdesini arttırmaktadır. Bunun için antikor üretiminden daha ucuz ve stabil bir alternatif ürün olarak aptamerler sunulmuştur. Kısa nükleotid dizilerinin sentetik olarak tasarlanabilmesi ve ilgili hücre reseptörünü hedef alarak teşhis veya teröpatik etki gibi farklı amaçlar için kullanılabilmesi gibi özellikleri, bir çok araştırmacının ilgisini çekmektedir. Aptamerler, küçük organik moleküllerden proteinlere kadar çeşitli hedeflere bağlanabilen, tek zincirli DNA veya RNA oligonükleotidleridir. Tek zincirli oligonükleotid kütüphaneleri teorik olarak çeşitli tipte hedef moleküller ile kombine edilebilen üç boyutlu yapıları oluşturabilirler. Aptamerler, eğer hedef bilinirse SELEX (Ligandların Üstel Zenginleştirme ile Sistematik Evrimi) veya hedef bilinmiyorsa Hücre-SELEX ile seçilebilir. Hücre-SELEX, tüm hücreleri hedef olarak kullanarak aptamer seçimine olanak sağlar. Aptamerlerin avantajları arasında tekrar edilebilir denatürasyon ve renatürasyonu, döngüleri boyunca hedefe tutulan aptamerlerin kimyasal modifikasyonlarının kolay sentezi ve korunması bulunmaktadır. Bu tez çalışmasında, 80-100 nt aptamer (ssDNA) kütüphanesi tasarlanmış, karşı-seçim için osteoblast hücreleri (normal kontrol hücreleri) kullanılarak osteosarkoma hücrelerini (MG-63) özel olarak tanıyan, yüksek selektivite ve duyarlılığa sahip aptamerler, hücre-SELEX yöntemi ile seçilmiştir. Çalışmada ayrıca, aptamerlerin çoğalması için vektör sisteminin tasarlanması, potansiyel aptamerlerin sekans ve homoloji analizinin ardından, akış sitometrisi ve konfokal mikroskopi analizleri de gerçekleştirilmiştir. Hücre-SELEX metodolojisi ile, onuncu zenginleştirme basamağı sonrasında, MG-63'e karşı aptamer'i başarıyla ve ilk kez üretmiş bulunuyoruz. Otuz altı potansiyel diziden 14 tanesi tam boyda olup, bunlardan 3'ü akış sitometrisi ile analiz edilmiştir, ve ileri analizler için içlerinden biri seçilmiştir. Seçilen aptamer, osteoblast ve diğer kanser hücrelerine kıyasla MG-63'e karşı nM (Kd=11.9±0.9 nM) düzeyinde özgüllük göstermektedir. Konfokal mikroskop analizinde, aptamerin 37C'de hücre içine girdiği, 4C'de ise hücre membranında biriktiği tespit edilmiştir. Aptamerin bu ikili özelliği, 37C'de tedavi için (ilgili herhangi bir reseptör veya kanser proliferasyonunu engellediği bulunursa) ve 4C'de teşhis için (örneğin, floresan bir molekül takılırsa) kullanılabileceğini göstermektedir. Genel olarak, burada seçilen ve osteosarkoma karşı karakterize edilen aptamer, osteosarkoma teşhis ve tedavisi için yüksek seçiciliği ve duyarlılığı göz önüne alındığında, güçlü ve değerli bir araçtır.