Mechanistic dissection of the centriole duplication and ciliogenesis proximity interaction maps

Sentrozom hayvan hücrelerinde hücre kutuplaşmasından hücre bölünmesine, çeşitli hücresel süreçlere katılan ana mikrotübül organize merkezidir. Sentrozomun merkezi sentrozomla ilişkili perisentriyolar materyali bağlayan mikrotübül tabanlı iki silindrik yapı olan sentriyollerden oluşmuştur. Önemli şekilde, sentriyoller flagellum ve sil organellerinin, gelişimsel olarak önemli sinyal yolaklarında rol oynayan bir duyu organeli olan primer sil de dahil olmak üzere, oluşumunda bazal yapılar olarak rol oynarlar. Sentrozom ve sil yapılarının çalışmalarının bozulması kanser ve siliyopatiler dahil olmak üzere birçok çeşitli insan hastalığıyla ilişkilidir. Bu hastalıklara karşı yeni tanı ve tedavi yaklaşımları geliştirmek için, sentrozom/sil kompleksinin biyogenezi ve çalışmasını düzenleyen mekanizmaları aydınlatmak gereklidir. Bunun için de sentrozomu meydana getiren parçaların ve bu parçalar arasındaki etkileşimlerin tespiti gereklidir. Bu tezde, sentrozom ve sil biyogenezinde rol oynadığı bilinen proteinlere yakın proteinler olarak belirlediğimiz iki yeni sentrozom proteini olan CEP103'ün ve CCDC66'nın fonksiyonel karakterizasyonuna odaklandık. CEP103'ün birden fazla sil oluşturan epitel hücrelerinin farklılaşması sürecinde anlatımı artmaktadır ve sıfırdan sentriyol üretiminde rol oynayan sentriyol duplikasyon proteini CCDC67'ye proksimite göstermektedir.CEP103'ün sentrozoma ve bazı hücrelerde sentriyolar satellitlere lokalize olduğunu gösteren, laboratuvarımızdaki CEP103 ile ilgili daha önceki keşifleri destekleyen. bilgilere ulaştık. Yüksek çözünürlükte aldığımız mikroskop görüntüleri, CEP103'ün, sentriyol iplik proteinleri ile kısmen ortak lokalizasyonu olan proksimal bir perisentriyolar materyal proteini olduğunu gösterdi. CEP103 mitozda iğ ipliklerine ve mikrotübüllere; telofazda ise mitotik köprüye lokalize olduğu dinamik bir lokalizasyon desenine sahiptir. In vivo ve in vitro deneyler, CEP103'ün mikrotübül ilişkili bir protein olduğunu belirledi. CEP103'ün farklı bölgesini temsil eden mutant parçaların analizi, proteinin karboksil ucunun sentrozom ve microtübül lokalizasyonu için gerekli olduğunu gösterdi. CEP103'ün proksimite bağımlı biyotinlenmesi deneyleri proteinin sentrozom ve sentriyolar satellitlerle olan geniş etkileşim ağını ortaya çıkardı. Lokalizasyon ve bağışıklık çöktürme deneyleri, CEP103'ün öncül sentriyollerin oluşumunda rol oyanyan iki sentriyol duplikasyon proteini olan CCDC67 ve CEP63 ile etkileştiğini gösterdi. Laboratuvarımızdaki deneyler, CCDC66'yı sil oluşumu ve trafiğinde rol oynayan bşr sentrozom,sil ve mikrotübül proteini olarak belirledi. Bu fonksiyonların moleküler mekanizmalarına ışık tutmak amacıyla, BioID çöktürme deneyleri ile belirlediğimiz CCDC66'nın aday etkileşim partnerleri ile yaptığımız bağışıklık çöktürme deneylerinde, CCDC66'nın sil biyogenezi proteinleri olan PCM1 ve CEP290 ile etkileştiğini gösterdik. CCDC66'nın farklı bölgelerini temsil eden parça mutantları ile yaptığımız yapı fonksiyon deneylerinde retina dejenerasyondan sorumlu mutant parçanın PCM1 ile etkileşmediğini keşfettik. Bu sonuç, CCDC66'nın PCM1 ile etkileşiminin retina gelişiminde önemli olduğunu gösterdi. Kısacası, yaptığımız çalışma sentriyol duplikasyonu ve sil oluşumunda düzenleyici rol oynayan yeni proteinler keşfetti ve sentrozom/sil biyogenezinin mekanizmalarını anlamamıza katkıda bulundu.