In vitro bioaccessibility of anthocyanins in black chokeberry (Aronia melanocarpa) added yogurts

Süt ve diğer süt ürünleri tüm dünyada yaygın olarak kullanılmaktadır. Yoğurt ise süt ürünleri arasında tazeleyici tadı ve yararlı etkileri nedeniyle tercih edilen en popüler ürünlerden biridir. Yoğurt, kolay sindirilebilirdir ve yüksek beslenme değeri ve terapötik özelliklere sahiptir. Yoğurdun bireylerin dengeli ve sağlıklı beslenmesinde önemli bir role sahip olduğu birçok düzenleyici kurul ve bilimsel enstitü tarafından kabul edilmiştir. Günden güne artan sayıdaki epidemiyolojik ve klinik kanıtlar yoğurt tüketiminin kilo düzenlemesi ve metabolik risk faktörleri üzerine yararlı şekilde etki edeceğini belirtmektedir. Siyah aronia meyvesi (Aronia melanocarpa), fenolik bileşenler açısından, özellikle de kanser ve kardiyovasküler hastalıklar üzerine yararlı etkisi olduğu bilinen antosiyaninler açısından, zengin bitkisel kaynaklardan birisidir. Aronia meyvesinin hem in vivo hem de invitro çalışmalarda antioksidan, mide koruyucu, karaciğeri koruyucu ve hücre büyümesini engelleyici olması gibi farklı biyolojik aktiviteler göstermiştir. Buna bağlı olarak, meyveli yoğurtlar hem üreticiler hem de tüketiciler tarafından meyveli yoğurtların sağlığa karşı faydalarının normal yoğurtlara göre artmasından dolayı daha fazla ilgi görmeye başlamıştır. Fakat, her ne kadar tüketilen gıdada yüksek miktarda polifenoller bulunsa da, sindirim sonunda üretim prosesine ait faktörler ya da gıda matrisi içerisinde oluşan etkileşimler sonucu sadece küçük bir kısmı absorbe olabilmektedir. Bu çalışmada, siyah Aronia meyvesi ilave edilmiş ev yapımı yoğurtlarda bulunan antosiyaninlerin in vitro simüle edilmiş gastrointestinal sindirimi biyoerişilebilirlik, antioksidan aktivite ve antosiyaninlerin muhtemel gidişatı açısından incelenmiştir. Benzer miktarlarda antosiyanin ilave edilmesi amaçlanarak, pulp (%1) ve parçalanmış bütün meyvelerin (%10) sade yoğurda eklenmesiyle iki çeşit yoğurt hazırlanmıştır. Tam yağlı inek sütü temelli yoğurtlar, pulp ve parçalanmış meyvelerin fermentasyon sonrası sade yoğurda veya fermentasyon öncesi direkt olarak süte eklenmesi ile üretilmiştir. Tüm örnekler çift parallelli hazırlanmıştır. Örneklerin metanolik ekstraktları toplam monomerik antosiyanin içeriği, toplam fenolik bileşik içeriği ve antioksidan aktiviteleri açısından 1 gün ve 8 gün muhafaza edildikten sonra analiz edilmiştir. Bunlara ek olarak, aronia meyve suyu, pulp ve parçalanmış meyve ve aronia eklenmiş yogurtların başlıca antosiyanin profil içerikleri fotodiyot dizisi dedektöre (PDA) bağlı yüksek performans sıvı komatografisi (HPLC) ile analiz edilmiştir. Siyah aronia pulpunun kuru madde miktarı %25,5 ± 0,4 olarak, parçalanmış meyvenin ise %17,1 ± 0,7 olarak bulunmuştur. Ayrıca analiz edilmek üzere hazırlanan tüm yoğurt gruplarının kuru madde mitarının %14,8 ile 15,3 arasında olduğu tespit edilmiştir. En yüksek toplam fenolik bileşik (3242±37,4 mg GAE/100 g kuru madde) ve DPPH metoduyla belirlenen antioksidan kapasitesinin (22,2±0,49 mM TEAC/100g kuru madde) parçalanmış meyvelerde en yüksek olduğu gözlenmiştir. Buna karşın, siyah aronia pulpunun toplam antosiyanin içeriğinin (7564±139 mg cya-3-glu/100 g kuru madde) ve CUPRAC metoduyla ölçülen antioksidan aktivitesinin (42.2±4.23 mM TEAC/100 g kuru madde) meyve suyu ve parçalanmış meyvelere oranla daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Fakat, pulpun antosiyanin içeriğinin diğer örneklerden fazla olmasına rağmen, pulp ve parçalanmış meyvelerin antioksidan aktiviteleri arasında bir fark gözlenmemiştir. Diğer taraftan, ölçülen tüm değerlerin parçalanmış meyve ve pulpa kıyasla siyah aronia meyve suyunda oldukça düşük olduğu tespit edilmiştir. Aronia meyve suyu, pulpu ve parçalanmış meyveleri ile aronia eklenmiş in vitro simüle sindirim işlemi uygulanmamış taze yoğurt ekstraktlarında HPLC analizi ile belirlenen 4 farklı antosiyanin olduğu gözlenmiş ve bunların en yüksek miktarlıdan en düşük miktarlıya siyanidin-3-galaktozid, siyanidin-3-glukozid, siyanidin-3-arabinosid ve siyanidin-3-ksilosid olduğu görülmüştür. Meyve suyu, parçalanmış meyve ve pulp ektraklarının üçünde de siyanidin-galaktozidin baskın antosiyanin olduğu gözlemlenmiş ve sırasıyla örneklerdeki toplam antosiyanin miktarının %70, %60 ve %66 sını oluşturduğu gözlemlenmiştir. Sade yoğurtlar için, ölçülen hiçbir parametrede farklılık görülmemiş olup, tüm yoğurt setlerinin tekrarlanabilir olduğu gözlenmiştir. Tüm yoğurt setlerinde, en yüksek toplam fenol ile toplam antosiyanin içeriği ve antioksidan aktivitesi parçalanmış meyve eklenen örneklerde görülmüştür. Bunun yanısıra, örneklerdeki antosiyanin içeriği artışına bağlı olarak, toplam fenolik bileşen içeriği ve antioksidan aktivitesi özelliklerinde de artış olduğu görülmüştür. Sindirim işlemi uygulanmayan taze yoğurtlarda muhafaza süresinin antosiyanin içeriği üzerinde bir etkisinin bulunmadığı gözlenmiştir (p>0,05). Pulp ve parçalanmış meyve ilaveli yoğurtların her ikisinde de antosiyanin içeriğinin fermentasyon öncesi eklenmiş yoğurtlarda, fermentasyon sonrası eklenenlere kıyasla daha düşük olduğu gözlenmiştir (p<0,001). Buna ek olarak, pulp ya da parçalanmış meyveler fermentasyondan sonra eklense bile, antosiyaninlerin asıl aronia pulp ve meyvelerine oranla parçalanmış meyve ilaveli yoğurtlardan sadece %70'i, pulp ilaveli yoğurtlardansa sadece yaklaşık %20'si ekstrakte edilebilmiştir. Eklenen meyve çeşidinin sindirim uygulanmamış taze yoğurtların toplan fenolik bileşen içeriği üzerinde sade0,05). 2 yollu eklenen meyve çeşidi x fermentasyon çeşidi etkileşiminin ve ana etkiler olan meyve çeşidi ile fermentasyon çeşidinin sindirim uygulanmayan yoğurtların antioksidan kapasitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğu görülmüştür (p<0,001). İki yollu etkileşim terimleri olan meyve çeşidi x muhafaza süresi (p>0,05); fermentasyon çeşidi x muhafaza süresi (p>0,05)'nin ve tek başına muhafaza süresinin (p>0,05) antioksidan aktivite üzerinde önemli bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir. Ağız sindirimi boyunca sade ve pulp eklenmiş yoğurtlarda hiç ya da çok az fenolik bileşen içeriği olduğu gözlenmiştir. Diğer bir taraftan, parçalanmış meyve eklenen yoğurtlarda ağız sindirimi sonunda sade veya pulp eklenmiş yoğurtlara göre çok daha fazla (yaklaşık olarak sindirim uygulanmamış yoğurtların toplam fenolik içeriğinin %83-84'ü kadar) toplam fenolik bileşen içeriği olduğu görülmüştür. Mide ve bağırsak sindiriminden sonra, her üç sade, pulp ilaveli ve parçalanmış meyve ilaveli yoğurt örneğinin de toplam fenol içeriğinin oldukça arttığı, hatta elde edilen değerlerin sindirim uygulanmamaış olan taze yoğurt örneklerine ait toplam fenolik bileşen içeriklerinden daha yüksek olduğu bulunmuşur. Ayrıca, sindirim boyunca parçalanmış meyve eklenen yoğurtlar sade ve pulp eklenmiş yoğurtlara oranla daha yüksek bir antioksidan aktivite göstermişlerdir. Antosiyaninlerin biyoerişilebilirliği bağırsak sindiriminden sonra yüksek derecede düşmüştür. In vitro simüle sindirim sonunda elde edilen geri kazanımlar parçalanmış meyve eklenen yoğurtlarda, sade ve pulp eklenenlere göre daha fazladır. Elde edilen en yüksek geri kazanımlar pulp eklenmiş yoğurtlarda IN örnekleri için %3,5, OUT örnekleri için %32,1 olup parçalanmış meyve eklenen yoğurtlarda ise IN örnekleri için %6,3 ve OUT örnekleri için %34,3 olduğu gözlenmiştir. Elde edilen sonuçlar, antosiyaninlerin asidik koşullarda daha stabil olduğunu göstemiştir. Antioksidan aktivite bakımından CUPRAC ve DPPH metotları karşılaştırıldığında, CUPRAC metoduyla analizlenen örneklerin DPPH ile analizlenenlere göre daha yüksek antioksidan aktivite gösterdiği gözlenmiştir. Parçalanmış meyve eklenen yoğurtların sade ve pulp eklenenlere kıyasla daha yüksek bir DPPH radikal yakalama aktivitesi ve bakır iyonu indirgeme kabiliyeti gösterdiği ve durumun sindirim işlemi boyunca stabil kaldığı gözlenmiştir. Buna karşın, sindirim işlemi sonunda tüm örneklerin diyaliz fraksiyonlarında antioksidan aktivitenin yüksek derecede düştüğü görülmüştür. Sindirim işleminin ağız aşaması harıç diğer basamaklarında örneklerdeki protein hidrolizasyon dereceleri arasında önemli bir fark olmadığı ve bu durumun yoğurt proteinlerinin sindiriminin ilave edilen antosiyaninler tarafından kısıtlanmadığı gözlenmiştir. Hidroliz derecesi analizinin sonucuna göre, örnekler pankreatik sindirime tabi tutlduğunda proteinlerin hidrolizasyon derecesinin arttığı gözlenmiştir. SDS-PAGE analizi sonucuna göre, sığır serum albümini (BSA) ve kazeinler yoğurttaki baskın proteinler olarak bulunmuştur. 66,2 kDa moleküler ağırlığı alanında sığır serum albümini olduğu düşünülen belirgin bir bant oluştuğu gözlenmiştir. Ayrıca, 31 kDa moleküler ağırlığı aralığında kazeinler olduğu tespit edilen göze çarpıcı bantlar oluşmuştur. Ağız sıvısı eklenmiş örneklerde oluşan protein bantlarının sindirim uygulanmamış yoğurtlardaki protein bantları ile aynı görünümde oldukları tespit edilmiştir. Mide sindiriminin sonunda ise, büyük molekül ağırlıklı proteinlerin küçük molekül ağırlıklı proteinler degrade olduğu açık bir şekilde gözlenmiş ve jellerin 6,5 kDa'dan küçük moleküler ağırlıktaki alanında belirlenemeyen yeni bantlar oluştuğu bulunmuştur. Bağırsak sindirimi öncesi (BID-OUT) ve sonrası (PG-OUT) örneklerinin benzer jel desenlerine sahip olduğu gözlenmiştir. Sindirim işelminin bağırsak sindirimi aşamasında pankreatik çözelti eklendiğinde mide fazında oluşan küçük moleküler ağırlıklı proteinler ileri degradasyona uğramış ve küçük moleküler ağırlıklı bölgede daha ince ve açık renkli bantlar oluşmuştur. Ayrıca bağırsak fazında yüksek moleküler ağırlıklı bölgede daha önce mide fazında gözlenmeyen ve diğer çalışmalar tarından sindirim sıvısı proteinleri olarak tanımlanan yeni bantlar belirmiştir. Sonuç olarak, elde edilen jel desenleri proteinlerin sindirimlerinin ağız sindirimden etkilenmediğini ve ağız aşamasından sonra sindirim tamamlanana kadar sürekli bir şekilde degrade olmaya başladıklarını göstermiştir. Yapılan çalışmalar, antosiyaninlerin muhtemel akıbetini (örneğin major yoğurt bileşenleri ile etkileşimi veya sindirim sırasında yeni bileşenlere dönüşmesi) aydınlatmak için sindirim aşamalarından alınan fraksiyonlara destekleyici ilave analizlerin yapılması gerektiğini göstermiştir.