Spinal müsküler atrofi tedavisinde kullanılma potansiyeline sahip ve hücre membranından geçebilen modifiye rekombinant SMN1 proteininin üretilmesi ve saflaştırılması

Amaç: PEP1-SMN1 proteinini modifiye rekombinant şekilde üretip hücre membranından geçişini sağlamak. Fakat bu çalışma kapsamında preklinik ya da klinik çalışma bulunmamaktadır sadece proteinin üretimi ve hücre kültürü ortamında hücre membranından geçme potansiyeli araştırılmıştır. Materyal Metod: Çalışmada temel olarak PEP1 (sinyal peptidi) + SMN1 proteini + 6x histidin yapısında rekombinant protein üretimi yapıldı. Vektörün hazırlanması gen sentezi yollarından birisi ile yapıldı. Oluşturulan vektör DNA sekans analizi ile doğrulandıktan sonra E. coli BL21 suşuna aktarılırak ilgili proteinin bakteride ifade edilmesi sağlandı. Protein üretimi IPTG ile indüklendi ve sonrasında 6XHis işareti kullanılarak ticari bir metal afinite kromotografisi kiti ile saflaştırıldı. Saflaştırılan proteinin miktar tayini Bradford testi ile ve saflık derecesi SDS-PAGE analizi incelendi. Çalışmada İnsan nöron kökenli hücre hatları kullanıldı. (SHSY5Y). Besiyeri olarak nöron hücreleri için uygun olan DMEM ve Ham's F12 ortamı ve %10 ek fetal bovine serum kullanıldı. Farklı miktarlarda hücre kültürüne eklenen proteinin farklı zaman aralıklarında hücre içine girişi 6XHis spesifik antikor kullanılarak Western blotlama analizleri ile gösterildi. Bulgular: Yapılan analizler sonucunda, PEP1-SMN1 rekombinant proteininin hücre membranından geçme potansiyelinin başarılı bir şekilde doğrulandığı gözlemlendi. İndüksiyon sürecinde 0.5 mM IPTG ve 30°C'de 4 saatlik inkübasyonun en uygun şartlar olduğu belirlendi. Western blot analizleri, proteinin teorik ağırlığına yakın bir bant gösterdi. Hücre kültür deneylerinde, proteinin hücre yapışmasını ve membran geçişini destekleyen olumlu sonuçlar elde edildi. Sonuçlar: Bu çalışmada, PEP1-SMN1 rekombinant proteininin hücre membranından geçebilen potansiyel bir terapötik ajan olarak başarılı bir şekilde üretildiği ve saflaştırıldığı gösterilmiştir. Elde edilen sonuçlar, protein indüksiyonu ve saflığı için optimize edilen yöntemlerin etkili olduğunu göstermektedir. Bu bulgular, Spinal Musküler Atrofi tedavisi için gelecekteki preklinik araştırmaların temelini oluşturabilecek nitelikte önemli katkılar sunmaktadır. Anahtar kelimeler: SMN1, IPTG, BL21, SMA, DMEM, FBS, PEP1