Metagenomik yaklaşım kullanılarak yeni enzimlerin elde edilmesi

Mikroorganizmalar birçok biyoteknolojik uygulama için kullanılmakta ve hem bilimsel hem de endüstriyel önemleri sebebiyle birçok araştırmacının ilgi alanına girmektedirler. Geleneksel mikrobiyolojik yöntemlerde mikroorganizmalar yaşadıkları yerlerden izole edilmekte ve kültüre edilerek büyütülmektedirler. 2000'li yıllara kadar mikroorganizmaların kültüre edilmeden karakterize edilemeyeceğine inanılmaktaydı. Fakat yapılan bilimsel gözlemler ile var olan mikroorganizmaların sadece çok küçük bir bölümünün kültüre edilebildiği ortaya çıkarılmıştır. Bu yüzyılın başında, literatüre metagenomiks adıyla yeni bir çalışma alanı girmiştir. Metagenomiks herhangi bir ortamda yaşayan mikroorganizmaların kültüre bağımlı olmadan çalışılması olarak tanımlanmaktadır. Metagenomik çalışmalar fonksiyon veya dizi bazlı yaklaşımlarla gerçekleştirilebilmektedir. Fonksiyon bazlı yaklaşımda, genom kütüphanesine benzer olarak bir metagenomik kütüphane kurulmakta ve bu kütüphane istenilen fenotip bakımından taranmaktadır. Dizi bazlı metagenomikste, ya tüm metagenomun dizi analizi yapılmakta, ya da önceden bilinen dizi bilgisi kullanılarak metagenomda yer alan spesifik bölgeler çoğaltılarak analiz edilmektedir. Ekstremofiller ekstrem koşullarda kararlılıklarını koruyabilen makromolekülleri sebebiyle endüstriyel biyoteknolojide büyük potansiyele sahip mikroorganizma gruplarıdır. Bu makromoleküller içinde yer alan ekstremozimler birçok enzim katalizli reaksiyonlarda ihtiyaç duyulan sert koşullarda aktivitesini ve stabilitesini koruyabilmektedirler. Fakat ekstrem özellikleri sebebiyle ekstremofilik mikroorganizmaları doğal yaşam alanlarından alıp laboratuvar koşullarında büyütmek her zaman mümkün olmamaktadır. İşte bu noktada metagenomiks karşımıza çıkmaktadır. Bu çalışmada metagenomiks yaklaşım ile ekstrem ortamlardan lipolitik enzim eldesi amaçlanmıştır. Bu amaçla hem fonksiyon bazlı hem de dizi bazlı çalışmalar yapılmıştır. Çevresel örnekler asidofilik mikroorganizmaları barındıran Balıkesir, Balya asit maden sahası ve halofilik mikroorganizmaları barındıran Acıgöl, Denizli'den alınmıştır. Önceki çalışmalarda, asit maden sahasından alınan örneklerle metagenomik fosmid kütüphanesi kurulmuş ve iki adet potansiyel koloni (F1 ve F3) elde edilmişti. Bu tez kapsamında, bu potansiyel lipolitik enzimleri tanımlamak amacıyla uygulanabilecek stratejiler sunulmuştur. İlk olarak, F3 fosmidinin alt klonlama kütüphanesi kurulmuştur. F3 fosmidi HindIII ve EcoRI enzimleri ile kesilmiş, pUC19 plazmitine yapıştırılmış ve E. coli DH5α hücrelerine transforme edilmiştir. Elde edilen koloniler lipolitik aktivite bakımından taranmıştır. Bir adet aktif koloni tespit edilmesine rağmen dizi analizi ile olumlu bir sonuç alınamamıştır. İkinci bir strateji olarak başlangıç seviyesinde fonksiyonel analiz yapılmıştır. F1 ve F3 kolonileri 1 litre kültür hacminde büyütülüp hücre lizatları elde edilmiştir. Tribütirin ve agar içeren katı yüzey üzerinde delikler açılarak buralara lizat eklenmiş ve enzim aktivitesine bağlı olarak zon oluşumu gözlenmiştir. Lizatta aktivite varlığı doğrulandıktan sonra proteinler amonyum sülfat çöktürmesi ile fraksiyonlara ayrılmıştır. Substrat olarak para-nitrofenol palmitat kullanılarak her bir fraksiyonun enzimatik aktivitesi ölçülmüştür. F3 örneğinde aktivite gözlenmezken F1 örneğinin %45-%70 doygunlukta amonyum sülfat çöktürmesi sonucu elde edilen fraksiyonunda kontrole göre 1.45 kat fazla aktivite görülmüştür. Bu fraksiyondaki proteinler ultrafiltrasyon tüpleri ile moleküler ağırlıklarına göre ayrılmış, 30-50 ve 50-100 kDa arasındakiler ise iki boyutlu jel elektroforezi ile analiz edilmiştir. F1 ve kontrol örneklerine ait jeller karşılaştırılmış ve farklı olan spotlar kesilerek kütle spektrometresi ile analiz edilmiştir. Yapılan ön denemelerle aktivite tespit edilmesine rağmen, hedeflenen proteinler proteomik yaklaşım ile tespit edilememiştir. Üçüncü bir alternatif olarak, F3 fosmidinin dizi analizi yapılmıştır. Kısmi Sanger dizileme ile klonlanan genin Acidithiobacillus türlerine ait olduğu belirlenmiş ve kütüphanenin asidofilik organizmaları temsil ettiği doğrulanmıştır. Tüm fosmid dizisinin belirlenmesi amacıyla ileri nesil dizi analizi yaptırılmıştır. Elde edilen dizide asidofilik organizmalara ait genler bulunmuş ve içlerinden bir tanesi alfa/beta hidrolaz katlanmasına sahip enzimlerle benzerlik göstermiştir. Daha detaylı analizlerin ileriki çalışmalarla gerçekleştirilmesi planlanmaktadır. Çalışmanın ikinci bölümünde, tuzlu bir göl olan Acıgöl'den alınan çevresel örnekler ile dizi bazlı metagenomiks çalışması yapılmıştır. Sahanın mikrobiyal çeşitliliği daha önceki çalışmalarda belirlenmiştir. Bu çalışma kapsamında bu mikroorganizmalara ait lipolitik enzimlerin nükleotit dizileri veritabanlarından alınmış ve benzerliklerine göre gruplanmıştır. Her bir gruptaki nükleotit dizileri kullanılarak lipolitik enzimlerin korunmuş bölgelerini hedefleyen dejenere primerler oluşturulmuştur. Primer tasarımında CODEHOP stratejisi kullanılarak primer4clades programından faydalanılmıştır. Lipazlar ve lipolitik enzimler, α/β hidrolaz katlanmasına sahip enzimler ve karboksilesterazlar olmak üzere üç grup için toplamda dokuz çift primer tasarlanmıştır. Tüm primer setleri ile PZR çalışmaları yapılmış, α/β hidrolaz katlanmasına sahip proteinler için tasarlanan primerler ile pozitif sonuç alınmıştır. Çoğaltılan gen, pCRTM-4TOPO® vektörüne klonlanmış ve E. coli TOP10 hücrelerine transforme edilmiştir. Dizi analizi sonucunda klonlanan genin beklenildiği gibi 480 baz çifti uzunluğunda olduğu belirlenmiştir. BLAST analizinde dizinin Halolamina sediminis genomuyla %75 benzerlik gösterdiği bulunmuştur. Genin bilinmeyen 5' ve 3' uçlarını belirlemek için "genome walking" uygulanmıştır. Dejenere PZR ile elde edilen dizi bilgisinden yola çıkılarak her bir uç için 2'şer adet gene özgü primer tasarlanmıştır. Metagenomik DNA restriksiyon enzimleri ile kesilmiş ve uçlarına adaptör diziler yapıştırılmıştır. İlgili gene ve adaptöre özgü primerler ile bilinmeyen 5' ve 3' uçlar çoğaltılmış, dizi analizi yapılmış ve tam gen dizisi bulunmuştur. Gen 783 baz çifti uzunluğunda, 260 aminoasitten oluşmaktadır. ATG başlangıç kodonu ile başlayan gen UGA bitiş kodonu ile sonlanmaktadır. Gen dizisi Halolamina sediminis genomunun bir parçasına %75 oranında benzemektedir. Aminoasit dizisi ise Halomonas gudaonensis organizmasının esterazına %91 oranında benzemektedir. Bu sonuçla çevresel bir örnekten yeni bir enzimin başarıyla klonlandığı sonucu ortaya çıkmaktadır. Proteinin moleküler ağırlığı ve izoelektrik noktası ExPASy programı ile hesaplanmış ve sırasıyla 28368 Da ve 5,27 olarak bulunmuştur. Ekspresyon çalışması için genin 5' ve 3' uçlarını hedefleyen ve içlerinde EcoRI ve HindIII kesim bölgelerini içeren primerler tasarlanmıştır. Metagenomik DNA'nın kalıp olarak kullanıldığı PZR ile çoğaltılan gen, pET-28a(+) ekspresyon vektörüne klonlanmştır. Oluşturulan plazmit E. coli C43 (DE3) ekspresyon hücresine aktarılmıştır. Ekspresyonu optimize etmek için 0,1, 0,5 ve 1 mM IPTG konsantrasyonları denenmiştir. Ayrıca indükleme işlemi 25ºC'de 16 saat, 30ºC'de 6 saat ve 37ºC'de 3 saat boyunca yapılmış ve en iyi sonucun 0,1 mM IPTG konsanstrasyonunda, 30ºC'de 6 saatte elde edildiği gözlenmiştir. Gen başarıyla ifade edildikten sonra His-tag yöntemi ile saflaştırma çalışmaları başlatılmıştır. SDS-PAGE analizi ile saflaştırmanın başarılı bir şekilde gerçekleştiği belirlenmiş ve enzimin molekül ağırlığının (28,2 kDa) teorik değeri (28,4 kDa) ile uyumlu olduğu gözlenmiştir. Proteinin halofilik bir organizmadan geliyor olmasına bağlı olarak %10 NaCl varlığında daha kararlı olduğu belirlenmiştir. Enzimin aktivitesi substrat olarak para-nitrofenol esterleri kullanılarak ölçülmüştür. Kinetik deney, enzimin ester bağını hidroliz etmesi sonucu açığa çıkan para-nitrofenolün (pNP) 410 nm'de absorbansının ölçülmesine dayanmaktadır. Spektrofotometik ölçüm için reaksiyon koşullarında ışık yolu ve pNP'nin ekstinksiyon katsayısı aktivite ölçümlerinden önce hesaplanmştır. Enzimin substrat özgüllüğünü belirlemek için pNP-butirat, pNP-hekzanoat, pNP-oktanoat, pNP-dekanoat, pNP-dodekanoat ve pNP-hekzadekanoat substratları kullanılmıştır. Enzim maksimum aktiviteyi pNP-hekzanoat substratına karşı göstermiştir (kcat = 12.30 s-1). Enzimin pNP-butirat (6.03 s-1) ve pNP-oktanoata (6.26 s-1) karşı da yüksek aktivitesinin olduğu gözlenmiştir. Enzimin kısa karbon zincirli substratları tercih etmesi sebebiyle esteraz enzimi olduğu belirlenmiştir. Enzimin çalıştığı optimum pH değerinin 9 olduğu ve pH 8 ile 10 arasında 24 saat inkübe edildiğinde aktivitesini koruduğu gözlenmiştir. Enzimin pH 6 ve daha düşük pH değerlerinde çözeltilerde inkübe edildiğinde aktivitesini kaybettiği belirlenmiştir. Enzimin optimum sıcaklığının 30ºC olduğu, fakat 5ºC ve 40ºC sıcaklıkları arasında da maksimum aktivitesinin %50'sinden fazlasını gösterdiği belirlenmiştir. Enzim 55ºC'de 20 dakika inkübasyon sonunda aktivitesinin %96'sını korurken, 60ºC'de inkübe edildikten sonra aktivitesi %27'ye düşmüştür. NaCl konsantrasyonu arttıkça, enzimin aktivitesi düşmüş fakat NaCl (%10-%25) ile inkübasyonun enzimin stabilitesi üzerinde bir etkisi olmamıştır. Enzimin aktivitesi %10 organik çözücü varlığında da ölçülmüştür. DMSO varlığı enzimin aktivitesini etkilemezken, gliserol aktivitede hafif bir yükselişe sebep olmuştur. Metanol varlığında ise aktivite maksimum değerinin %80'i olarak ölçülmüştür. Diğer organik çözücüler enzim üzerinde inhibe edici etki göstermiştir. Enzimin %15 ve %30 konsanstrasyonlarında farklı organik çözücüler ile 24 saat boyunca inkübe edildikten sonra kalan aktivitesi ölçülmüştür. Enzim %30 1-propanol ve %30 isopropanol haricinde tüm organik çözücülere karşı stabilitesini korumuştur (>%80). Farklı metal iyonları, deterjanlar ve enzim inhibitörlerinin etkileri de araştırılmıştır. Literatürde rapor edilmiş benzer enzimler ile karşılaştırıldığında enzimin yüksek metal toleransı olduğu bulunmuştur. PMSF'in enzimi inhibe ettiği gözlenmiş ve bu durum enzimin bir serin hidrolaz olduğunu doğrulamıştır. Enzim saklama koşullarında (50 mM Tris-HCl pH 8 + %10 NaCl, 4ºC) aktivitesini 14. güne kadar korumuştur.