NFIb ifadesinin gen hedefleme stratejileriyle baskılanması

Transkripsiyon faktörleri merkezi sinir sisteminin gelişmesinde ve kök hücre fonksiyonunun düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Bu tür bir transkripsiyon faktör ailesi olan Nükleer Faktör I (NFI) proteinleri omurgalılarda dört üyeden oluşur: NFIA, NFIB, NFIC ve NFIX. Üç NFI üyesi: NFIA, NFIB ve NFIX , gelişmekte olan sinir sisteminde ve yetişkin beyninde, örtüşen fakat özgün bir ifade örüntüsü gösterirler ve benzer beyin gelişim sorunlarına yol açarlar. NFI proteinlerinin amino ucunda korunmuş bir DNA-bağlanma bölgesi ve karboksi ucunda CTF-1 transkripsiyon modülasyon bölgesi bulunur. Bu bölgeler aracılığıyla NFI proteinleri kendileriyle ve diğer proteinler ile etkileşebilmektedir. NFI proteinleri yapılarıyla DNA üzerindeki TTGGC(N5)GCCAA dizilerini tanır ve homodimer ya da heterodimer olarak bağlanırlar. NFI proteinlerinin, spesifik promotor ve hücresel ve gelişimsel içeriğe bağlı olarak gen anlatımlarını artırdıkları ya da durdukları gösterilmiştir. Memelilerde, muhtemelen örtüşen işlevlere sahip dört NFI geninin varlığı, bireysel NFI proteinlerinin in vivo hedeflerini ve gelişimde NFI genlerinin rollerinin belirlenmesini zorlaştırmaktadır. Merkezi sinir sisteminde, NFI proteininin varlığı, akson rehberliği,gelişimi, glial ve nöronal hücre farklılaşması, nöronal hücre göçü gibi bir dizi önemli işlemleri kontrolünde önemli role sahiptir. Nükleer Faktör I 'in varlığı, uygun aksonal gelişim ve cerebellar granül nöronlarda, cansız ortamda dendrit oluşumu için gereklidir. Arka beyinde, Nfia ve Nfib, gliogenesisin başlangıcında omurilikte yüksek oranda ifade edilir. Nfia ve Nfib'nin ifade artırımı veya baskılanması, civciv embriyosunda, her ikisinin de omuriliğin gelişimi için gerekli olduğunu göstermiştir. Arka beyinin başka yerlerinde Nfib serebellar granül nöronların göçünü ve uç farklılaşmasını düzenlemektedir. Önbeyinde Nfib proliferatif bölgede ve subcerebral ve kortikotalamik projeksiyon nöronlarında ifade edilir ve nöronal progenitör bakımını ve farklılaşmasını düzenler. Bu nedenle, NFI proteinleri ve NFIB özellikle, nöral gelişimin önemli düzenleyicileridir ve işlevleri geniş çapta çalışılmıştır; fakat fareler ve civcivlerde yapılan fonksiyonel deneylera rağmen işlevleri henüz tam olarak açıklanmamıştır. Bununla birlikte, bu genlerin bireysel işlevleri henüz keşfedilememiştir. Fonksiyon çalışmalarının belirlenebilmesi için CRISPR/Cas9 sisteminin yeni bir teknolojidir. 1970'lerde DNA'nın manipülasyonuna izin veren rekombinant DNA teknolojisinin gelişmesiyle beraber, çok büyük ökaryotik genomları hedeflemek için nükleaza dayalı genomik düzenleme teknolojilerinin ilerlemesine ihtiyaç duyulmuştur. Bu teknolojiler genellikle iki çift zincirli kırılma onarım mekanizmasından yararlanır: Homologolmayan uçların birleştirilmesi ve homolojiye yönelik onarım. Homolog olmayan uçların birleştirilmesi, DNA'nın parçalandığı bölgede, kırık DNA molekülünün ligasyonu sırasında kısa baz çiftlerinin yerleştirilmesinea veya silinmesine yol açabilen hatalara sebep olabilir. Homolojiye yönelik onarım, hedeflenen DNA'yı spesifik olarak eklemek veya değiştirmek için kullanılabilir. Tunç Parmak ve TALE (Transcription activator-like effector) proteinleri, DNA üzerinde spesifik dizileri tanırlar. Fokl' nükleazı ile birleştirilmesi ile oluşturulan rekombinant nükleazlar (ZFN ve TALEN'ler), spesifik genomik bölgelerin kesilmesi ve DNA'da çift iplik kırıklar oluşturulması için kullanılmaktadır. Bu yaklaşımlar, sınırlandırıcı unsurlara sahiptir: Tunç parmak bölgeleri, daha büyük bir diziye eklendiğinde, DNA bağlama özgünlüğü değişebilmektedir. Benzer şekilde, TALEN'lerin de DNA bağlanma özgünlükleri, modüllerin bir ara gelmesiyle değiştirebilmekte ve yeni rekombinant TALEN proteinlerinin oluşturulması masraflı ve karmaşıktır. Bu yöntemlere alternatif, güncel genom düzenleme teknolojilerinden en hızlı gelişen, mikrobial adaptif bağışıklık sistemi olan CRISPR/Cas9 sistemidir. CRISPR/Cas9 sistemlerinde, Cas9 enzimi hedef bölgedeki çift iplik kopmalarını oluşturur. Kısa bir kılavuz RNA (gRNA), genomdaki hemen her bölgeyi hedefleyebilir. CRISPR sistemi Cas9 nükleazı ve klavuz RNA'yı ve trans aktive edici RNA'yı ifade eden crRNA'dan oluşur. Trans aktive edici RNA, crRNA'nın farklı diziler şeklinde ifade edilmesine yardımcı olur. Her crRNA birimi, 20 nükleotid rehber sekans ve kısmi doğrudan tekrar dizileri içerir. Rehber sekans dizileri, direkt olarak Cas9 nükleazıyla Watson-Crick baz eşleşmesi olacak şekilde nükleaza rehber olur. Gen düzenleme tekniği için, crRNA ve trans aktive edici RNA birleştirilerek tekli rehber RNA (sgRNA) elde edilir. PAM dizisine birleşik, 20 nükleotidlik rehber RNA sekansı değiştirilerek Cas9 nükleazının hedef bölgesi değiştirilebilir. sgRNA, yapısal olarak iskele görevi görecektir Cas9 nükleazının DNA'ya bağlanması için. sgRNA sekansları, genomda mutasyon yapılmak istenen DNA bölgesine göre modifiye edilebilir. sgRNA genellikle 100 nükleotid uzunluktan oluşmaktadır. 5 'ucundan, 20 nükleotid, Watson-Crick baz eşleştirmesi yoluyla arzu edilen DNA dizilerine bağlanır ve Cas9'u istenen genomik DNA'yı kesmek üzere yönlendirir. 3' ucundaki çift iplikli yapının geri kalanı Cas9 tanıması için önemlidir. sgRNA'lar hücreye RNA şeklinde veya sgRNA ifade vektörü yoluyla verilebilir. Cas9 hedeflemesinin basitliği, bölgeye özel bir nükleaz olarak yüksek verimlilik ve karmaşık modifikasyonların olasılığı, gene düzenleme tekniği olarak CRISPR/Cas9 sisteminin biyolojik uygulamalarda geniş kullanımına olanak tanır. Bununla birlikte, CRISPR uygulamalarında da bazı sınırlamalar vardır. Cas9, hedef DNA'yı tek kılavuz RNA üzerindeki kılavuz sekansı ile tanıyabilir ve kesebilir. Cas9, PAM dizileri gerektirir ve bu gereklilik Cas9 hedeflerini sınırlamaz. Bununla birlikte, Cas9 ayrıca hedef dışı bölgeleri de kesip hedef dışı modifikasyonlar oluşturabilir. Kök hücre biyolojisi ve kanser biyolojisinde gen regülasyonu üzerine NFI proteinlerinin ve özellikle NFIB'nin oynadığı rol belirsizliğini korumaktadır. İnsan hücre hatlarında, fonksiyon çalışmalarının yapılması için, NFIB'yi nakavt etmeyi ve azaltmayı amaçladık. NFIB 2. eksonunu CRISPR/Cas9 sgRNA yapıları tasarlayarak hedefledik, tek bir hücre izolasyonu deneyi ve sgRNA # 1 ve # 2 için tarama yaparak 5 ve 15 klon izole ettik. 5 klondan 3'ünü, 15 klondan 9'unu T7 endonükleaz analiziyle taradık. Bununla birlikte, bu analizde hiçbir mutant tespit edilmemiştir. Ayrıca NFIB'yi hedeflemek içinshRNA yapıları oluşturduk ve bunların NFI aile üyelerini hedefleyen diğer shRNA'larla etkinliklerini karşılaştırdık. Ön deneyler, shNFIB yapılarının bir karışımının, U-87 MG glioblastoma hücrelerinde NFIB transkript seviyelerini % 60 azaltabildiğini göstermektedir. Her iki yaklaşım, insan nöral hücre hatlarında NFI fonksiyonunun daha ileri çalışmaları için kullanılacaktır.