Tetrahymena thermophila'da afinitik takılı insan büyüme hormonu'nun tetrahymena yapay koromozom vektör altyapısı ile rekombinant üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu

Ülkemizin 2023 hedefi, sağlık alanında ilaç üretim altyapısının yetişmiş insan ve şirketleşme ile oluşturulmasıdır. Bu tez kapsamında; alternatif protein üretim konakçısı Tetrahymena thermophila'da insan terapötik proteinlerinden insan büyüme hormonunun (hGH) üretimi, amaçlanmıştır. hGH üretiminin vektörel altyapısında, İyi İmalat Uygulamalarına (İİU) uygun yüksek kopya sayılı dairesel T. thermophila makronükleer yapay kromozom-2 (TtAC2)'nin kullanımı planlanmıştır. TtAC2'nin ısı ile indüklenebilir HSP70.2 ısı şoku promotorunun kontrolü altına kodon uyumlu hGH kodlayıcı DNA dizileri klonlanmıştır. Biyolistik silah ile T. thermophila CU428 ırkına vektörler transforme edilmiştir. GFP-hGH füzyon proteini sitoplazmik üretimi 50 kDa monomer-101 kDA dimer, 6xHis-hGH ve takısız hGH proteinlerinin sitoplazmik üretimi ise 17 kDa-22 kDa monomer ve 34 kDa-44 kDa dimer olarak SDS-PAGE ve Western Blot analizleri ile gösterilmiştir. PLA22/23 sinyal peptid dizisi kullanılarak, endoplazmik retikulum üzerinden hücre dışına yönlendiren 6XHis-hGH ve takısız hGH'ın hücre dışına salgılandığı ELİZA ile tespit edilmiştir. Literatür kapsamında hipotezlenen hücre dışına salgılanan hGH'ın T. thermophila sekretom proteazları tarafından parçalandığı, in vitro proteolitik enzim aktivite testi sonuçları ile kanıtlanmıştır. Bu tez çalışması ile biyoaktivite analizleri için gerekli hGH proteinlerinin üretimi ve saflaştırılmasının vektörel altyapısı oluşturulmuştur. T. thermophila'da hGH üretim miktarının bu organizmanın proteaz genlerinin susturulması ve optimize biyoreaktör üretimiyle arttırılabileceği, sonucuna varılmıştır.