Tetrahymena thermophila glutatyon S-transferaz enzim ailesinden MU alt sınıfı üyelerinden birinin rekombinant olarak üretimi ve enzimatik karakterizasyonu

Sentetik bir ksenobiyotik olan 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) molekülüne maruz bırakılan sucul tek hücreli protist Tetrahymena thermophila'nın Glutatyon S-transferaz (GST) enzimlerinin kimliklendirilmesi, rekombinant üretimi ve enzimatik karakterizasyonu, bu çalışmanın amacını oluşturmaktadır. CDNB ile 9 saat muamele edilen hücrelerin 3- (4,5-dimetiltiyazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) test bulgularında, CDNB'nin LD50 değeri 0.079 mM olarak bulunmuştur. Toksik olmayan CDNB dozları ile muamele edilen hücrelerden glutatyon afinitesiyle saflaştırılmış 22 kDa ve 23 kDa'luk GST proteinlerinin TtGSTm19 ve TtGSTm34 genleri tarafından kodlandıkları, 2D-jel elektroforezi ile MALDI-Tof MS/MS analizi ile ispatlanmıştır. CDNB'nin 0.072 mM doz muamelesi altındaki hücrelerden affinitik saflaştırılmış GST'lerin toplam aktivitesi, zamana bağlı artış gösterirken hücre canlılığı azalmıştır. TtGSTm19 ve TtGSTm34 genlerinin mRNA ekspresyonu, toksik olmayan doz aralığında, kontrol grubuna göre anlamlı oranda artmıştır. TtGSTm34'ün 660 bp cDNA ORF'si, pIGF-1 vektörüne klonlanmış ve T. thermophila'ya elektroporasyon ile transforme edilmiştir. Rekombinant TtGSTm34-8xHis proteininin dual afinite kromatografisi ile saflaştırılması, SDS-PAGE ve Western blot analizi ile teyit edilmiştir. GSH ve CDNB'ye karşı TtGSTm34-8xHis enzim kinetik analizi, optimum pH'sının 7.0 ve optimum sıcaklığının ise 25°C olduğunu, sırasıyla 0.54 mM ile 0.47 mM Km değerleri ile yüksek enzim aktivitesine sahip göstermiştir. T. thermophila'da toksik olmayan CDNB dozlarının detoksifikasyonda TtGSTm34'ün ve TtGStm19'un görev alabileceği sonucuna varılmıştır