Tiyol-metakrilat polimerizasyonu ile affinite monolitlerinin sentezi ve histidin işaretli protein izolasyonunda kullanımı

Proteinlerin saflaştırılması için günümüzde birçok yöntem kullanılmaktadır. Saflaştırma işleminin mümkün olduğu kadar az kademede, yüksek verimlilikle ve kısa sürede gerçekleştirilmesi önemlidir. Bu yüzden izolasyon işlemi ile saflaştırılacak olan proteinin özellikleri (amino asit kalıntısı - histidin, triptofan veya sistein gibi) göz önünde bulundurularak en verimli ve etkili ayırma yöntemini seçmek gerekmektedir. Tez kapsamında immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) kullanılarak, histidin-işaretli proteinlerin seçici ve güvenilir bir şekilde ayrılması için histidin ve geçiş metali iyonları arasındaki metal koordinasyon etkileşimi kullanılmıştır. Histidin grupları iki değerlikli metal iyonu olan Ni2+ ile koordinasyon kompleksi oluşturmaktadır. İç çapı 300 μm olan kapiler kolonda hidrofilik ligand olarak MSA, ana monomer ve çapraz bağlayıcı olarak POSS-MA ve termal başlatıcı olarak AIBN kullanılarak tek basamakta tiyol-metakrilat polimerizasyonu ile monolitik dolgu materyali sentezlenmiştir. NiCl2 çözeltisi kolon içerisinden geçirilerek Ni2+ iyonlarının monolit yüzeyine immobilize olması sağlanmıştır. Ni2+ iyonu immobilize edilmiş MSA-(POSS-MA) kapiler monolitik kolon (IMAC sorbenti) histidin işaretli protein olan yeşil floresan proteinin (green fluorescent protein, GFP), E. coli bakteri lizatından seçici bir şekilde ayrımı için kullanılmıştır. SEM görüntüleri, monolit yüzeyinin kolon iç çeperine başarılı bir şekilde tutunduğunu ve gözenekli yapıda olduğunu göstermiştir. Mikro ve makro gözenek yapıcı ajanların (n-bütanol ve etilen glikol) kullanılması nedeniyle monolit dolgu materyali önemli bir yüzey alanına sahiptir. BET analizi sonucuna göre MSA-(POSS-MA) monolitinin yüzey alanı 143 m2/g, Ni2+-MSA-(POSS-MA) monolitinin yüzey alanı ise 116 m2/g olarak bulunmuştur. Sentezlenen Ni2+-MSA-(POSS-MA) kapiler monolitik kolonda 4 µL/dk akış hızında, 3.5 mg/mL başlangıç protein konsantrasyonunda farklı desorpsiyon koşullarında çalışılarak imidazol konsantrasyondaki değişimin protein izolasyonu üzerinde etkisi incelenmiştir. SDS-PAGE analiz sonuçlarına, göre uygun çalışma koşullarında monolitik kolona 25.55 µg GFP adsorplanmış ve 18.74 µg GFP desorplanmıştır. Monolitik sistemde aynı protein konsantrasyonuna (2.1 mg/mL) sahip lizat ile akış hızı taraması yapılarak akış hızının protein izolasyonuna etkisi incelenmiştir. Akış hızı 2 µL/dk iken adsorpsiyon verimi % 61.9, desorpsiyon verimi % 100 olarak tayin edilmiştir. Başlangıç protein konsantrasyonu değişiminin protein izolasyonuna etkisini belirleyebilmek için sentezlenen standart monolitik kapiler kolonlarda 0.4 µL/dk akış hızında, farklı protein konsantrasyonu içeren lizatlar ile çalışılmıştır. Başlangıç protein konsantrasyonu 1.2 mg/mL iken adsorpsiyon verimi %87.6, desorpsiyon verimi %100, izolasyon verimi ise %89.3'tür. Başlangıç protein konsantrasyonu 2.1 mg/mL iken adsorpsiyon verimi %77.6, desorpsiyon verimi %73.9, izolasyon verimi ise %57.3 olarak tayin edilmiştir. Ni2+ iyonunun protein izolasyonuna etkisini belirleyebilmek için Ni2+ içermeyen ve Ni2+ ve MSA içermeyen kolonlar sentezlenmiştir. Adsorpsiyon verimleri Ni2+ iyonu ve MSA içermeyen kolon için % 9, Ni2+ içermeyen kolon için %45.8 ve Ni2+-MSA-(POSS-MA) kolon için ise %77.6 olarak bulunmuştur. Ni2+ iyonu içermeyen kolonun desorpsiyon verimi %19.8, izolasyon verimi ise %9'dur. Ni2+-MSA-(POSS-MA) kolonun da desorpsiyon verimi %73.9, izolasyon verimi ise %57.3 olarak tayin edilmiştir.