Tomato brown rugose fruit virus kılıf protein geninin Agrobacterıum aracılığıyla domatese aktarılması

Domates kahverengi buruşukluk meyve virüsü (ToBRFV) son yıllarda dünyada ve Türkiye'de domates üretim alanlarında yaygınlaşmıştır. ToBRFV mekanik olarak kolayca bulaşmaktadır ve diğer Tobamovirüslere karşı direnç sağlayan Tm22 dayanıklılığını kırabilmektedir. Ticari çeşitlerde geleneksel ıslah yöntemleri ile ToBRFV'ye karşı bir direnç henüz geliştirilmediği için alternatif direnç yöntemlerinin geliştirilmek araştırılmalıdır. Bu çalışmada, ToBRFV'ye karşı alternatif bir direnç olarak patojen kaynaklı kılıf proteinine dayalı direnç geliştirmek için araştırmalar yapılmıştır. Bu amaçla, ToBRFV-CP geni ilk olarak RT-PCR ile çoğaltılmıştır ve gen kasetini oluşturmak için CaMV 35S promotörü ve terminatör arasında klonlanmıştır. Daha sonra, gen kaseti pCAMBIA0380 ikili vektörünün T-DNA bölgesine klonlanlanarak ve Agrobacterium tumefaciens'e aktarılmıştır. In vitro koşullarda çimlenmiş domates tohumlarından elde edilen yaklaşık 1970 hipokotil ve 1300 kotiledon parçasına Agrobacterium aracılığıyla transformasyon yapılmıştır. BAP ile desteklenmiş besi yerinde transformasyon yapılan eksplantlerden yaklaşık olarak 350 sürgün elde edilmiştir ve hayatta kalan 140 sürgün köklenme ortamına aktarılmıştır. Köklenen sürgünlerin 41 tanesinden elde edilen 22 adet bitki, toprağa adaptasyonu için sıvı MS besi yeri ile desteklenmiş steril toprak içeren cam kavanozlara aktarılmıştır. Toprağa adapte olmuş 9 bitkiden genomik DNA izole edilerek ve ToBRFV-CP genine ve gen kasetine özgü primerler kullanılarak PCR yöntemi ile test edilmiştir. PCR analizi sonucunda her iki primer ile pozitif sonuç veren dört bitkinin genomlarında ToBRFV-CP geni içerdiğini göstermiştir. Daha sonra potansiyel transgenik bitkilerden RNA izolasyonu yapılarak RT-qPCR yöntemleri ToBRFV-CP geninin transgenik bitkilerde ekspresyon analizleri yapılmıştır. Yapılan ekspresyon analizleri sonucunda test edilen dört transgenik ToBRFV-CP geninin ifade edildiği ve iki transgenik bitkide yüksek düzeyde ekspresyon gösterdiği belirlenmiştir.