Fotosentetik hidrojen üretimi için oksijene toleranslı CpI hidrojenazvaryantlarının In Vitro üretim çalışmaları

Hidrojen, karbon içermeyen yapısı ve yüksek enerji yoğunluğu nedeniyle fosil yakıtlar gibi yenilenemeyen enerji kaynaklarına çekici bir alternatiftir. Bununla birlikte, hidrojen üretiminin çoğu, fosil yakıtlardan türetilen hammadde kimyasallarını kullanır, bu da karbondioksit emisyonuna yol açar ve iklim krizine katkıda bulunur. Fotosentetik hidrojen teknolojisi, alternatif, sürdürülebilir ve tamamen karbonsuz bir enerji döngüsü sağlayabilir. Bununla birlikte, oksijen fotosentezin bir yan ürünü olduğundan, hidrojen üretimini katalize eden hidrojenaz enzimlerinin oksijen duyarlılığı, fotosentetik hidrojen üretiminin önündeki en önemli engellerden biridir. Bu nedenle fotosentetik hidrojen üretiminde kullanılacak hidrojenaz enziminin gaz halindeki oksijeni tolere etmesi gerekir. Bu tezde, Clostridium pasteurianum (CpI) hidrojenazında oksijen toleransı için önemli olduğu bilinen dört yer, kanonik olmayan amino asit (ncAA) eklenebilmesi için amber (TAG) durdurma kodonu ile değiştirildi. Hidrojen üretimi açısından karakterize edilen en verimli ve hızlı [Fe-Fe] hidrojenazlardan biri olduğu için CpI seçilmiştir. Enzim üzerinde seçilen noktalara hücresiz protein sentezi (CFPS) kullanılarak ncAA eklenmesi yönünde önemli ilerleme kaydedilmiştir. Sistein ve tirozin analogunun dahil edilmesi için gerekli olan M. Jannaschii türevi altı aminoasil-tRNA sentetazının (aaRS'ler) genleri ilk olarak yüksek kopyalı pY71 vektörüne klonlandı. Bu aaRS'ler daha sonra in vivo olarak üretildi ve genetik olarak kaynaşmış N-terminal 6xHis-etiketlerine sahip oldukları için IMAC ile saflaştırıldı. ncAA yerleştirilmesi için gerekli olan ortogonal tRNACUA şablonu da PCR ile sentezlendi ve saflaştırıldı. Tezin bir sonraki bölümünde, histidin analoglarının katılması için gerekli olan M. barkeri türevi aminoasil tRNA sentetaz, HRS'nin sentezlenmesi için deneyler yapıldı. Enzimin in vivo ve in vitro (CFPS) sentezi için farklı koşullar test edildi. Ancak HRS, çözünmeyen agregatlar oluşturdu ve saflaştırılamadı. Son olarak, M. barkeri'den türetilen ortogonal tRNA şablonu, PCR montajı ile üretildi ve saflaştırıldı. Son bölümde, doğal-tip CpI, anaerobik olarak in vivo olarak üretildi ve olgunlaştırıldı, ardından StrepTactin afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı. CpI'ın hidrojen üretim aktivitesini ölçmekte kullanılan iki biyokimyasal tahlil (NADPH ve DTH güdümlü) için gerekli olan bileşenler sentezlendi. Aktivite deneyleri ile anaerobik olarak üretilen ve saflaştırılan CpI enziminin aktif durumda olduğu gösterildi. CFPS'de de anaerobik olarak CpI üretme girişimleri yapıldı, ancak bu başarısız oldu. Ancak hem doğal-tip hem de mutant CpI'nin CFPS üretimi için gerekli olan her şey hazırlandı.