Trikalsiyum fosfata bağlanmış mezenkimal kök hücre eksozomlarının kemik yenilenmesine etkisi

Kemik fizyolojik koşullarda kendini yenileyebilen bir doku olmasına rağmen metabolik hastalıkları, nekrotik ya da travmatik hasarlarında yapı ve işlevleri bozulabilir. Kritik kemik kayıplarının, kemik inorganik matriksinin ana bileşeni osteokondüktif kalsiyum fosfat bileşiklerinin yanında osteoindüktif büyüme faktörleri ya da bunlara kaynak sağlayan kök/öncül hücreler ile desteklenmesi gereklidir. Mezenkimal kök hücre eksozomları, kemikte rejeneratif etkili molekülleri içermeleri, hedef hücreye kolayca alınmaları ve immün yanıt oluşturmamaları nedeniyle, mezenkimal kök hücreler yerine tercih edilebilir. Bu çalışmada anneksin V ile kalsiyum eksik hidroksiapatite kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomları bağlanarak oluşturulan biyomühendislik temelli formülasyon ile osteoblastların çoğalma, matriks sentezi ve mineralizasyonunun uyarılabileceği varsayılmıştır. Bu hipotezi test etmek için, deney ve kontrol gruplarını içeren in vitro deney düzeneğinde (1) kalsiyum eksik hidroksiapatitin üretilmesi ve karakterizasyonu, (2) insan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomlarının izolasyonu ve karakterizasyonu, (3) kalsiyum eksik hidroksiapatit ve insan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomlarının anneksin V aracılığı ile bağlanması, bağlanma ve salımın karakterizasyonu, (4) oluşan bu formülasyonun osteoblastların çoğalma ve mineralizasyonuna etkisinin değerlendirilmesi hedeflenmiştir. Hedefler doğrultusunda kimyasal çöktürme yöntemiyle kalsiyum eksik hidroksiapatit sentezi gerçekleştirilmiştir. Kalsiyum eksik hidroksiapatitin X-ışını difraksiyonuyla ve Raman spektroskopisiyle yapısal karakterizasyonu, geçirimli elektron mikroskobunda morfolojik karakterizasyonu yapılmıştır. İnsan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler morfoloji, kültür plağına tutunma, spesifik yüzey belirteçleri ve kondrojenik farklılaşma analizi yöntemleriyle karakterize edildikten sonra ultrasantrifüjleme ve MACS yöntemleriyle eksozomları izole edilmiştir. Eksozomlar transmisyon elektron mikroskobunda değerlendirilmiş; BCA analizi ile protein konsantrasyonları, NTA yöntemiyle partikül sayısının ve partikül boyutlarının analizi yapılmıştır. Akım sitometresiyle CD 9 ile yakalanan eksozomların CD63 ile ve CD81 ile işaretlendikleri, her üç belirtece de sahip oldukları gösterilmiştir. Kalsiyum eksik hidroksiapatite, anneksin V aracılığıyla insan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomlarının bağlanması; Raman spektroskopisi ve jel elektroforezi ile gösterilmiştir. Kalsiyum eksik hidroksiapatite bağlı eksozomların BCA analiz yöntemi ile ilk 12 saatte büyük çoğunluğunu kontrollü olarak saldığı gösterilmiştir. Kalsiyum eksik hidroksiapatit ve insan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomlarının insan fetal osteoblastlarındaki etkili proliferatif dozu gerçek zamanlı impedans temelli olarak 1. günden 3. güne ölçülmüş ve sırasıyla 0.1 µg/ml ve 25 µg/ml olarak belirlenmiştir. Belirlenen etkili dozlarda hazırlanan formülasyon osteoblastlara uygulandığında gerçek zamanlı olarak osteoblastların çoğaldıkları; matriks sentezi ve mineralizasyonu gösteren ALP aktivitesinin 0-7 gün zaman aralığında kontrol grubuna göre arttığı saptanmıştır. Sonuç olarak bu tez çalışması ile ilk kez kalsiyum eksik hidroksiapatit, anneksin V ile kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomlarına bağlanarak orijinal ve yenilikçi, yüksek teknolojik, kişiye özel ve hedefli bir formülasyon geliştirilerek in vitro koşullarda insan osteoblastlarındaki yenileyici etkisi ortaya konmuştur. Bu yeni formülasyonun in vivo hastalık modellerindeki deneysel validasyonunu takiben klinikteki metabolik ya da travmatik kemik hasarlarının onarılmasında otojenik, kişiye özel ya da allojenik bir tedavi ajanı olarak yer alma potansiyeli bulunmaktadır. Tez kapsamındaki biyomühendislik temelli yeni tedavi ürününün ülkemizin ortopedik hastalıkların tedavisine ait uluslararası pazarda rekabet gücünü arttırma hedefini karşılaması önemlidir. Bu kapsamda, tezden elde edilen çıktılar ile Hacettepe Teknokent Teknoloji Transfer Merkezi Patent Ofisine patent başvurusu yapılmıştır (Başvuru no: 2021/002221).