Triple negatif meme kanserinde fotodinamik tedavi ve kemoterapinin kombin etkisinin belirlenmesi

Dünyada en sık görülen kanser türlerinden biri olan meme kanserinin alt tipi olarak triple negatif meme kanseri (TNMK) östrojen ve progesteron reseptörlerinden ve insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2'den yoksun ve tüm meme kanseri vakalarının yaklaşık % 10-20'sini oluşturmaktadır. TNMK'nın tedavisinde cerrahi, radyoterapi ve immünoterapi gibi yöntemler kullanılmakla birlikte birincil tedavi basamağı kemoterapidir. Ancak, TNMK'nın heterojen ve agresif yapısı, yüksek rekürrens ve metastatik potansiyeli ve mevcut kanser tedavilerine dirençli olması yeni tedavi stratejilerine yönelik çalışmaların dikkat çekmesine neden olmaktadır. Kanser tedavisinde güncel yaklaşımlardan biri fotodinamik tedavidir. Fotodinamik tedavinin (FDT) temelinde ışığa duyarlı maddenin spesifik dalga boyundaki ışık ile uyarıldıktan sonra oksijen ile etkileşime girmesi sonucunda reaktif oksijen türlerini üretmesi ve fotokimyasal olayların indüklenmesi sonucunda oluşan reaktif oksijen türlerinin (ROS) kanser hücrelerinde apoptotik, nekrotik veya otofajik ölüme neden olması yer almaktadır. FDT'nin temelinde fotosensitizer (FS), ışık ve oksijen olmak üzere üç bileşen bulunmaktadır. Bu bileşenler tek başına etkin olmamasına rağmen, bir araya geldiklerinde kanser hücrelerinde sitotoksik etki göstermekte ve bu sayede hedef dokuya özgü daha yüksek seçicilik sağlamaktadır. Bu üç önemli unsurdan ilki olan FS, etkili FDT için ışık enerjisini soğuran ROS oluşumunu katalize eden bir fotoaktif moleküldür. FDT'de ışık kaynağı etkinliğinde ise hedef dokuda istenen etkinin sağlanabilmesi için doğru ışık dozu, yeterli FS konsantrasyonu ve oksijene ihtiyaç bulunmaktadır. Bu kapsamda, FDT uygulamalarında farklı lazer veya lazer olmayan ışık kaynağı kullanılmaktadır. FDT'de en önemli son parametre ise oksijendir. FDT'de ROS üretiminde oksijenin dokulardaki konsantrasyonu önemli rol aldığı için FDT'nin terapötik etkinliği hedef dokularda bulunan moleküler oksijen konsantrasyonuna bağlıdır. 5-aminolevülinik asit (5-ALA) protoporfirin IX (PpIX)'un öncüsü olarak FDT uygulamalarında kullanılan bir FS'dir. 5-ALA PpIX'e dönüştüğünde aktif bir FS haline gelmektedir. Tek başına FS olmayan 5-ALA Hem biyosentetik yolağıyla hızla Hem'in başka bir öncüsü olan PpIX'e metabolize olarak aktif bir FS haline gelmekte ve 635 nm dalga boylarındaki ışık ile uyarıldığı zaman ROS miktarındaki artışa bağlı olarak hücrelerin mitokondrilerine hasar vermektedir. Daha önce yapılmış olan çalışmalarda 5-ALA temelli FDT'nin hücrelerde intraselüler PpIX birikimine neden olduğu, buna bağlı olarak artan ROS üretimi ile farklı kanser hücrelerinde sitotoksik etkisi belirlenmiştir. Ancak, 5-ALA başta olmak üzere FS'lerin tek başına yeterli düzeyde etkin olmaması, ışığın hedef dokuya penetrasyonu, FS seçiciliğinden kaynaklı sorunlar ve oksijen hipoksisi gibi kısıtlamalar FDT'nin etkinliğini sınırlamaktadır. Bu çerçevede FDT ile diğer tedavi yöntemlerinin kombin uygulanmasına yönelik çalışmalar dikkat çekmektedir. Bu kapsamda, literatürde oral hücreli skuamöz karsinom, meme kanseri, melanom ve akciğer kanseri hücrelerinde 5-ALA temelli FDT ile dosetaksel, sisplatin, fluorourasil ve gefitinib kemoterapi ajanlarının kombin uygulamasının tek başına uygulamalara göre daha etkin olduğu belirlenmiştir. Ancak, TNMK hücrelerinde 5-ALA/FDT ile kemoterapi ajanlarının kombin etkisine dair bir çalışmaya rastlanılmamıştır. Çeşitli kanser türlerinin tedavisinde kullanılan güçlü bir kemoterapötik ajan olarak sisplatin hücrenin DNA'sında eklentiler oluşturmakta ve böylece DNA replikasyonunu ve zincir uzamasını engelleyerek antineoplastik aktivite göstermektedir Buna rağmen, sisplatinin neden olduğu yan etkiler ve zamanla sisplatine karşı gelişen direnç sisplatinin tedavide etkin kullanımını kısıtlamaktadır. Bu çerçevede tez çalışmasında sisplatinin neden olduğu yan etkilerini azaltmak ve 5-ALA temelli FDT uygulamalarında sınırlamaların üstesinden gelmek için ilk kez TNMK ve sağlıklı meme hücrelerinde sisplatin temelli kemoterapi ile 5-ALA/FDT'nin kombin tedavisinin in vitro etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Sisplatin ile 5-ALA/FDT kombin tedavisinin MDA-MB-231 TNMK hücreleri ve MCF-10A sağlıklı meme epitel hücrelerinde etkisini incelemek için tek başına sisplatin ve 5-ALA/FDT ile karşılaştırmalı olarak eş zamanlı ve sıralı olmak üzere iki farklı sisplatin ve 5-ALA/FDT kombin tedavi seçeneklerinin anti-kanser etkisi belirlenmiştir. Bu kapsamda tek başına 1, 2.5 ve 5 µM sisplatin, tek başına 1 mM 5- ALA ile inkübe edilen hücrelere 1.5, 3, 6, 9 ve 12 J/cm2 enerji yoğunluklarındaki 635 nm diyot lazer uygulaması yapıldı ve 24 saat inkübasyon sonunda hücre canlılığı WST-1 analizi ile belirlendi. Eş zamanlı kombin tedavi uygulamasında hücrelere 1 mM 5-ALA ile birlikte 2.5 ve 5 µM sisplatin uygulanarak 4 saat inkübe edildikten sonra 1.5, 3, 6, 9 ve 12 J/cm2 enerji yoğunluklarında lazer ışıtması yapılmıştır. Sıralı kombin tedavide ise 1 mM 5-ALA ile 4 saat inkübe edilen hücreler belirtilen enerji yoğunluklarında lazer ışıması yapıldıktan sonra 2.5 ve 5 µM sisplatin eklendi ve 24 saat sonra sitotoksik etkisi WST-1 analizi ile belirlendi. Hücrelerde meydana gelen apoptotik ölüm miktarının tayini için Anneksin V analizi gerçekleştirildi. Ayrıca, tek başına sisplatin, 5-ALA/FDT uygulaması ile karşılaştırmalı olarak eş zamanlı 5-ALA/FDT ve sisplatin kombin uygulamasının hücre morfolojisinin yanı sıra mitokondri ve nükleusta neden olduğu hasarın görüntülenmesi için akridin oranj, Mitotracker ve DAPI boyaması yapıldı. Elde edilen WST-1 bulgularına göre, MDA-MB-231 hücrelerinde tek başına 2.5 µM sisplatin (% 73.96) ve 5-ALA/FDT'ye kıyasla (6 J/cm2: % 75.97 ve 9 J/cm2: % 59.55) 5-ALA/FDT ve sisplatin eş zamanlı kombin uygulamasının (1.5 J/cm2: % 121.89, 3 J/cm2: % 113.34, 6 J/cm2: % 55.77, 9 J/cm2: % 43.83, 12 J/cm2: % 58.02) daha etkin olduğu belirlendi. Ayrıca sıralı kombin tedavi uygulaması ile karşılaştırıldığında (1.5 J/cm2: % 128.05, 3 J/cm2: % 128.12, 6 J/cm2: % 90.99, 9 J/cm2: % 77.80, 12 J/cm2: % 76.51) eş zamanlı kombin tedavinin hücrelerde daha fazla anti-proliferatif etkiye sahip olduğu analiz edildi (p<0.05*). Diğer yandan, eş zamanlı 5 µM sisplatin ve 5-ALA/FDT uygulanan MDA-MB-231 hücrelerinde 2.5 µM sisplatin ve 5-ALA/FDT'ye göre antagonistik etki göstererek hücre canlılığında özelikle 6 ve 9 J/cm2 enerji yoğunluklarında daha az etkin olduğu tespit edildi (6 J/cm2: % 72.9 ve 9 J/cm2: % 65.50). Diğer yandan, MCF-10A hücrelerinde sisplatin ve 5-ALA/FDT kombin uygulamasının (6 J/cm2: % 48.10 ve 9 J/cm2: % 47.25) tek başına 5-ALA/FDT'ye (6 J/cm2: % 40.54 ve 9 J/cm2: % 42.22) göre daha az toksik etkisi olduğu analiz edildi. Anneksin V analizi sonuçlarına göre, MDA-MB-231 hücrelerindeki toplam apoptotik ölüm yüzdesi tek başına 2.5 µM sisplatin (% 37.88) ve 5-ALA/FDT'ye (6 J/cm2: % 31.48 ve 9 J/cm2: % 37.78) kıyasla eş zamanlı kombin tedavide (6 J/cm2: % 46.78 ve 9 J/cm2: % 53.6) anlamlı olarak arttığı analiz edildi (p<0.01**). Ayrıca, sisplatin ve 5-ALA/FDT eş zamanlı kombin uygulamasının MDA-MB-231 hücrelerinde daha fazla apoptotik ölüme, nükleer ve mitokondriyal hasara neden olduğu tespit edildi. Bu çalışma ile sisplatin ile 5-ALA/FDT kombin tedavisinin TNMK hücrelerinde anti-kanser etkisi ilk defa araştırılmıştır. Elde edilen bulgular, eş zamanlı 2.5 µM sisplatin ile 1 mM 5-ALA uygulaması sonrasında 6 J/cm2 ve 9 J/cm2 enerji yoğunluklarındaki lazer ışıması yapılan TNMK hücrelerinde tek başına 5-ALA/FDT ve sisplatin uygulamasına göre daha etkin olduğu ve sinerjistik etki gösterdiği (kombinasyon indeksi<1) belirlenmiştir. Ancak, sisplatin ile 5-ALA/FDT'nin kombin etkisinin TNMK hücrelerinde etkisinin moleküler düzeyde aydınlatılmasına yönelik ileri çalışmaların gerçekleştirilmesi gerekmektedir.