Histon H3 lizin 36 üç-metil kaybının somatik hücre yeniden programlamasını nasıl geliştirdiğinin anlaşılması

Somatik hücreler, bir dizi transkripsiyon faktörü (OCT4, SOX2, KLF4 ve c-MYC) kullanılarak uyarılmış pluripotent kök hücrelere (UPKH) yeniden programlanabilir. Bununla birlikte, somatik hücrelerin UPKH'lere yeniden programlanması, yeniden programlamaya karşı engellerin varlığını gösteren çok düşük verimlilikten mustariptir. DNA ve histonların translasyon sonrası modifikasyonlarını düzenleyen epigenetik faktörler, yeniden programlamanın bu tür engelleri arasındadır. Ön çalışmamızda, histon H3 lizin 36 üç-metillenmesini (H3K36me3) katalize eden memelilerdeki tek enzim SETD2'nin yeniden programlamanın bir bariyeri olduğu gösterilmiştir. H3K36me3, aktif transkripsiyon gösteren genlerin gen gövdeleri boyunca biriken bir histon işaretidir. Bu tezde, H3K36me3 kaybının UPKH oluşumunu nasıl geliştirdiğinin moleküler mekanizmalarını araştırdım. H3K36me3 kaybının yeniden programlama verimliliğini nasıl artırdığını anlamak için birkaç hipotez önerdim. İlk olarak, ön çalışmamızdaki RNA dizileme analiziyle belirlenen SETD2 baskılanmasıyla ekspresyonu azalan genler arasından dört transkripsiyon faktörünü (CITED2, EBF3, SMAD3 ve FOSL1) yeniden programlamada test ettim. Bu transkripsiyon faktörlerinin aşırı ekspresyonunun, SETD2 baskılanmasıyla artan yeniden programlama fenotipini tersine çevirip çeviremeyeceğini test ettim. Bu transkripsiyon faktörlerinin hiçbirinin SETD2 baskılanmasıyla artan yeniden programlama verimliliğini tek başına azaltamayacağını gösterdim. Deneylerin ikinci kısmında, birbirini dışlayarak histon H3'ün kuyruklarında biriken aktif H3K36me3 ve baskılayıcı H3K27me3 işaretleri için kromatin immünopresipitasyon (ChIP) gerçekleştirdim. H3K36me3 kaybının H3K27me3 birikimine yol açıp açmayacağını araştırmak için, SETD2 baskılanması ile ekspresyonu azalan genler üzerindeki H3K27me3 dağılımını analiz ettim. Ancak ChIP-qPCR sonuçları, SMAD3, LPAR1, EBF3 ve SFRP1 gibi seçilen genler üzerindeki bu iki işaret arasında karşıt bir ilişki olduğunu göstermedi. Son olarak, yeniden programlamadaki rollerini anlamak amacıyla memelilerde bilinen tüm H3K36me3 okuyucularını hedefleyen CRISPR/Cas9 tabanlı bir tarama gerçekleştirdim. Hangi H3K36me3 okuyucusunun SETD2 tükenmesini feno-kopyalayacağını bulmayı amaçladım. Bu tarama, PSIP1, MRG15, MSH6, MSL3, NSD2 ve NSD3'ün yeniden programlamaya engel olduğunu gösterdi, çünkü bunların nakavtı yeniden programlama verimliliğini arttırdı. Bu okuyucular, yeniden programlamanın önündeki engeller olarak doğrulandı ve işleve yönelik testler için alternatif uç-birleştirme ile ilişkili H3K36me3 okuyucusu MRG15 seçildi. Bu nedenle, MRG15 baskılanmasının alternatif uç-birleştirme olaylarını etkileyerek yeniden programlamayı geliştirmiş olabileceğini test etmek amacıyla, yeniden programlama için önemli olduğu bilinen faktörlerin alternatif uç-birleştirmesi üzerinde SETD2 baskılanmasının etkisini analiz ettim. RT-qPCR analizi, hem SETD2 baskılanmasının hem de MRG15 nakavtının ayrı ayrı MBD2'nin pluripotent hücrelere özgü varyantının ekspresyonunda önemli bir artışa yol açtığını gösterdi. Bu sonuçlar, H3K36 üç-metillenmesini okuyarak somatik hücre yeniden programlamasına karşı bariyer oluşturan faktörleri ve H3K36me3 kaybının somatik hücre yeniden programlamasını nasıl geliştirdiğine altta yatan bir mekanizma olarak MBD2 geninin alternatif uç-birleştirmesini göstermiştir.