Üstün mekanik özelliklere sahip ipek fibroin iskeletlerinin yüksek fibroin konsantrasyonlarında üretimi

Dejeneratif, cerrahi ya da travmatik süreçlere bağlı olarak oluşan kemik kırıklarında veya kemik doku kayıplarında iyileşmeyi ve yenilemeyi sağlamak için doku isketleri kullanılmaktadır. Doku isketleri bu süreçte hücrelerin doğal yapılarına ulaşması için, destekleyici ve koruyucu olmalıdır. Ayrıca, toksik olmamalı, biyouyumlu ve biyobozunur olmalı en önemlisi kolayca üretilmelidir. Doku iskeletleri, sadece biyolojik değil aynı zamanda belirli kimyasal ve fiziksel özellikleri de sağlamalıdır. Bu nedenle mekanik fonksiyonlarını yerine getirecek sağlamlık ve sertliğe sahip olmalıdır. Birbiri ile bağlantılı gözenekli yapısı kontrol edilebilir ve gözeneklilik oranı % 90'nın üzerinde olmalıdır. Anlaşılacağı gibi, doku isketlerinde gözeneklilik ve mekanik özellikler arasındaki bu yakın ilişki oldukça fazla öneme sahiptir. Hidrojellerin pratik uygulamalarında, dışarıdan gelen uyarılara hızlı tepki vermesi, aynı zamanda mekanik dayanımının çok yüksek olması amaçlanmaktadır. Ancak, hidrojellerin uygulamalarını sınırlayan en büyük etken mekanik olarak dayanıksız oluşlarıdır. Dayanıklı ve tok hidrojellerin eldesi için son yıllarda yoğun araştırmalar yapılmakta, çeşitli teknikler geliştirilmekte, diğer yandan onlara makrogözenekli bir yapı kazandırılması amacıyla çalışmalar yapılmaktadır. Bu araştırmalar ışığında kriyojelleşme tekniği ile makro gözenekli ve mekanik özellikleri geliştirilmiş jellerin elde edilmesi mümkün olmaktadır. Kriyojelleşme, reaksiyon çözeltisinin donma noktasının altındaki uygun bir sıcaklıkta soğutularak oluşan çözücü kristallerinin etrafındaki donmamış mikro bölgelerde konsantrasyon artışına bağlı olarak ilerler. Kriyokonsantrasyon etkisi olarak adlandırılan bu durum, kriyojeleşmenin temel prensibidir. Elde edilen jelin (kriyojel) üstün özelliklerinin oluşmasında etkilidir. Donmuş çözücü ise, kalıp etkisi oluşturarak kriyojelleşme sonrasında eritilmesiyle, birbiri ile bağıntılı gözenekleri oluşturmasını sağlar. Kemik doku mühendisliğinde yapı iskeleti olarak kullanılması amacıyla, biyobozunur, biyouyumlu ve üstün mekanik özelliklere sahip olan ipekten yola çıkarak, laboratuarımızda kriyojeller üretilmiştir. İpek yapısında bulunan fibroin proteini, başlıca glisin ve alanin amino asit ünitelerinden oluşan ve hidrofobik bloklar ile bunların aralarında hidrofilik bloklar içeren bir kopolimer yapısındadır. Hidrofilik bloklar suda çözünürlüğü sağlarken, hidrofobik bloklar arası asosiyasyonlar, fibroinin rastgele yumak yapısından β-tabaka yapısına bir konformasyon geçişine neden olur. İpek fibroinin (İF) yapısındaki β-tabakaları malzemeye dayanıklılık ve sertlik kazandırırken, daha düzensiz olan hidrofilik bloklar tokluğu ve elastisiteyi arttırır. Tez kapsamında yapılan deneysel calışmalarda, gerek 1,4-bütandiol diglisidil eter (BDDE) çapraz bağlayıcısı ve gerekse sodyum dodesil sülfat (SDS) sürfaktanı kullanılarak fibroinin β-tabaka konformasyonuna geçişi sağlanmış ve kriyojeller elde edilmiştir. BDDE çapraz bağlayıcı kullanılarak,fibroinin jelleşmesi -18oC' de, 24 saatte gerçekleştirilmiştir. % 1 ile % 61,4 arasında değişen fibroin konsantrasyonlarında hazırlanan kriyojellerin şişme özellikleri, konformasyonel değişimleri, mekanik özellikleri ve gözenekli yapısı açıklanmıştır. Fibroinin jelleşmesi sırasındaki konformasyonel değişimler ATR-FTIR ölçümleri ile belirtilmiştir. Kriyojelleşme ile fibroin rastgele yumak yapısından β-tabakaya geçişi gösterilmiştir. Şişme ölçümleri yapılmış kriyojellerin hacimce ilave şişmeyip, fakat kütlece şiştiği belirtilmiştir. Şişme ölçümleri sonucunda gözeneklilik oranının fibroin konsantrasyonuna bağlı olarak % 97 ile % 69 arasında ayarlanabileceği ortaya çıkmıştır. Farklı fibroin konsantrasyonlarında hazırlanan kriyojellerin kuru durumdaki mekanik özellikleri test edilmiştir. En çarpıcı sonuç, % 46,2 İF konsantrasyonunda hazırlanan kriyojelin Young modülünün 126 MPa değerine ulaşmasıdır. Ayrıca, kriyojellerin parçalanma gerilimleri ve deformasyon oranları belirlenmiştir. Farklı konsantrasyonlarda hazırlanan tüm kriyojeller % 95-100' e kadar deforme olabilmektedirler. Kriyojellerin parçalanma gerilimleri 243 MPa kadar çıkmaktadır. SEM görüntüleri incelenmiş, kriyojelleşme ile düzenli gözeneklerin oluştuğu görülmüştür. Gözenek boyutu ile mekanik özellikler arasındaki ilişki açıklanmıştır. Artan fibroin konsantrasyonuyla gözenek duvarlarının kalınlaştığı, gözenek boyutlarının küçüldüğü, kriyojellerin daha dayanıklı olduğu yorumlanmıştır. Kuru durumdaki ölçümlerine ek olarak, suda dengeye gelmiş kriyojellerin mekanik ölçümleri yapılmıştır. Kuru durumdakilere oranla, mekanik test sonuçlarının önemli ölçüde düştüğü saptanmıştır. Şişmiş kriyojellerin bu durumu, fibroin ağ yapı zincirlerinin hidrofilik yapısı nedeniyle gözenek suyunu tutması ve kauçuksu duruma geçmesi ile açıklanmıştır. SDS sürfaktanı kullanılarak, ipek fibroinin jelleşmesi kriyojelleşme tekniği ile hızlandırılmıştır ve -18oC' de ve 48 saatte gerçekleştirilmiştir. SDS sürfaktanının fibroin zincirleri arasındaki hidrofobik etkileşimleri tetiklediği ve böylece jelleşmeyi sağlayan ajan olarak davrandığı düşünülmektedir. % 4,2 İF konsantrasyonunda 5 mM ile 125 mM arasındaki farklı SDS konsantrasyonlarında kriyojeller sentezlenmiştir. Sürfaktan miktarının, fibroinin kriyojelleşme prosesinde önemli bir farklılığa yol açmadığı gözlemlenmiştir. Tüm SDS konsantrasyonlarında kriyojellerin şişme özellikleri benzer davranış göstermiştir ve gözeneklilik % 97 civarında hesaplanmıştır. Mekanik ölçümler sonucunda 5 mM SDS konsantrasyonunda elde edilen kriyojelin biraz daha sağlam olduğu gözlenmiştir. Düşük SDS konsantrasyonlarında fibroin zincirleri arasında oluşan hidrofobik blokların daha düzenli olduğu düşünülmüştür. SEM görüntüleri incelendiğinde 5 mM SDS konsantrasyonundaki kriyojelin gözenekli yapısının daha iyi olduğu görülmüş ve mekanik özellikler ile tutarlı olduğu saptanmıştır. Yapılan çalışmalar sonucunda, ipek fibroinin donmuş sulu çözeltilerinde kriyojelleşmesi ile makro gözenekli, hemen hemen % 100 deforme olabilen, mekanik özellikleri çok iyi kriyojeller elde edilmistir. Bu tip malzemeler, kemik doku mühendisliği uygulamalarında yapı iskeleleri olarak kullanıma uygun iskeletlerdir.