L-alanine dehydrogenase from vagococcus lutrae: structural analysis and ındustrial potential

Vagococcus lutrae kaynaklı L-Alanin dehidrogenaz (VlAlaDH), L-alanin ve pirüvat arasın- daki geri dönüşümlü oksidasyon-redüksiyon reaksiyonunu katalizler. Enzimin tek bir en- zimatik adımda değerli bir ürün üretebilme yeteneği, bakteriyel AlaDH'lere olan ilgiyi artırmıştır. Bu çalışmada, karakterizasyonu sınırlı bir organizmadan elde edilen, yeni bir yabani tip AlaDH apo yapısı sunulmuştur. Bu yapı, minimal pirüvat yan ürünüyle L-alanin üretimi için bir aday olabilir. Bu keşif, gelecekteki protein mühendisliği çalışmaları için bir temel oluşturmaktadır. Yapı, "Turkish Delight" difraktometresi kullanılarak oda sıcaklığında ve nötr pH'a yakın koşullarda X-ışını kristalografisi yöntemiyle belirlenmiştir. Bu yaklaşım, VlAl- aDH'nin 3.2 Å çözünürlüklü apo yapısının belirlenmesini sağlamış ve korunan Rossmann katlanma motiflerine sahip homojen altımerik bir oligomerizasyon ortaya koymuştur. Çalışmanın temel bulgusu, enzimin her bir homoloğunda gözlemlenen ana motif mi- marisini koruduğudur. Korunan motifler, NAD bağlayan bir Rossmann katlanmasını, korunan -sarmallar ile bağlanmış ikinci bir Rossmann katlanmasına bağlayan bir yapıda bulunmuştur; bu ikinci katlanma alanı pirüvat ve L-alanin için katalitik amino asitleri içer- mektedir. NAD bağlayıcı Rossmann katlanmasında, Geobacillus kaustophilus ve Thermus thermophilus gibi termostabil bakteriyel AlaDH'lerle amino asit düzeyinde bazı benzer- likler gözlemlenmiştir. Özellikle, 270. pozisyondaki amino asit Asp'dan Gln'a değişmiş, 240. pozisyondaki amino asit Val'den Ile'ye dönüşmüş ve hem T. thermophilus hem de V. lutrae'de 198. pozisyonda diğer homologlarda bulunmayan bir İzolösin gözlemlenmiştir. Bu amino asitler, NAD'ın bağlanma yarığına hidrojen bağları ve hidrofobik etkileşimler yoluyla katılmaktadır. Ana bağlayıcı kofaktör NAD olduğundan, bu değişimler gelecek- teki mühendislik çalışmaları için hedeflenebilir. Filogenetik analiz, evrimsel olarak uzak türlerin kofaktör bağlanması düzeyinde ortak adaptasyonlar gösterdiğini desteklemektedir. Bu çalışma, bu yeni AlaDH yapısının homolog yapılarla karşılaştırmalı analizini de- taylı şekilde sunsa da, substrat veya kofaktörle birlikte kristalizasyon yapılmadığı için elde edilen sonuçlar deneysel olarak doğrulanamamaktadır. Ayrıca, L-alanin aşırı üre- timiyle karşılaştırılabilecek herhangi bir hedefe yönelik mutagenez çalışması da gerçek- leştirilmemiştir. Sonuç olarak, Vagococcus lutrae'ye ait L-alanin dehidrogenazın yapısal, dizisel, evrimsel ve hesaplamalı analizleri, substrat ve kofaktör bağlanma özellikleri hakkında önemli bilgiler sunmaktadır. Kristalleştirme veya mutagenez çalışmaları olmaksızın bile, bu çalışma VlAlaDH'nin gelecekteki protein mühendisliği çalışmaları için umut vadeden bir aday olduğunu göstermektedir. Bulgular ayrıca, L-alanin biyosentezinin endüstriyel üretimi açısından enzimin potansiyelini desteklemekte ve ileri optimizasyon çalışmaları için temel oluşturmaktadır.