Nükleer faktor ı proteinlerinin transkripsiyonel ragülatörler PIN1 ve LMO4 ile etkileşimlerinin in vitro olarak araştırılması

Nükleer faktör I transkripsiyon faktörü ailesi omurgalılarda gelişimin önemli düzenleyicisidir. Bu aile ana olarak merkezi sinir sisteminde hem projenitör hem de kök hücrelerin bulunduğu ventriküler zon olarak adlandırılan bölgede ve bunun yanı sıra akciğerler ve kas-iskelet dokusunda ifade edilmektedir. NFI ailesi NFIA, NFIB, NFIC ve NFIX olmak üzere 4 üyeden oluşmaktadır. Bu üyelerden birbirleri ile aynı veya farklı olmak üzere iki adet NFI proteini DNA çift ipliğinde TTGGC(N5)GCCAA dizisine bağlanmaktadır. NFI proteininin yapısı incelendiğinde amino (N) ucunda yaklaşık olarak 210 amino asidin oluşturduğu DNA'ya ve diğer NFI proteinlerine bağlanabileceği dimerleşme domeni, karboksi (C) ucunda ise gen ifadesini aktive ettiği veya baskıladığı C ucu domeni bulunmaktadır. Üyeler arasında amino asit dizilerinin benzerliği incelendiğinde, özellikle N-ucu domeninin üyeler arasında benzerliğinin yüksek oranda korunduğu, bunun aksine C-ucu domeninde benzerliğin daha az olduğu görülmektedir. C ucu domeninin benzerliğinin az olması, NFI proteinlerine çeşitliliği sağlamaktadır. Bunun yanı sıra, alternatif kırpılma mekanizması ile NFI üyelerinin farklı izoformlarının üretilmesi, NFI proteinlerinin çeşitliliğini arttırmaktadır. NFI proteinlerinin diğer proteinler ile benzerliği araştırıldığında, şimdiye dek sadece SMAD proteinlerinin N ucu domeni olan MH1 domeni arasında benzerlik olduğu belirlenmiştir. Her iki protein de kısaca CCHC olarak adlandırılan sistein-sistein-histidin-sistein amino asit dizisini içermektedir. Bu korunmuş dizi her iki proteine de DNA'ya bağlanma fonksiyonu kazandırmaktadır. Bunun yanı sıra, NFI proteinleri hücre çekirdeğine girebilmek için iki adet nükleer lokalizasyon sinyali taşımaktadır. Bu sinyallerden biri NFI proteinlerini kodlayan 2.ekzonda, diğeri ise 5. ve 6. ekzonların arasında yer almaktadır. NFI ailesi üyesi proteinlerinin fonksiyonları incelendiğinde, her birinin özel bir görev üstlenip üstlenmediği tam olarak tespit edilememiştir. Farelerde her bir NFI üyesinin ifadesinin yok edilmesi ile yapılan çalışmalarda, NFIA, NFIB, NFIC ve NFIX'in eksikliğinin merkezi sinir sisteminin ve merkezi sinir sistemi dışındaki bazı dokuların farklılaşma süreçlerini ve bu dokuların oluşumunu etkilediği görülmektedir. NFIA, NFIB ve NFIX'in ifadesinin silinmesi ile merkezi sinir sisteminde farklı fenotipler görülmektedir. Bu nedenle NFI ailesi üyesi proteinlerin birbirlerinden farklı görevlerinin olabiliceği ön görülmektedir. Üyelerin farklı regülatör proteinler ile bağlanmasının, her birine farklı görevleri kazandırabileceği düşünülmektedir. Şimdiye kadar NFI proteinlerinin bazı proteinler ile fiziksel olarak etkileşime girdiği ve bu etkileşimin NFI'lar tarafından kontrol edilen gen ifadesinin artmasına veya azalmasına neden olduğu gösterilmiştir. Ancak beyin gelişimini etkileyen herhangi bir protein ile etkileştiği keşfedilmemiştir. Bu nedenle, daha önce insan fetal komplementer DNA (cDNA) kütüphanesinin kullanılması ile yapılan maya ikili hibrit çalışması sonucunda NFIB proteini ile fiziksel olarak etkileşime giren aday 12 adet xxvi protein tespit edilmiştir. Bu aday proteinler arasında özellikle beyin gelişiminde önemli fonksiyonları olduğu ve çeşitli transkripsiyon faktörlerini regüle edebildiği gösterilen transkripsiyonel regülatörler PIN1 ve LMO4 proteinleri de yer almaktadır. PIN1 ökaryotik hücreler tarafından ifade edilen, hedef proteinlerde bulunan ve prolin ile devam eden serin/treonin (S/T-P) rezidülerini tanıyarak sis-trans izomerizasyonunu gerçekleştiren bir peptidil-prolil izomerazdır. İzomerizasyon sonucunda hedef proteinlerin konformasyonunu değiştirerek bu proteinlerin yeni proteinlerle etkileşmesini sağlayabilmekte, bu proteinleri hücresel mekanizmalar tarafından yıkılmaktan koruyabilmekte veya tam aksine yıkılmalarını sağlayabilmektedir. PIN1 proteininin etkileştiği pek çok transkripsiyon faktörü ve diğer proteinler tespit edilmiştir. Bu etkileşimler sonucunda PIN1 proteininin hücrelerin bölünme veya farklılaşması süreçlerinde etkin rol oynadığı bilinmektedir. Transkripsiyon faktörleri ile olan etkileşimi sonucunda, bu faktörler tarafından kontrol edilen gen ifadesini arttırdığı veya azalttığı gösterilmiştir. LMO4 ökaryotik hücreler tarafından ifade edilen, hücre içerisinde transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere pek çok proteine bağlanabilme kapasitesine sahip bir adaptör proteindir. LMO4, LIM protein ailesine dahil olan ve LIM Only olarak adlandırılan alt aileye aittir. LIM protein ailesine üye olan proteinler, en az bir adet, aileye adını veren LIM domeni içermektedir. LMO4 proteini 2 adet birbiri ardına gelen LIM domeni içermekte, bu iki domen kısa bir bağlayıcı bölge ile birbirine bağlanmaktadır. LIM domeninin amino asit sekansı incelendiğinde, birbirlerine göre konumları değişmeyecek şekilde ard arda iki adet sistein-sistein-histidin-sistein amino asid dizisinin var olduğu görülmektedir. Her bir LIM domeni iki adet birbirini takip eden ilmek oluşturmaktadır. Çinko parmak olarak adlandırılan bu motif, hücre içerisinde çeşitli proteinler ile etkileşmek için önemli bir yüz oluşturmaktadır. LMO4 proteinlerinin DNA'ya bağlanabildiği henüz gösterilmemiştir. Ancak etkileşime girdiği proteinler aracılığı ile DNA'ya çağırılan LMO4'ün, etkileşime girdiği transkripsiyon faktörlerinin fonksiyonunu regüle edebildiği gösterilmiştir. PIN1 ve LMO4 embryonik gelişim sürecinde ventiküler zonda ifade edilmektedir. Aynı bölgede NFI ifadesinin de var olması, ayrıca her iki aday proteinin de nöronal gelişimde önemli rollerinin olması, eksikliklerinde ise hem nöronal gelişimin hem de belirli dokuların oluşumunda bozuklukarın olması, seçilen aday proteinlerin NFI üyelerinin de işlevini regüle edebileceğini göstermektedir. Her iki aday protein de NFI proteinlerinin benzerlik taşıdığı tespit edilen SMAD ailesi üyeleri ile etkileşime girmekte ve SMAD'lerin işlevini regüle etmektedir. Bu durum, her iki aday proteinin de NFI proteinleri ile de bağlanabileceği göstermektedir. Bu çalışmanın amacı, daha önce maya ikili hibrit deneyleri sonucunda NFIB proteini ile etkileşime girebileceği ön görülen aday proteinler PIN1 ve LMO4'ün NFI ailesine ait proteinler arasındaki etkileşimin biyokimyasal yöntemler ile gösterilmesidir. Bu amaçla ilgilenilen proteinler öncelikle N ucu domenlerinde uygun epitop peptidlerini de içerecek şekilde memeli hücrelerinde ifade edilebilecekleri ifade vektörlerine kopyalanmıştır. Ardından NFI ailesi üyelerinin PIN1 veya LMO4 proteinlerinden biri ile HEK293T hücrelerinde birlikte ifade etmeleri sağlanmıştır. Hedef proteinlerin, hücrelerin proteinleri denatüre etmeyecek bir metot ile parçalanmasının ardından elde edilen hücre lizatından, üretildikleri epitop peptidlerine uygun olarak kullanılan antikorlar aracılığıyla çökmeleri sağlanmıştır. Yapılan analiz ile hedef protein ile birlikte, aday etkileşim proteinin çökmesi incelenmiştir. Buna alternatif olarak, yine HEK293T hücrelerinde ifade edilen NFI proteinler ile E.coli BL21 suşu bakteri xxvii hücrelerinde GST proteini ile füzyon proteini olarak ifade etmeleri sağlanmış olan PIN1 ve LMO4 proteinleri arasındaki etkileşim, GST'nin çöktürülmesi ile NFI proteinlerinin de bu proteinler ile birlikte çökmesi araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlar PIN1 ile tüm NFI ailesi üyelerinin bağlanabileceğini desteklemektedir. Domen analizi ve mutasyon çalışmaları, tespit edilen bağlanmanın sağlanmasında NFI'ların N-ucu domeninin etkileşim için gerekli olabileceğini işaret etmektedir. Bunun haricinde NFI ailesi ile etkileşim için proteinlerin fosforilasyon durumlarının önemli olup olmadığı incelenmesi amacıyla fosfataz uygulaması yapılmıştır. Elde edilen veriler proteiner arasındaki etkileşimin fosforilasyona bağlı olmadığını düşündürse de, uygun bir pozitif kontrolün bulunmaması nedeniyle sonuçlar kesinlik kazanamamıştır. LMO4 ve NFI proteinleri arasındaki etkileşim aynı metotlar ile incelendiğinde, bulgular LMO4'ün NFI ailesinden NFIX ile etkileşime girebildiğini göstermektedir. NFIB proteininin N ucu domeni ile LMO4 arasında etkişim tespit edilememiştir. Bu nedenle NFIX'in C ucu domeninin LMO4 ile etkileşim için gerekli olduğu tahmin edilmektedir. NFIB ve NFIX proteinlerinde yapılacak diğer mutasyonlar ile, sırasıyla PIN1 ve LMO4 ile bağlanabilmeleri için gerekli olan domen veya rezidülerin bulunması planlanmaktadır. Sonuç olarak LMO4 ve PIN1, NFI ailesi üyesi veya üyeleri ile etkileşime girmektedir. Bu etkileşimin NFI işlevini kontrol edip etmediği henüz bilinmemektedir. İleriki çalışmalarda LMO4 ve PIN1'in NFI ailesi üyeleri ile bağlanmasının NFI'ın gerek hedef DNA dizisine bağlanmasını, gerekse gen ifadesi üzerindeki etkisini değiştirip değiştirmediği ve eğer değiştiriyorsa, bu etkinin hücrelerde işlevsel olup olmadığı incelenmelidir.