144
Archived Theses
0
DOIs Assigned
0%
DOI Rate
Discipline
Aminofenoltiyoetanol çevreli yeni silisyum ftalosyaninlerin farklı meme kanseri hücre hatlarındaki fotodinamik terapi (PDT) etkinliğinin araştırılması
Kanser, kontrolsüz hücre büyümesi ve metastatik özelliklerin kazanılması ile karakterize patolojik bir durumdur. Meme kanseri, kadınlarda en sık görülen kanser olarak dünya genelinde ciddi bir sağlık sorunu oluşturmaktadır. Meme kanserindeki yeni tedavi arayışlarında, klasik tedavilere ek olarak kanser hücrelerini seçici şekilde öldürebilen yöntemler üzerinde durulmaktadır. Bunlar içinde en çok araştırılan yöntemlerden biri de fotodinamik terapidir (PDT). Belirli bir dalga boyundaki ışığın ve bu ışığa duyarlı olan moleküllerin birlikte kullanıldığı PDT'de, reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretilmesiyle hücresel hasar meydana gelir ve hücre ölümü gerçekleşir. Bu tez çalışmasında, ilk kez sentezlenen aminofenoltiyoetanol çevreli yeni silisyum ftalosiyanin (SiPc) moleküllerinin MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hatları ile MCF-10A normal meme hücre hattındaki PDT etkinliğinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu kapsamda, SiPc moleküllerinin hem kanser hücreleri hem de normal hücreler üzerindeki antiproliferatif, antitümöral ve antimigratif özellikleri belirlenmiştir. Hücre canlılığı ve hücre ölümü çalışmalarıyla SiPc moleküllerinin kanser hücrelerinde doza bağlı sitotoksik etki gösterdiği ve hücre ölümünü indüklediği gözlenmiştir. Bu moleküllerin PDT ile kullanılması halinde hücrelerdeki mitokondriyal membran potansiyelini azalttığı, hücre içi ROS oluşumuna neden olduğu ve farklı hücre ölüm süreçlerinde rol alan poli ADP riboz polimeraz 1 (PARP1)'in kesilmiş formunun ekspresyonunu artırdığı saptanmıştır. Ayrıca, kanser hücrelerinin uzun süreli kültürlerindeki koloni oluşumunun ve yara iyileşmesi modeli kullanılarak incelenen hücresel hareketin azaldığı belirlenmiştir. Transwell sistemler ile modellenen migrasyon ve invazyon deneylerinde ise kanser hücre hatlarının migratif ve invaziv kabiliyetlerinin kısıtlandığı tespit edilmiştir. Sonuç olarak, bu tez çalışması ile yeni sentezlenmiş olan SiPc moleküllerinin antitümöral özellikleri ilk kez belirlenmiş ve bu moleküllerin tedavide kullanılmak üzere ilaç adayı moleküller olabileceklerine dair ilk veriler elde edilmiştir.
Meme kanseri hücrelerınde kanonik ve kanonik olmayan WNT yolaklarının baskılanması ile kanser kök hücre popülasyonunun ve dediferansiasyonun azaltılması
Meme kanseri kadınlarda en sık görülen kanser tipidir. Erken tanı konulan vakalarda tedavi başarısı yüksek olmasın rağmen lokal ilerlemiş veya metastatik vakalarda tedavi başarısı düşmektedir. İlk aşamada başarılı görünen tedaviye rağmen, meme kanserleri aylar veya yıllar sonra bile lokal nüks veya uzak metastazlar ile karşımıza çıkabilmektedir. Bu süreçte tümör hücrelerinin diferansiasyonunun azalması, yeni mutasyonların birikimi, dirençli kanser kök hücrelerinin (KKH) oluşumu, KKH'nin uyku moduna geçip tedaviden saklanması gibi mekanizmalar literatürde tartışılmaktadır. Meme kanserlerinde tedavi etkinliğini artırmak için KKH oluşumunu etkileyen hücre içi (Wnt, Notch, Hedgehog vb) yolak inhibitörleri, KKH yüzey işaretçilerini hedefleyen immünoterapi yöntemleri, KKH çoğalmasını uyaran VEGF/VEGFR2, CXCR4 gibi sinyal aks inhibitörleri veya monoklonal antikorlar, apoptozis veya diferansiasyonu uyaran KKH bölünmesini engelleyen histon deasetilaz (HDAC) enzimlerini hedef alan tedaviler deneme aşamasındadır. ER+ ve üçlü negatif meme kanser hücre hatları ile gerçekleştirdiğimiz çalışmamızda literatür ile uyumlu olarak üçlü negatif meme kanser hücrelerinin daha saldırgan yapısını, daha yüksek orandaki KKH varlığını ve bunlara ait moleküler belirteçler gösterilmiştir. Wnt klasik yolak ile kombine olarak diğer yolakların baskılanmasını gerçekleştirerek üçlü negatif meme kanseri hücre hattı MDA-MB-231'de özellikle 24. saat bulgularında KKH popülasyonunun azaltılması yönünde net bulgular elde edilmiştir. Çalışmamızda literatürde ilk defa olarak klasik Wnt yolağı ile birlikte thapsigargin kullanarak meme kanser hücre hatlarında Wnt-kalsiyum yolağı kombine blokajı gerçekleştirilmiştir. Çalışmamız daha önce tek bir çalışmada önerilen Wnt klasik yolak ve Wnt-kalsiyum yolağı sinerjisinin varlığını kanser hücreleri üzerinde test ederek doğrulamıştır. Niklosamid ile LRP5/6 reseptörü üzerinden gerçekleştirilen Wnt klasik yolak baskılanmasının çok etkili olduğu ve bunun Wnt-kalsiyum ya da diğer kombinasyonlar ile kullanılmasının üçlü negatif meme kanserlerinde KKH leri azaltmada etkin olduğu ortaya konulmuştur. Çalışmamızın sonuçları, özellikle dünyada meme kanserleri içinde %12-15'i bulan üçlü negatif meme kanserlerinde hedeflenmiş tedavi gerekliliğini desteklemektedir. Çalışmamızın sonuçlarının önemli bir mortalite sebebi olan meme kanserli hastalar için KKH aktivitesini belirleyen mekanizmaların aydınlatılması ve yeni hedeflenmiş tedavi seçenekleri geliştirilmesi için yol göstereceğini düşünüyoruz.
Non-immune hydrops fetalis ilişkili sinyal yolağının in silico yöntemlerle araştırılması
Non-Immune Hydrops Fetalis (NIHF), fetal dönemde maternal alloimmünizasyon dışındaki nedenlerle deri altı ödem, plevral efüzyon, perikardiyal efüzyon ve asit birikimi bulgularından en az ikisinin görülmesiyle karakterize ölümcül bir patolojidir. NIHF'nin görülme sıklığı 1/1700-3000, mortalite oranını %50-98 aralıklarındadır. Tek gen mutasyonlarının NIHF'nin etiyolojisinin yaklaşık %85'ini oluşturduğu bilinmektedir ancak NIHF ilişkili genlerin ve mutasyonların listesi kesin olarak bilinmemektedir. Buna ek olarak, NIHF'nin moleküler etiyopatogenezi aydınlatılmamış, NIHF oluşumunda merkezi rol oynayan moleküller ve biyolojik süreçler tanımlanmamış ve NIHF'nin potansiyel alt grupları tespit edilmemiştir. Ayrıca, NIHF'ye özgü moleküler hedefli bir tedavi yöntemi bulunmuyor olup tüm dünyada NIHF tanılı gebeliklerin tıbbi müdahaleyle sonlandırılması önerilmektedir. Bu tez çalışmasının amacı, NIHF'nin monogenik genetik etiyolojisini derlemek ve bu gen listesini ve çeşitli in silico analiz yöntemlerini kullanarak NIHF ilişkili hücre sinyal yolağını belirlemektir. Bu kapsamda ilk olarak yapılan literatür taramasıyla 175 farklı gendeki toplam 415 tek gen varyasyonunun NIHF oluşumuna neden olduğu belirlendi. Bu gen listesiyle yapılan fonksiyonel zenginleşme analiziyle (FZA) NIHF oluşumunda rol oynayan ilk üç biyolojik süreçte Ras/MAPK sinyal yolağı, kas kasılması ve lizozom ilişkili proteinlerinin bulunduğu tespit edildi. Bunun ardından, NIHF proteinlerinin yaptığı 113 protein ve 229 bağlantıdan oluşan protein-protein etkileşimleri (PPE) ağı ve ağda merkezi konumda bulunan proteinler belirlendi. Son olarak, elde edilen FZA ve PPE verileri ile yolak veri tabanlarındaki ve literatürdeki veriler dikkate alınarak NIHF ilişkili hücre sinyal yolağı oluşturuldu. NIHF sinyal yolağı, NIHF'nin altı alt gruba ayrılabileceğini ve bunlardan organizasyon ve üye sayısına göre önce çıkan ilk üç alt grubun "FLT4/Ras/MAPK Sinyal Yolağı", "Ca+2 Sinyal Yolağı" ve "Biyoenjetik ve Metabolizma" olduklarını gösterdi. Sonuç olarak, bu tez çalışmasıyla NIHF'nin monogenik genetik etiyolojisini oluşturan genlerin ve mutasyonların listesi derlenmiş ve bu liste kullanılarak yapılan in silico analizlerle NIHF ilişkili hücre sinyal yolağı haritası ve NIHF'nin potansiyel alt grupları tespit edilmiştir.
Reseptörle etkileşen serin treonin kinaz 4 (RIPK4)'ü sürekli eksprese eden HaCaT hücre hattı oluşturulması
Deride koruyucu bariyer rolünü üstlenen epidermis çok katmanlı bir yapıdır. En alt katmanda bulunan bazal tabakadaki kök hücreler dermisten gelen komutla asimetrik bölünerek bazal tabakadan uzaklaşmaya başlar ve farklılaşarak subrabazal katmanları oluşturur. Epidermal farklılaşma olarak adlandırılan bu süreç çok hassas bir şekilde düzenlenirken süreç esnasında oluşabilecek bazı aksaklıklar konjenital anomalilere neden olabilmektedir. Reseptörle Etkileşen Serin Treonin Kinaz 4 (RIPK4), epidermal farklılaşmayı düzenleyen öncül proteinler arasındadır. Fonksiyonu ile ilişkili olarak patolojik RIPK4 varyasyonları konjenital ektoderm gelişim bozuklukları olan BartsocasPapas, Popliteal Pytergium, AEC-Like ve CHAND sendromları ile ilişkilendirilmiştir. Keratinosit hücre hatlarının kullanıldığı laboratuvar koşullarında epidermal farklılaşma süreci iki ila üç hafta arasındadır. Laboratuvar analizleriyle epidermal farklılaşmanın araştırıldığı çalışmalarda normal insan keratinositlerine (NHK) alternatif olarak büyüme koşulları daha kolay olan ölümsüz HaCaT insan keratinosit hücre hattı kullanılmaktadır. HaCaT hücrelerine çalışılmak istenen geni transfekte etmek oldukça zordur. Ayrıca, transfekte edilen HaCaT hücrelerinde istenilen genin ekspresyonu ancak birkaç gün sağlanabilir. Yaklaşık 14 gün süren epidermal farklılaşmanın araştırıldığı çalışmalarda ise incelenecek genin hücrelerde sürekli ekspresyonunun sağlanması gerekmektedir. Bu tez çalışması ile amaçlanan uzun süreli analizlerde kullanılmak üzere araştırılacak genin sürekli ekspresyonuna olanak veren transgenik HaCaT hücrelerini oluşturmak ve bu hücrelerde RIPK4'ün sürekli ekspresyonunu sağlamaktır. Bu amaç doğrultusunda ilk olarak Flp-InTM Sistemi kullanılarak istenilen genin HaCaT genomuna entegrasyonuna olanak veren FRT kaseti hücrelerin genomuna entegre edildi. FRT kasetinin genomda transkripsiyonel olarak aktif bölgeye tek kopya olarak yerleştiği ve hücrenin yaşamsal fonksiyonlarına etkilemediği doğrulandı. Sonrasında RIPK4 geni HaCaT genomuna yerleşmiş FRT kasetine entegre edilerek RIPK4'ü sürekli eksprese eden HaCaT hücreleri oluşturuldu. Oluşturulan bu hücreler ile epidermal farklılaşma süreci gibi uzun süreli hücresel süreçlerin çalışılacağı deneylerin tasarlanması mümkün olacaktır. Anahtar Sözcükler: Epidermal farklılaşma, Flp-In sistemi, HaCaT, Kalıcı Transfeksiyon, RIPK4.
Endoplazmik retikulum stresinin immün yanıtta ve immün regülasyonda rolünün araştırılması
Endoplazmik retikulum (ER), protein sentezi-modifikasyonuna, hücresel kalsiyum depolaması ile kalsiyum homeostazına ve lipid sentezine katkıda bulunan bir organeldir. ER homeostazını bozan fizyolojik ve patolojik faktörler endoplazmik retikulum stresine sebep olur ve hücre içinde farklı moleküler yolaklarla katlanmamış protein yanıtı başlatılabilir. Katlanmamış protein yanıtının birincil amacı, hücre sağ kalımı amacıyla ER homeostazını sağlamak için transkripsiyonel ve translasyonel programları başlatmaktır. ER stres sinyalleri üç sinyal proteini tarafından iletilir: ER transmembran sensör proteini (PRKR benzeri endoplazmik retikulum kinaz (PERK), aktive edici transkripsiyon faktörü 6 (ATF6) ve inositol gerektiren protein 1 (IRE1). Bu yolakların aktivasyonu sonucu genel protein sentezi zayıflatılır ve yanlış katlanmış proteinler yeniden işleme ve katlanmaya gönderilir. Şaperonların yeniden katlanmayı karşılayamadığı durumda, ER ile ilişkili bozulma yolağı protein katabolizması ERAD tetiklenir. Eğer, bu mekanizmalar da kronik ER homeostazını eski haline getiremezse, hücreler apoptozla ölür. ER stresi, hücre içi çeşitli fizyolojik fonksiyonların kontrolünde kritik roller oynar. ER stres yanıtının bozulması, edinilen bağışıklık yanıtlarının düzensizliği ile ilişkilidir. Katlanmamış protein yanıtının sensörlerinin, B ve T hücreleri ve diğer immün hücre türlerinin gelişiminde, farklılaşmasında, proliferasyonunda, sitokin ve antikor üretiminde rol oynadığını bilinmektedir. Farklılaşan immün hücrelerdeki ER stresini düzenlemek için, katlanmamış protein yanıtı ER'de yerleşik şaperonları ve sinyal yolaklarını aktive ettiği belirlenmiştir. Bunlardan, B hücrelerin plazma hücrelerine farklılaşması üzerine, yüksek düzeyde antikor sentezine uyum sağlamak amacıyla, ER kapsamlı XBP1 ekspresyonunun artmasıyla ilgili sonuçlar elde eden çalışmalar vardır. Önceleri, immünoglobulin sentezi ve katlanmamış immünoglobulin zincirlerinin birikmesi sonucu olarak XBP1 ekspresyonunun arttığı düşünülse de, sonraki araştırmalar, XBP1 indüksiyonunun immünoglobulin sentezinden önce B hücrelerde saptandığını göstermiştir. Ama plazma hücresi gelişiminde erken dönemde UPR aktivasyonunu yönlendiren faktörler tam olarak bilinmemektedir. İn vitro çalışmalar da, B hücresi farklılaşması sırasında katlanmamış protein yanıtıyla ilişkili proteinlerden XBP1'le beraber diğer, bağlayıcı-immünoglobulin proteini (BIP binding-immunoglobulin protein) (BiP) ve GRP94'ü ekspresyonunun değişimi gösterilmiştir. Bağışıklık yanıtları önemli ölçüde hücre içi sinyallere bağlıdır. Yapılan diğer çalışmalar UPR'ın, T hücresinin farklılaşması ve DC gelişiminde ve olgunlaşmasında da rol oynadığını göstermiştir. İnsan bağışıklık sisteminde, dalakta bulunan ve T bağımlı immün yanıtlarda önemli rol oynayan foliküler B hücrelerinde ER stresinin etkisi bilinmemektedir. Foliküler B hücreleri ER stresi altındayken T hücrelerinde etkisi olup olmadığı konusunda bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu literatür bilgileri doğrultusunda ER stresi ile indüklenmiş dalak foliküler B hücrelerinde ve onlarla ko-kültür yapılan T yardımcı hücrelerde hücre yüzey moleküllerinin ekspresyon değişikliğini araştırmayı amaçladık. Bu amaçla in vitro koşullarda dalak örneğinden elde edilen hücre süspansiyonundan manyetik boncuk yöntemine dayalı B ve T hücre izolasyonu yapıldı. İzole edilen B hücrelerinde ER stresi oluşturmak amacıyla TG uygulanmıştır. ER stresi indüklenen B hücrelerle T hücre ko-kültür yapıldı. Kültür ortamında hücrelerde TG etkisine ve zamana bağlı gerçekleşen fenotipik değişkenlikleri değerlendirmek amacıyla akım sitometri yöntemiyle monoklanal antikorlar kullanarak hücre yüzey molekülleri değerlendirildi. Anahtar kelimeler: ER stres, katlanmamış protein yanıtı, foliküler B lenfositler, foliküler yardımcı T lenfositler
CCDC84'ün RNA kırpılması (Splicing) sürecindeki rolünün araştırılması
Ökaryotlarda pre-mRNA'ların olgun mRNA'lara dönüşmeleri için yapılarında yer alan intronların çıkartılması ve ekzonların birleştirilmesi gerekmektedir. RNA Kırpılması (Splicing) olarak adlandırılan bu süreç, küçük ribonükleoprotein komplekslerden oluşan splaysozom ile yürütülmektedir. Her bir snRNP bir küçük RNA ve kor protein olarak adlandırılan proteinlerden oluşmaktadır. Splaysozomun yapılanmasında, snRNP'lerin yapısındaki kor proteinlerle birlikte 300'den fazla farklı proteinin görev aldığı bilinmekle birlikte bu proteinlerin fonksiyonları ve RNA kırpılmasının tam olarak nasıl gerçekleştiği bilinmemektedir. Splaysozomda yer alan snRNP'lerin kor bileşenleri ve yapılanmalarını yöneten proteinleri kodlayan genlerin bir kısmının mutasyonları hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Grubumuz tarafından Microcephalic Primordial Dwarfism ile ilişkilendirilen ve RNA kırpılması sürecinde yer aldığı gösterilmiş olan CCDC84'ün fonksiyonu hakkında sınırlı bilgi bulunmaktadır. Bu tez çalışması kapsamında, CCDC84'ün fonksiyonunu aydınlatmaya yönelik olarak in vivo ve in vitro etkileştiği proteinlerin immünblot ve immünfloresan yaklaşımlarıyla aydınlatılması, eksikliğinin Cajal cisimciği oluşumu üzerine etkisinin immünfloresan yaklaşımıyla gösterilmesi, CCDC84'ün eksikliğinde RNA kırpılmasının fonksiyonu üzerine etkisi minigen ve RT-PCR ile belirlenmesi hedeflendi. Sonuç olarak, CCDC84'ün SART3 ile doğrudan etkileştiği, bu etkileşimin SART3'ün RNA bağlanma motifleri üzerinden olduğu, tri-snRNP yapılanmasının erken aşamalarında yer aldığı, eksikliğinde Cajal cisimciklerin yapı ve sayısında değişiklik olmadığı, minör intronların bir kısmının kırpılmasının bozulduğu görüldü. Elde ettiğimiz bu veriler, hem U2 tip hem de U12 tip tri-snRNP'nin yapılanmasında kritik rol oynayan SART3'ün U12 tip tri-snRNP yapılanmasına CCDC84 tarafından yönlendirildiğini işaret etmektedir.
Golgi stresinin foliküler T ve B hücre yüzeyinde HLA-G ekspresyonuna etkisinin araştırılması
Tez çalışmasının amacı foliküler B hücresinde Brefeldin A muamelesi ile meydana getirilen Golgi stresinin MHC Sınıf-II ve non-klasik HLA-G moleküllerinin ekspresyonuna etkisinin ve foliküler B hücresinde oluşturulan bu stresinin T foliküler yardımcı (Tfh) hücrelerin yüzeyindeki ve B hücre yüzeyindeki HLA-G molekülünün ekspresyonuna etkisini araştırmaktır. Nakillerde stres altında kalan adaptif immün sistem hücrelerinin yanıtlarına ve greft doku işlevselliğine ışık tutacak bulguların elde edilmesi amaçlandı. İmmün sistem kendinden olanı ve olmayanı tanıyarak yabancı antijenleri "Major Histokompatibilite Kompleksi (MHC)" ile T hücrelerine sunar. MHC molekülleri Sınıf I, II, III ve IV olmak üzere 4 sınıfa ayrılır. Sınıf-I MHC (HLA-A, -B, -C) ve Sınıf-II MHC (HLA-DR, -DP, -DQ) moleküllerinin birincil görevi antijen sunumuna katılmaktır. Klasik olmayan Sınıf-I MHC (HLA-E, -F, -G) molekülleri ise immünomodülatör moleküllerdir. Sınıf-I MHC molekülleri CD8+ sitotoksik T hücrelere, Sınıf-II MHC molekülleri ise CD4+ yardımcı T hücrelerine antijen sunarlar. B hücreleri aktive olduktan sonra MHC Sınıf-II moleküllerinin ekspresyonlarını arttırarak antijen sunan hücre görevi görebilirler. MHC Sınıf-II peptid kompleksi CD4+ T hücrelerine antijen sunmak için hücre yüzeyine taşınır. Non-klasik Sınıf-I HLA-G molekülleri bağışıklık sisteminin modülasyonunda görev alır. HLA-G için reseptör görevi üstlenen immünglobülin benzeri transkript 2 (ILT2: Ig-Like Transcript 2) B hücreleri, T hücreleri, NK (Natural Killer) hücreleri, dendritik hücreler ve diğer bağışıklık hücreleri tarafından eksprese edilir. ILT2'nin ligandları ile etkileşimi, T ve B hücrelerinin fonksiyonunu baskılar. Alıcı (konak), greft dokuyu yüzeyinde bulunan MHC molekülleri aracılığı ile tanır. Golgi, proteinlerin ve lipidlerin alınmasında, işlenmesinde, paketlenmesi ve taşınmasında merkezi bir rol oynar. Brefeldin A Golgi için bir stres indükleyicisidir ve golgi stres yolaklarını aktive edip golginin yapısının bozulmasına neden olarak protein taşınmasını bloke eder. Bu çalışma 3 farklı kişiden alınan sekonder lenfoid doku örneklerinin (dalak örnekleri) kullanıldığı deneysel bir çalışmadır. Dalak örneklerinden manyetik boncuk yöntemi ile T hücre ve B hücre izolasyonu yapıldı. T:B hücre ko-kültürü yapılarak akım sitometri yöntemi ile 0. saat immünfenotipleme çalışması yapıldı. B hücrelerinde Brefeldin A ile muamelesi ile golgi stresi indüklendi. B hücrelerde golgi stresi immünohistokimya yöntemiyle anti-GM130 boyaması yapıldıktan sonra immünfloresan mikroskopta görüntülenmesi ve akım sitometri yöntemi ile HLA-DR ekspresyon oranının değişiminin belirlenmesi ile gösterildi. Hücre kültürü yöntemi ile T:B hücre ko-kültürü yapıldı ve steroid muamelesi uygulandı. Hücre kültüründe zamana (6/12/24. saat), golgi stresine ve steroid etkisine bağlı olarak Tfh hücreler ile foliküler B hücrelerinin hücre yüzey belirteçlerinin değişimleri akım sitometri yöntemiyle değerlendirildi. B hücrelerinde Brefeldin A muamelesi ile oluşturulan golgi stresine bağlı olarak MHC Sınıf-II molekülü (HLA-DR) ekspresyonun azaldığı, steroid muamelesiyle Tfh hücre ve B hücre yüzeyinde HLA-G ekspresyonunun arttığı saptanmıştır. Anahtar Kelimeler: HLA-G, foliküler B hücre, T foliküler yardımcı hücre, Golgi stresi
Over kanseri hücrelerinde DNA hasarı ve golgi stresine yanıtta apoptotik mekanizmaların araştırılması
Over kanseri, metastatik aşamada tanı konması ve gelişen kemoterapi direnci nedeniyle tüm jinekolojik kanserler arasında mortalite oranı en yüksek olan kanser türüdür. Tümörün cerrahi olarak çıkarılmasına ve platin bazlı kemoterapiye rağmen, birçok over kanseri hastası kanser tekrarlaması nedeniyle hastalığa yenik düşmektedir. Bu nedenle, over kanseri hastalarının prognozunu iyileştirmek için yeni tedavi stratejileri esastır. Replikasyon stresi over kanserinin yaygın bir özelliğidir ve ATR/CHK1 sinyallemesi hücreleri replikasyon stresine karşı korumada öncelikli olarak rol oynar. ATR inhibitörünün tekil uygulamaları olmakla birlikte kombine tedavi uygulamalar da spesifik hedefler olarak etkinlik gösterirler. Over kanserlerinde ATR inhibitörleri birçok çalışmada kombine olarak mitokondriyal hücre ölüm yolaklarını aktive etse de çalışmalar kısıtlı kalmaktadır. Bu tez çalışmasıyla over kanseri hücrelerinde etkinlik gösterebilecek yeni bir moleküler kombinasyon tedavisinin, hem de bu kombinatoryal uygulamanın moleküler çalışma mekanizmalarının bulunması hedeflenmiştir. Yüksek verimli küçük molekül tarama analizini kullanarak, over kanseri hücrelerinde en etkili hücre ölümü indükleyen kombinasyon olarak AZD6738 (ATR inhibitörü) /Brefeldin A (Golgi stres indükleyicisi) belirlenmiştir. Deneysel çalışmalar ile AZD6738/Brefeldin A'nın eş zamanlı uygulanması, SKOV3 (***p<0.001, kontrol vs AZD6738+BFA) ve IGROV1 (**p<0.01, kontrol vs AZD6738+BFA) over kanseri hücrelerinde kaspaz-3 ve kaspaz-9 aktivasyonu ile apoptotik hücre ölümüne neden olmaktadır. AZD6738/Brefeldin A maruziyeti ayrıca sitozole sitokrom c translokasyonunu da indükler; bu, mitokondriyal hücre ölüm yolunun karakteristik bir özelliğidir. Buradaki en önemli moleküler süreç, SKOV3 ve IGROV1 hücrelerinde AZD6738/Brefeldin A'nın kombinatoryal kullanımı, anti-apoptotik BCL-2 ailesi üyeleri BCL-2, BCL-XL ve MCL1'in ifade seviyelerinde azalmaya yol açarken, özellikle BIM ve PUMA olmak üzere pro-apoptotik BCL-2 proteinlerinin ifade seviyelerinde artışa neden olur. Tüm bu bulgular, AZD6738/Brefeldin A'nın over kanseri için potansiyel bir tedavi yaklaşımı olduğunu düşündürmektedir.
Osteoartritte kondrosit dejenerasyonuna neden olan ölüm yolaklarında taurinin etkisi
Osteoartrit (OA), dünya genelinde 250 milyondan fazla insanı etkileyen ve özellikle yaşlı nüfusta sık görülen kronik, ilerleyici bir eklem hastalığıdır. OA, önemli ölçüde morbidite ve yaşam kalitesinde düşüşe yol açması nedeniyle, gelişmiş ülkelerde gayri safi milli hasılanın %2'sini aşan sağlık harcamalarına neden olmaktadır. Bu nedenle, OA tedavisine yönelik yeni ve etkili yaklaşımlar üzerine çalışmalar büyük ilgi görmektedir. Güncel araştırmalar, OA patogenezinde eklem kıkırdağının dejenerasyonu ve kronik inflamasyonun ana faktörler olduğunu göstermektedir. Eklem kıkırdağı, hücre dışı matriks (ECM) ve kondrositlerden (kıkırdak hücreleri) oluşur. Eklem kıkırdağındaki tek hücre tipi olan kondrositler, sağlıklı kıkırdak yapısının ve eklem hareketliliğinin korunmasından sorumlu oldukları için OA tedavisinde hedef hücreler olarak kabul edilir. Hücre ölümü, morfolojik temelde üç ana tipe ayrılır: apoptoz, otofajik hücre ölümü ve nekroz/nekroptoz. Bu üç hücre ölümü yolu arasındaki etkileşimin net olarak anlaşılması, OA tedavisinde önemli bir adım olabilir. Taurin, özellikle uyarılabilir dokulardaki hücrelerde yüksek konsantrasyonlarda bulunan yarı esansiyel bir β-amino asittir. Memelilerde birçok fizyolojik işlevi olan taurin, araştırmacılar için en dikkat çekici özelliği hücre koruyucu (sitoprotektif) etkileridir. Bununla birlikte, taurinin OA üzerindeki etkileri konusunda sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Bu çalışmanın amacı, taurinin OA patogenezi üzerindeki etkisini ve bunun otofaji/ apoptoz/nekroptoz ile ilişkisini göstermektir. Kelgren-Lawrence Sınıflandırmasına göre evre 3 OA tanısı alan ve total diz replasman cerrahisi yapılan hastalardan cerrahi sırasında alınan sağlıklı ve osteoartritik kondrositler kültüre edilmiş; daha sonra taurin, apoptoz inhibitörü Z-vAD, nekropitoz inhibitörü necrostatin-1 (Nec-1) kullanılarak oluşturulan deney gruplarında uygun doz ve süreler belirlenmiştir. Otofaji belirteci Beclin1 ve p62 (SQSTM1, Sequestosome-1), nekroptoz belirteci Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 3 (RIP3), apoptoz belirteci Bcl-2-associated X protein (Bax) ve B-cell leukemia/lymphoma 2 protein (Bcl-2) ve kondrosit yapısal geni aggrecanın ifadelenmelerini saptamak amacı ile ters transkripsiyonlu kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR); kondrosit belirteci kolajen 2, otofaji belirteçleri light chain 3 I/II (LC3I/II), p62 ve Bcl-2 interacting protein 1 (Beclin 1) ile apoptoz belirteçleri olan Kaspaz 3 ve Poly [ADP-ribose] polymerase 1 (Parp1) ifadelenmesi Western Blot yöntemi ile analiz edilmiştir. Taurin Nec-1 ile kombinasyon halinde uygulandığında hücre canlılığını arttırıcı etkiler göstermiştir. RT-qPCR analizleri, bu grubun daha yüksek aggrekan düzeylerine sahip olduğunu göstermektedir. Kollajen 2 ölçümleri incelendiğinde, yine bu grupta en yüksek seviyede olduğu görülmektedir. Bu durum, nekroptoz inhibisyonunun kıkırdak metabolizması üzerindeki potansiyel koruyucu etkilerini ortaya koymaktadır. Bu bulgular, taurin ve Nec-1 kombinasyonunun OA tedavisinde umut verici bir yaklaşım olabileceğini düşündürmektedir.
Sağlıklı ve osteoartrit'li kondrositlerde mitohormetik adaptasyonun inflamatuar strese karşı oluşan yanıt üzerine etkisi; in-vitro çalışma
Osteoartrit (OA); kronik ağrı ve hareket kısıtlılığına neden olan, dünya çapında en sık görülen kas-iskelet sistemi hastalığıdır. Her geçen gün artan kanıtlar mitokondriyonun OA patogenezinde rol oynadığını göstermektedir. Bozulmuş mitokondri fonksiyonları ve mitokondriyal kalite kontrol mekanizmalarının OA patogenezinde yer alan senesens ve kondrosit apoptozuna katkıda bulunarak OA'in ilerlemesine neden olur. Mitohormesis; ölümcül olmayan mitokondrial stresin hormetik yanıtı tetikleyerek hücrenin oksidatif strese karşı direncini arttırdığını ön koşullamayı ifade etmek için kullanılmaktadır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda mitokondrial stres yolaklarının ile hormetik mekanizmanın aktive edilmesinin yaşam süresini uzattığının gösterilmesi bu alana olan ilgiyi her geçen gün arttırmaktadır. Dünya çapında yaygın olarak kullanılan anti-hiperglisemik ajan olan "Metfomin"'in faydalı etkilerini mitokondiyal elektron taşıma zincirinin kompleks-1 aktivitesini inhibe ederek ve böylece oksidatif stresi arttırıp adaptasyon mekanizmalarını tetikleyerek gösterdiği düşünülmektedir. Bu çalışmanın amacı, literatürde ilk defa osteoartritli ve sağlıklı kondrositlerin mitohormetik ön koşullama sonrasında inflamasyona direnç kazanıp kazanmadığı incelenmiştir. Kelgren-Lawrence Sınıflandırmasına göre evre 3 OA tanısı alan ve total diz replasman cerrahisi yapılan hastalardan cerrahi sırasında alınan sağlıklı ve osteoartritik kondrositler kültüre edilmiş ve sonrasında metformin aracılığıyla elektron transport zinciri elemanlarından kompleks 1 inhibe edilerek oksidatif stres indüklenmiştir. Hücre canlılığı ile yapılacak olan uygulamaların toksik doz ve süreleri MTT testi ile değerlendirildikten sonra, mitohormetik yanıtta rol oynayan FGF21, SOD2, Nrf2, mitokondriyal katlanmamış protein yanıtı elemanları ATF4, Lonp1, Trap1 ve Hsp10, apoptoz belirteçleri olan Caspase3 ve Parp1 ifadelenmesi Western Blot yöntemi ile analiz edilmiştir. Reaktif oksijen ürünlerinin (ROS) miktarındaki değişimler ise ROS analizi ile değerlendirilmiştir. Metformin ön koşullaması, OA'li kondrositlerde IL-1β ile indüklenen inflamatuar mikro çevrede oksidatif strese karşı mitokondriye spesifik SOD2 sentezini artırarak ROS seviyelerini düşürmektedir. Bu süreç sonucunda tetiklenen mitohormetik adaptasyon, inflamatuar stres karşısında ER stres yanıtı ile koordineli şekilde "Entegre Stres Yanıtı" üzerinden mtROS-PERK-eIF2α-ATF4-FGF21 yolunu aktifleştirmektedir. Metformin ön koşullaması sonrasında oluşan yeni inflamatuar strese karşı OA'li kondrositler daha güçlü bir yanıt vererek hayatta kalma yönünde adaptif bir davranış sergilemektedir. Böylece, metformin ön koşullaması, OA'li kondrositlerde mitohormetik yanıtı tetikleyerek bu hücreleri gelecekte karşılaşacakları inflamatuar streslere karşı daha dirençli hale getirmekte ve hayatta kalmalarını sağlamaktadır.
Sıçanlarda, metformin ile ön koşullamanın, hepatik iskemi-reperfüzyon hasarı modelinde mitokondriyal katlanmamış protein cevabı mekanizmalarının araştırılması
Hepatik iskemi-reperfüzyon hasarı (H-IRH), karaciğer transplantasyonu sonrası alıcıda karaciğere kan akışının durması ve sonrasında yoğun bir şekilde tekrar sağlanabilmesi ile gerçekleşen anomalileri tanımlar. H-IRH, hücresel düzeyde mitokondrinin olumsuz etkilenmesine neden olur. Bu nedenle, IRH'nin modellenmesi ile mitokondriyal süreçlerin nasıl etkilendiğinin belirlenmesi, doku reddinin mekanizmalarının anlaşılması ve olası terapi yöntemlerinin açığa çıkartılması açısından oldukça önemlidir. Mitokondri, stres koşullarına bağlı olarak hücre ölümü başta olmak üzere enerji metabolizmasının ve hücre ölümünün regülasyonu gibi hücresel cevaplar yaratır. Ancak, hücre sağkalımı için tetikleyebileceği sinyal yolakları, stres koşuluna adaptasyonu sağlayabilir. Mitokondriyal stres adaptasyon yolaklarından bir tanesi de katlanmamış protein cevabıdır (KPC). Mitokondride gerçekleşen KPC (KPCmt), stres koşuluna bağlı olarak mitokondriyal protein üretiminin durdurulmasını ve hatalı katlanmış proteinlerin eliminasyonunu kapsamaktadır. Fakat, H-IRH'de KPCmt'nin nasıl düzenlendiğine dair bilgiler sınırlıdır. Sunulan çalışma, sıçanda H-IRH'nin modellenmesi ile KPCmt yolağının nasıl etkilendiğinin ve IRH öncesi metformin ön koşullamasının bu süreci değiştirip değiştirmediğinin moleküler düzeyde açığa çıkartılması hedeflenmiştir. Bu amaçla, Wistar albino cinsi 30 sıçan optimal IRH modelleme ve metformin ön koşullama işlemleri için 10'ar denekten oluşacak şekilde 3 gruba ayrılmıştır. Grubumuzun önceki çalışmalarında elde ettiği bilgiler doğrultusunda, modelleme süreleri 45 dk iskemi, 6 saat reperfüzyon ve 7 gün metformin ön koşullama olarak belirlenmiştir. Modellemeler sonrası hipoksik ve inflamatuar süreçler biyokimyasal ve morfolojik metotlarla takip edilmiştir. Süreçler sonunda, belirlenen sürelerde AST (p<0,0001), ALT (p<0,0001), TNFα (p=0,02), ROS (p<0,0001), TOS (p=0,004) ve MPO (p=0,016) seviyeleri, IRH modellemesi ile artış göstermiştir. GSH (p=0,0009) ve ATP (p<0,0001) seviyeleri modelleme ile azalış göstermiştir. Metformin ön koşullaması ile IRH modelleme sonucu artan AST (p<0,0001), ALT (p<0,0001), ROS (p=0,0045) ve TOS (p=0,019) seviyeleri anlamlı bir şekilde azalmıştır. Western blot ile protein analizlerinde, IRH modellemesinin hipoksi belirteci olan HIF1A seviyelerini anlamlı bir şekilde (p=0,016) arttırarak bu sonuca neden olabileceği gösterilmiştir. Fakat, metformin ön koşullamanın IRH modelleme ile artan HIF1A seviyelerini anlamlı olarak (p=0,042) azaltarak, modellemenin etkisini azalttığı görülmüştür. Ayrıca, modelleme ile KPCmt belirteçleri olan ATF5 (p=0,015) ve CHOP (p=0,0008) seviyeleri artış göstermiştir. ATF5 ve CHOP seviyelerindeki artış CLPP (p=0,0009), HSP10 (p=0,016), HSP60 (p=0,001) ve HSP70 (p=0,005) proteaz ve şaperonların ekspresyon seviyelerini de arttırarak KPCmt'yi başlatmıştır. Metformin ön koşullaması ise IRH modelleme ile ekspresyon düzeyleri artan ATF5'e etki etmezken CHOP (p=0,0005), CLPP (p=0,006), HSP10 (p=0,029), HSP60 (p=0,005) ve HSP70 (p=0,043) seviyelerini anlamlı bir şekilde azaltmıştır. Bu durum, metforminin IRH ile indüklenen KPCmt'yi inhibe ettiğini göstermektedir. Bu nedenlerle, karaciğer transplantasyonu öncesi alıcıda metformin uygulamasının doku reddini önleyebileceği düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: Karaciğer transplantasyonu, Mitokondriyal katlanmamış protein cevabı, Metformin ön koşullama
Sıçanlarda metforminle önkoşullamanın, hepatik iskemi reperfüzyon hasarı modelinde mitokondriyal dinamiğe etkisi
Amaç: Bu çalışmada, metformin ile yapılan önkoşullamanın sıçanlarda oluşturulan hepatik iskemi-reperfüzyon hasarı (HİRH) modelinde mitokondriyal dinamikler üzerindeki etkilerinin araştırılması amaçlandı. Yöntem: Otuz adet Wistar Albino sıçan rastgele üç gruba ayrıldı: Sham, HİRH, Metformin + HİRH. İskemi, hepatik pedikülün 45 dakika süreyle klampe edilmesiyle oluşturuldu ve ardından 6 saat reperfüzyon uygulandı. Metformin grubuna, cerrahiden önceki 7 gün boyunca orogastrik gavajla 300 mg/kg dozunda metformin verildi. Bulgular: HİRH grubunda karaciğer hasarı belirgin olup, ALT, AST, TNF-α düzeyleri artmış; ATP düzeyleri azalmıştır. Metformin ile önkoşullanmış grupta HİRH şiddetinin daha düşük olduğu gözlenmiştir (p<0.05). Karaciğer hasarı metformin önkoşullaması ile anlamlı şekilde azalmıştır. Mitokondriyal dinamik protein analizlerinde, HİRH grubunda Fis1 ve Drp1 artarken MFN1, MFN2 ve OPA1 azalmıştır. Metforminle önkoşullama, bu değişiklikleri anlamlı şekilde sınırlamıştır. Sonuç: Metformin ile yapılan önkoşullama, HİRH'nı sınırlamada etkili olmuş; oksidatif stres, inflamasyon ve mitokondriyal disfonksiyonu sınırlamıştır. Bu etkiler, mitokondriyal fizyonu baskılayıp füzyonu artırmasıyla ilişkilidir. Metformin, mitokondriyal dinamiklere etkisi ile, karaciğer hücrelerini HİRH'na karşı koruyucu potansiyel bir ajan olabilir.
Otozomal resesif non-sendromik işitme kayıplı bireylerde GJB2 gen mutasyonlarının SSCP ve DNA dizi analizi ile belirlenmesi
Non-sendromik otozomal resesif konjenital işitme kaybının büyük bir kısmına GJB2 (Connexin 26) mutasyonlarının neden olduğu bugüne kadar yapılan çeşitli toplum çalışmalarında gösterilmiştir. 35delG mutasyonu beyaz ırkta görülen en yaygın GJB2 mutasyondur. GJB2 mutasyonlarının Türk toplumundaki sağırlık üzerinde olan etkisini belirlemek için non-sendromik otozomal resesif konjenital işitme kayıplı ve akraba olmayan 96 hasta tarandı. 35delG mutasyonu, geliştirdiğimiz yarışmalı amplification ferfactory mutation system (C-ARMS) ile gösterildi. Diğer GJB2 mutasyonları single strand conformation polymorphism (SSCP) ve silver sequencing analizi ile belirlendi. Şiddetli ve derin işitme kayıplı 28 hastada altı farklı mutasyon görüldü. 35delG mutasyonu en yaygım olup mutant GJB2 allellerinin %76.8'ini oluşturmaktaydı. Birden fazla allelde görülen W24X, 310dell4 ve delE120 mutasyonlarının rölatif sıklıkları sırasıyla %10.7, % 5.4 ve %3.6 idi. Ayrıca iki bireyde 35delG ile kompaund heterozigot olarak iki yeni missense mutasyon (P173S ve Q80K) tanımlandı. Bizim sonuçlarımız, otozomal resesif non-sendromik konjenital işitme kayıplı Türk hastalarının %29'una GJB2 mutasyonlarının neden olduğunu göstermiştir. Anahtar Kelimeler: Non-sendromik işitme kaybı, GJB2, DFNB1, Connexin 26, 35delG
İnsan kronik myeloblastik lösemi hücre dizisi K562'de imatinibin ve silimarinin BCR-ABL1, GRB2, GAB2, AKT ve ERK gen ifadelenmelerine olan etkisinin değerlendirilmesi
KML'nin moleküler patogenezinde Philadelphia (Ph) kromozomu üzerindeki BCR-ABL1 füzyon geni rol oynar. Oluşan füzyon protein AKT, ERK ve STAT yolaklarını aktive eden bir tirozin kinaz kodlarken bu proteinin modülatörleri GRB2 (Growth factor receptor-bound protein 2) ve GAB2 (Grb-2-associated binder 2)'dir. KML tedavi protokolünde yer alan STI571 (imatinib mesilat), tirozin kinaz özelliği olan bu enzimin ATP-bağlayıcı bölgesine kompetitif inhibisyonla bağlanır. BCR-ABL1 sinyal iletiminde görevli proteinlerin tirozin fosforilasyonu inhibe olur. Bu çalışmada, insan KML hücre dizisi K562 hücrelerinde STI571 uygulaması ile birlikte bitkisel bir flavonoid olan silimarin uygulamasının hücre içi sinyal yolakları üzerine etkisinin belirlenmesi hedeflenmiştir. K562 hücre dizisi RPMI besiyerinde %5'lik CO2, %95 nem içeren 37 0C'lik inkübatörde çoğaltıldı. STI571 sitotoksik dozu MTT testi ile belirlendikten sonra hücrelere STI571, silimarin, STI571 ve silimarin kombinasyonu birlikte uygulandı. Kontrol grubu olarak kullanılacak hücre grubuna hiçbir uygulama yapılmadı. Belirlenen doz ve uygulama süreleri sonunda tüm hücrelerden mRNA izolasyonu yapıldı ve bunu takiben cDNA elde edildi. BCR-ABL1, GRB2, GAB2, AKT ve ERK genlerinin ifadelenme düzeyleri real-time PCR yöntemi ile belirlendi. Sonuç olarak imatinib ve silimarin kombinasyonu uygulanan K562 hücrelerinde GAB2 ve ERK gen ifadelenme düzeylerinin azaldığı tespit edildi. Diyete ek olarak alınan silimarin aracılığıyla KML hücrelerinde imatinibin etkinliğinin artırılabileceğinin gösterilmesi ilaç dirençliliğinde rol oynayan sinyal moleküllerinin baskılanabileceğini akla getirmektedir. Bunun ileride yapılacak klinik çalışmalara ışık tutabileceğini düşünüyoruz. Anahtar Kelimeler: Kronik myeloid lösemi, silimarin, imatinib, BCR-ABL1, GRB2, GAB2, AKT, ERK
Genisteinin kronik myeloblastik hücre dizisinde sinyal yolaklarına olan etkisinin değerlendirilmesi
Kronik myeloid lösemi (KML) malign klonal hematopoetik kök hücre hastalığıdır. Moleküler patogenezinde Philadelphia (Ph) kromozomu üzerindeki BCR-ABL1 füzyon geni rol oynar. Oluşan füzyon proteini tirozin kinaz kodlar ve bu tirozin kinaz AKT, ERK, STAT yolakları üzerinde etkili olup modülatörleri GAB2 ve GRB2'dir. KML tedavi protokolünde yer alan STI571 (imatinib mesilat, Gleevec™), tirozin kinaz özelliği olan bu enzimin ATP-bağlayıcı bölgesine yarışmalı inhibisyonla bağlanır. Genistein; östrojenik özeliğinin yanı sıra tirozin kinaz inhibitör aktivitesine sahip olan bitkisel bir flavonoiddir. Bu çalışmada, insan KML hücre dizisi K562 hücrelerine STI571 uygulaması ile birlikte genistein uygulamasının hücre içi sinyal yolakları üzerine etkisinin protein seviyesinde belirlenmesi hedeflenmiştir. K562 hücre dizisi %5'lik CO2, %95 nem içeren 37oC'lik inkübatörde çoğaltıldı. STI571 ve genisteinin sitotoksik dozu MTT testi ile belirlendi. STI571 ve genisteinin etkileri 24 ve 48 saat periyotlarla değerlendirildi. Hücrelere STI571, genistein, STI571 ve genistein kombinasyonları birlikte uygulandı. Kontrol grubu olarak kullanılan hücre grubuna bir uygulama yapılmadı. Tüm gruplarda protein düzeyleri ELISA metoduyla belirlendi. Sonuçlar uygun istatiksel yöntemlerle değerlendirildi. Verilerimiz toplu halde değerlendirildiğinde STI571 ve genisteinin tek başına ya da birlikte uygulanması ile protein düzeylerinde anlamlı bir değişikliğe neden olmadığı belirlendi. Bu çalışmada ilk kez genisteinin STI571 ile birlikte etkileri bir protein paneli üzerinde değerlendirilmiştir. STI571'in ve genisteinin tirozin kinaz inhibitörü özellikleri bilinmektedir. Ancak her iki ajanın protein düzeyleri üzerine etkilerini inceleyen çalışmalarda tartışmalı sonuçlar mevcuttur. Biz de STI571 ve genisteinin tek başına ve birlikte kullanımıyla bu tartışmalı konuya açıklık getirmeyi hedefledik. Sonuçlarımıza göre her iki ajanın birlikte kullanılmasının protein düzeyleri açısından anlamlı bir fark oluşturmadığını gösterdik.
Karaciğer iskemi reperfüzyon modelinde karaciğer ve uzak organ hasarında endoplazmik retikulum stresinin rolü
Amaç: Karaciğer iskemi/reperfüzyon hasarı, pringle manevrası gerektiren karaciğer cerrahisinde ve karaciğer transpantasyonunda geçici iskemi ve sonrasında dolaşımın tekrar sağlanmasıyla oluşmaktadır. Reperfüzyon sırasında açığa çıkan serbest oksijen radikalleri iskemi/reperfüzyon hasarında önemli rol oynamaktadır. Ortaya çıkan bu serbest radikallerin de etkisiyle endoplazmik retikulumda biriken katlanmamış ya da hatalı katlanmış proteinler sonucu endoplazmik retikulum stresi tetiklenmektedir. Bu tez kapsamında karaciğerde oluşan hasarla birlikte hem karaciğerde hem de akciğer, böbrek, beyin gibi uzak organlardaki endoplazmik retikulum stresinin varlığının ve hücre ölümü üzerindeki rolünün araştırılması amaçlanmaktadır. Gereç ve yöntem: Çalışmamızda ağırlıkları 180-300 gr arasında değişen 15 adet Wistar Albino cinsi erişkin erkek sıçan kullanıldı. Sıçanlar rastlantısal olarak 3 gruba ayrıldı. Grup 1: İskemi/reperfüzyon: Sıçanlar, orta hat insizyonu ile açılarak karaciğere giden hepatik portal ven ve hepatik arter bulldog klemp ile kapatıldı. 60 dk iskemi süresi sonunda, 60 dk reperfüzyona bırakılmışdı. 60 dk'nın sonunda ise sıçanlar sakrifiye edilip karaciğer, akciğer, böbrek ve beyin dokuları alındı. Dokuların bir kısmı patoloji için yüzde 10'luk formaldehitde saklanıp diğer kısımları ise RNA izolosyonu için, RNAlater'da saklanıp -80 C ye kaldırıldı. Grup 2: Sham: sıçanlar yine orta hat insizyonu ile açılarak 120 dk bekletilip, yine patoloji ve RNA izolasyonu için karaciğer, akciğer, beyin ve böbrekleri alındı. Grup 3: Kontrol: Bu gruptaki sıçanlara hiçbir işlem uygulanmayıp, yine karaciğer, akciğer, beyin ve böbrek dokuları patoloji ve RNA izolasyonu için alındı. Toplanan tüm dokulardan, bir kısmı immünohistokimyasal incelemeler için %10'luk formaline alındı. Bir kısmı ise RNA izolasyonu için kullanıldı. Elde edilen RNA'lar cDNA'ya çevrilip, light cycler 480 cihazında ER stres genleri olan GRP78, PERK, ATF6 ve CHOP ifadelenmelerine bakıldı. Sonuçlar istatiksel olarak student- t testi ile değerledirildi. p≤ 0.05 anlamlı olarak kabul edildi. Bulgular: Karaciğer, akciğer, böbrek ve beyinde ER stres gen ifadelerinde sham grubuna göre belli oranda bir artış gözlenirken istatiksel olarak anlamlı bulunamadı. Karaciğerde ATF6, PERK ve CHOP genlerinde, aynı zamanda akciğer, böbrek ve beyinde CHOP ifadelenmelerinde istatiksel olarak anlamlı bir artış görüldü. Ayrıca immünohistokimyasal incelemeler sonucunda İskemi/reperfüzyon grubunda, hepatosit kordonlarında daralma ve hepatoselüler kayıp ile karakterize parankim hücre zedelenmesi ve nötrofil lökosit infiltrasyonu görüldü. Sonuç: Karaciğer I/R hasarı sonrası karaciğer yanı sıra akciğer, böbrek ve beyin gibi uzak organlarda ER stresinin etkisi gözlendi. Bunun sonucu olarak ER stresinin I/R hem lokal hem de uzak organlarda etkili bir rol oynadığı ve bu stresi azaltmak adına yapılacak olan çalışmalara ışık tutacaktır.
İnverted papillom ve sCC olgularında gen ifadelenme profili
Bu çalışma sinonazal inverted papillom (IP) ile IP'un sinonazal skuamoz hücreli karsinoma (SCC) dönüşümünde, ribonükleik asit (RNA) düzeyinde ifadelenmesi değişen genleri belirlemeyi hedeflediğimiz deneysel bir çalışmadır. Başkent Üniversitesi Tıbbi Biyoloji, Tıbbi Genetik, Kulak Burun Boğaz, Patoloji Anabilim Dalları ve Dr. Abdurrahman Yurtaslan Ankara Onkoloji Eğitim ve Araştırma Hastanesi Patoloji ve Kulak Burun Boğaz Anabilim Dalları katkısı ile yapıldı. Son beş yıl içerisinde IP, sinonazal SCC ve konka hipertrofisi tanısı konulmuş, 18 yaş üzeri 16 hastanın (6 IP, 5 sinonazal SCC, 5 konka hipertrofisi) parafine gömülmüş dokusundan (FFPE) ticari kit ile RNA izolasyonu yapıldı. Uygun ve yeterli miktarda RNA kullanılarak mikroarray yöntemi ile her üç dokunun gen ekspresyon profillerine yönelik tüm genoma ait bir bilgi elde edildi. Bu bilgi analiz programları kullanılarak üç doku arasında karşılaştırıldı. IP ve sinonazal SCC dokuları kıyaslandığında ekspresyonu anlamlı değişim gösteren şu genler tespit edildi: CYP3A7, KRT4, FA2H, BNIP3, MMP11, COL1A1, CCND2, IGF2BP3, SH3BGR, SERPINB3. Sonuç olarak, ifadelenmesi değişen CYP3A7, KRT4, FA2H, BNIP3, MMP11, COL1A1, CCND2, IGF2BP3, SH3BGR, SERPINB3, THBS2 genleri ile ilgili hem gen hem protein ifadelenmesi birlikte çalışılarak, sonuçların teyit edilmesi IP etyoloji ve karsinogenezi ile ilgili ileriki çalışmalara ufuk açacaktır.
Böbrek nakli olan hastalarda BK virüsü ve insan lökosit antijenleri (HLA) arasındaki ilişkinin araştırılması
Son dönem böbrek yetmezliği (SDBY) olan hastalarda tercih edilen tedavi yöntemi böbrek naklidir. Altıncı kromozomun kısa kolu üzerinde bulunan insan lökosit antijeninin (Human Leukocyte Antigen: HLA) temel görevi antijeni T lenfositlerine sunmak ve spesifik immün cevabı başlatmaktır. HLA moleküllerinin doku ve organ nakillerindeki öneminin yanı sıra otoimmün, viral, alerjik ve nörolojik kökenli hastalıklarla da ilişkili olduğu ortaya çıkmıştır. Böbrek naklinde immün sisteminin ana hedefi, verici hücrelerinin yüzeyinde yer alan HLA molekülleridir. Ayrıca HLA'nın viral enfeksiyonlara karşı bağışıklık cevabının oluşmasında rol oynadığı bilinmektedir. BK virüs (BKV) enfeksiyonu böbrek nakli sonrası önemli problemlerden birisidir. Nakil sonrası verilen immünsüpresif tedaviler BKV gibi fırsatçı enfeksiyonlara neden olmaktadır. Çalışmanın amacı böbrek nakli olan hastalarda HLA ile BKV arasında ilişki olup olmadığının araştırılmasıdır. Çalışma retrospektif olarak planlamış olup, çalışma grubundaki hastalara nakil öncesinde HLA A, B, DR doku tipleme testi çalışıldı. Hastalara ait EDTA'lı tam kan örneklerinden DNA izolasyonu yapıldı. Moleküler olarak PCR temelli olan SSO (Sequence Specific Oligonucleotides) ve / veya SSP (Sequence Specific Priming) yöntemi ile doku tipleme testleri çalışıldı. Nakil sonrasında ise hastalara BKV testi çalışıldı. Hastalara ait idrar ve / veya plazma örneklerinden DNA izolasyonu yapıldı. İzole edilen örneklerden Real-time PCR yöntemiyle kantitatif olarak BKV testi çalışıldı. Sonuçlar SPSS programı ile istatistiksel olarak analiz edildi. Yapılan analizlere göre HLA B*13 allelinin BKV'ye karşı koruyucu faktör, HLA DRB1*03 allelinin ise BKV'ye karşı risk faktörü olabileceği belirlendi. Analiz edilen diğer HLA alleleri ile BKV arasında ise anlamlı bir ilişki belirlenemedi. Sınıf I HLA moleküllerinin sitotoksik T hücre yardımı ile virüslere karşı etkili olduğu bilinmektedir. Bizim çalışmamızda HLA sınıf I molekülleri içerisinde yer alan HLA B*13 allelinin BKV'ye karşı koruyucu faktör olarak belirlenmesi bunu desteklemektedir. HLA sınıf II ise immün sistemin sitokin salgılayarak yardımcı olan CD4+ T hücreleri ile ilişkilidir ve hem immün sistemi uyaran hem de baskılayabilen bir rol oynar. Bizim çalışmamızda HLA DRB1*03 allelinin ise BKV'ye karşı risk faktörü olabileceği belirlendi. Bu allelin immün sistemi baskılayacı sitokin salgılayan bir sitokin salınımıyla ilişkili olduğu düşünülebilir. Anahtar Kelimeler: Böbrek nakli, İnsan lökosit antijenleri, HLA, BK virüs, BKV
Çeşitli hücre hatlarında Silimarinin epigenetik etkisinin değerlendirilmesi
Epigenetik değişimler kanser gelişiminde etkilidirler. Waddington 1940'lı yıllarda epigenetiği DNA'nın baz dizilimini değiştirmeden gen ifadelenmesinin değişmesi olarak açıklamıştır. DNA metilasyonu, histon modifikasyonları, kromatin yeniden modelleme ve mikro-RNA temel epigenetik mekanizmalar olarak kabul edilmektedir. Kanser hücrelerinde tümör gelişimi ile ilgili yolakları etkilediği için epigenetik değişiklikler, tümörün oluşumunda ve ilerlemesinde önemli rol oynamaktadır (115). Epigenetik etkili ilaçlar hücre döngü kontrolü, apoptozis, hücre sinyalizasyonu, invazyon, metastaz ve anjiyogenez ile ilgili gen ifadelerinin kontrolünde kullanılmaktadır (113). Epigenetik düzensizliklerin geri döndürülebilir olması, DNA metilasyon ve histon asetilasyon inhibitörlerinin kanser tedavisinde kullanımına olanak sağlamaktadır ve DNA modifikasyonu ve histon modifikasyonu gibi epigenetik farklılıkların hedef alınarak kanser tedavisinde etkili bir strateji izlenebileceği gösterilmiştir (100,106). DNA metilasyon ve histon modifikasyon profilini değiştirebilen ilaç adayı bileşikler geliştirilmeye başlanarak preklinik ve klinik aşamalara geçilmiştir. 5-azasitidin ve SAHA inhibitör grupları Food and Drug Administration (FDA) tarafından onaylanan tek başlarına veya kemoterapi, radyoterapi gibi sitotoksik ajanlarla birlikte uygulanmaktadır (16,98). 5-azasitidin, yapısal olarak sitozin nükleotidine benzemektedir ve DNA metiltransferazların inhibisyonunu sağlamaktadır. Epigenetik mekanizmalar kullanılarak geliştirilen bir diğer tedavi ajanı histon deasetilaz (HDAC) inhibitörü olan SAHA'dır (30,95). Silimarin, Asteraceae familyasına ait devedikeni olarak da adlandırılan Silybum marianum L. bitkisinin tohumlarından elde edilmektedir. Silimarin kimyasal olarak bir polifenol olup, bitki kimyası olarak da bir flavonolignandır (79,80). Yapılan çalışmalarla silimarinin antioksidan, antimetastatik, antianjiyogenik ve antiinflamatuar etkileri gösterilmiştir (71). Silimarin, antikarsinojenik etkileri sebebiyle kemoterapi alan hastalar arasında tamamlayıcı ve alternatif tedavi amacıyla en sık kullanılan ajandır (54). Bu çalışma ile silimarinin çeşitli kanser hücre dizilerinde epigenetik regülasyon üzerine olan etkisinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. İnsan nöroblastom hücre dizisi SHSY5Y hücreleri, insan hepatosellüler hücre dizisi HepG2 hücreleri veinsan meme kanseri hücre dizisi MCF-7 hücreleri %5 CO2 ve %95 nem içeren 37°C'lik inkübatörde çoğaltıldı. Silimarin, 5-azasitidin ve SAHA'nın genotoksik dozları MTT testi ile belirlendi. Belirlenen IC50 dozlarına göre hücrelere 48 saatlik uygulama yapıldı. DNMT ve HDAC enzim aktiviteleri ölçüldü. Western Blot ile p53, cMyc ve NFκB protein düzeyleri belirlendi. Silimarinin epigenetik yolaklara olan etkisi ile ilgili sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Bu çalışmada ile silimarinin tek başına ve epigenetik inhibitörler ile birlikte uygulandığında çeşitli kanser hücre dizilerinde epigenetik enzimler ve protein düzeylerine olan etkileri değerlendirilmiştir. Sonuçlarımıza göre silimarin DNMT üzerinde inhibe edici etki göstermiştir. HDAC üzerinde inhibisyon etki görülmemiştir. Silimarin p53 K373, p53 K382, cMyc ve NFκB protein seviyelerini baskılarken, p53 S46 protein seviyesini artırmıştır.
3T3L1 hücrelerinde fruktotoksite ve mitokondriyal disfonksiyon
Obezite dünyada epidemi düzeyinde problem olan bir enerji dengesi bozukluğudur. Obezitenin artışında mısır şurubundan elde edilen fruktoz tüketimi büyük oranda sorumludur. Mitokondri hücrede enerji dengesini sağlamada çok önemli bir organel olarak obezitedeki metabolik bozukluklarda anahtar rol oynar. Obezitede besin yüklenmesi mitokondride yanlış katlanmış protein birikimine yol açabilir. Mitokondriyal kalite kontrol sistemleri şaperon ve proteazlardan oluşur ve nukleusa geri sinyaller göndererek hatalı proteinleri uzaklaştırarak mitokondriyal dengeyi sağlamaya çalışır. Preadipositten olgun yağ hücresine farklılaşma bir dizi transkripsiyon faktörlerinin çok iyi işleyişi ile düzenlenir. Yağ hücresi bu sırada artmış enerji gereksinimini mitokondri ile sağlar. Besin, ilaç ve genetik faktörler yağ hücresindeki mitokondriyal fonksiyonu bozabilir. Yüksek dozda işlenmiş fruktoz alımı ile visseral yağlanmanın arttığı ve mitokondriyon fonksiyonunun bozulduğu bilinse de mekanizmalar çok iyi anlaşılamamıştır. Fruktoz alımı ile obezite arasındaki ilişki nedeniyle, bu çalışmada fruktozun yağ hücre farklılaşmasındaki etkisini inceledik. Aynı zamanda 3T3-L1 preadiposit hücrelerinde fruktozun adipogenez sırasında mitokondri fonksiyonlarına olası zararlı etkisini göstermeyi hedefledik. Adiposit farklılaşması oil red-O boyama ile gösterildi. Tüm deney şartlarında fruktoz uygulanarak ve uygulanmadan mitokondriyal ve adiposit biyogenez genleri (Peroksizom proliferatör-aktive edici reseptör gamma (PPARγ), PPARγ koaktivator 1 alfa (PGC-1α), CCAAT enhancer-binding protein alfa (CEBPα), ve beta (CEBPβ) ve mitokondriyal katlanmamış protein yanıtı ile ilgili stres genlerinin (mitokondriyal "heat shock" protein 60 ve 70 (mtHsp60, mtHsp70), Mitochondrial processing peptidase β subunit (MPPβ, Pmpcb), Clp-like proteaz (Clpp), Endonükleaz G (Endog) ve "ubiquinol-cytochrome-c reductase complex assembly factor 1" (Uqcc) ifadelenmeleri 2, 4, 6 ve 8. günlerde çalışıldı. Sonuç olarak, fruktoz uygulanan 3T3L1 hücrelerinde olgun yağ hücresine dönüşümün arttığı görüldü. CEBPα, CEBPβ, Pmpcb, Clpp, EndoG, Uqcc genlerinin ifadelenmesi fruktoz uygulanan hücrelerde anlamlı olarak yüksekti. Çalışmamız fruktozun yağ hücresindeki mitokodriyal fonksiyonlarda bozucu etkilerini göstermiştir.
β-hücre golgi cisimciğinin glukolipotoksisiteye stres yanıtı
Başkent Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitütüsü, Tıbbi Biyoloji Doktora Tezi, 2019 Tip 2 Diabetes Mellitus (Tip2DM) etyopatogenezinde genetik ve çevresel faktörlerin rol oynadığı önemli bir hastalıktır. Tip2DM ortaya çıkması için pankreas β-hücre sayısında ve/veya fonksiyonunda yetersizlik gelişmesi gerekmektedir. β-hücre kaybına neden olan en önemli faktör glukolipotoksisite ve buna bağlı gelişen endoplazmik retikulum stresidir. β-hücre gibi sekretuvar hücrelerde, endoplazmik retikuluma yansıyan her stresin Golgi cisimciğinde de hissedilmesi beklenmektedir. Endoplazmik retikulumdan gelen sekretuvar proteinlerin ileri modifikasyonu, veziküler transportu ve sekresyonunu sürdürebilmek için Golgi cisimciğinde de adaptif veya maladaptif moleküler değişikliklerin gerçekleşmesi tahmin edilmektedir. Daha önce yapılmış çalışmalarda, Golgi cisimciğinde fonksiyon kaybına neden olan toksik kimyasalların (Brefeldin A, Golgicide A, vb) bu organeli strese sokarak bir takım adaptif stres cevabı başlattıkları ve bu süreçte spesifik birtakım proteinlerin (ARF4, CREB3/TFE ve HSP 47 gibi) ifadelenmesinin ve/veya aktivitesinin arttığı gösterilmiştir. Bu kapsamda bu çalışmada INS-1E rat β-hücre hattı kullanarak hücrelerde palmitat, glukoz ve glukoz +palmitat ile lipotoksisite/glukotoksisite/glukolipotoksisite oluşturarak Golgi stresi yaratıldı. MTT testi ile hücrelerin canlılık oranları bakıldı. Daha sonra metabolik stres altındaki hücrelerde literatürde tanımlanmış stres proteinlerinin transkript düzeyinde ifadelenmesi incelendi. Her koşulda 8.,16., 24. ve 48. saatlerde Golgi cisimciği yapısal genlerinin, glikozilasyon genlerinin, ARF1, HSP47, CREB3 ve ARF4 genlerinin ifadelenme kat artışı değerlendirildi. Sonuç olarak bu çalışmada INS-1E rat β-hücrelerinde lipotoksisite/glukotoksisite/glukolipotoksisite sonrası ilk saatlerde Golgi cisimciği glikozilasyon enzimlerinden st3gal1 ifadelenmesinin ve golcisidlere cevapta önemli rol aldığı bilinen HSP47 (Serpin1)'in ifadelenmesinin arttığı tesbit edilmiştir. Metabolik toksik ortam uygulamasının 48.saatinde yani hücre canlılığının azaldığı geç saatlerde, CREB3 ifadelenmesinin anlamlı olarak arttığı gösterilmiştir. Bu çalışma literatürde β-hücrelerinde glukolipotoksisitenin golgi cisimciğine etkilerini irdeleyen ilk çalışmadır. Çalışmamızın daha ileri çalışmalara ışık tutacağı düşünülmektedir.
İnsan hepatoselüler karsinom hücre hattında (HEPG2) lipotoksik ve mitotoksik streste mitokondriyon yanıtı
Beslenmede doymuş yağ asiti alımı arttıkça obezite, tip 2 diyabet (T2DM) ve non-alkolik yağlı karaciğer hastalığının (NAYKH) görülme sıklığı da artmaktadır. Bu hastalıkların patogenezindeki ortak nokta ise artan serbest yağ asidi miktarının karaciğer, iskelet kası, kalp ve pankreas gibi non-adipoz dokularda birikmeye başlamasıdır. Lipotoksisite olarak tanımlanan bu durum, artan lipid birikimi ile organel fonksiyon bozukluğuna, hücre hasarına, metabolik bozukluklara, kronik inflamasyona, hücresel fonksiyon kayıplarına ve non-adipoz doku ölümüne sebep olmaktadır. Lipotoksisiteye bağlı mitokondriyonda stres meydana geldiğinde lipid peroksidasyonu, ROS artışı ve buna bağlı olarak hücre ölümü tetiklenmektedir. Diyette ve serumda en fazla bulunan doymuş serbest yağ asidi Palmitik Asit (PA) olup; 16 karbonlu uzun zincirli bir yağ asididir. Altında yatan mekanizma tam olarak bilinemese de yağ asitlerinin trigliseride (TG) dönüşümü sitotoksisiteye neden olmaktadır. PA'nın TG'ye dönüşümü daha az olduğundan daha fazla toksik özellik göstermektedir. Bir diğer stres kaynağı ise karbonil siyanid 3-klorofenilhidrazon (CCCP)'dir. CCCP hücrelerde mitotoksisiteye sebep olan bir ajan olup mitofaji çalışmalarında yaygın kullanılanılan kimyasaldır. Tüm bu verilerin ışığında çalışmamızda insan HepG2 hücre hattında ayrı ayrı lipotoksik ve protonofor stresi uygulanarak mitokondriyonun verdiği stres yanıtı farklılığının araştırılması hedeflenmiştir. Böylece farklı uyaranlara karşı mitokondriyonun verdiği otofaji mitofaji yanıtlarında görev alan proteinler hakkında daha detaylı bilgi edinilmesi hedeflenmiştir. Ek olarak uygulanan stresin süresi ve çeşitliliğinin de yanıt farklılığındaki etkisi araştırılmıştır. Bunun için mitokondriyonla ilişkili stres ve mitofaji genlerinden CHOP, HSP10, HSP60 ve Parkin ve otofajide adaptör/ reseptör görevi yapan Optineurin, HACE1, TBK1, p62 ve LC3-II genlerinin ifadelenmesine bakılmıştır. Sonuç olarak hücresel stres yanıtının PA uygulanan grupta daha erken başlayıp, azaldığı; CCCP uygulanan grupta ise, daha geç başlayıp daha uzun sürdüğü görülmüştür. PA uygulanan grupta en etkili saatin 12. saat olurken CCCP grubunda 24. saat olduğu görülmüş olup, özellikle mitokondriyal streste görev alan CHOP geninin ve mitofajide görev alan Parkin, OPTN, HACE1, TBK1, P62 ve LC3-II genlerinin ifadelenmelerinin arttığı görülmüştür.
Hepatoselüler karsinom gelişiminde Tiyoredoksin Etkileşimli Protein(TXNIP)'in rolü
Hepatoselüler karsinom sirotik karaciğer zemininde gelişmektedir. Süreçte oksidatif stresin sebep olduğu hepatosit hasarı, kronik inflamasyon ve hücre ölümü önemlidir. Bir çok büyüme faktörü ve sinyal ileti yolağı ise stres ortamına yanıt olarak aktive olmakta ve hücrelerin daha hareketli, daha invazif karakter kazanmasını sağlamaktadır.Hepatositlerin büyüme, çoğalma ve farklılaşmasında önemli rol oynayan HGF/cMET sinyal ileti yolağı aktive olan yolaklardan bir tanesidir. Oksidatif stres hasarına karşı koruyucu rolü de tanımlanmıştır. HGF/cMET aktivasyonunda heparinin önemli olabileceği düşünülmektedir. Heparin çok sayıda sülfat grupları içeren, karbohidrat yapıda ve negatif yüklü bir glikozaminoglikandır. Oksidatif stresin baskılanmasında ve karaciğer fibrozunun önlenmesinde önemli rol oynamaktadır.Heparinin HGF tarafından uyarılan biyolojik yanıtlar üzerindeki etkisini tanımlamaya yönelik daha önceki çalışmalarımızda hücre proliferasyonunun, hareketliliğinin ve invazyonunun baskılandığı belirlendi. Bu biyolojik yanıtların düzenlenmesinde rol alan genlerin anlaşılabilmesi için yapılan mikrodizin çalışmasında, hücresel oksidatif stresin düzenleyicisi TXNIP aday olarak belirlendi.Çalışmamızda HGF ve/veya heparin uyarımının TXNIP ekspresyonuna etkisinin hangi mekanizma ile gerçekleştiği araştırılmıştır. TXNIP ekpresyonunun, cMET sinyal yolağı tarafından düzenlenmesi ve heparin arasındaki ilişki literatürde daha önce hiç tanımlanmayan bir veridir. Tek başına HGF uyarımı ile TXNIP ekpresyonu cMET fosforilasyonuna benzer şekilde artmakta, cMET reseptörüne spesifik bir inhibitör kullanıldığında ise baskılanmaktadır. cMET'in inhibe olması ile alt yönde bulunan ve sağ kalım ile ilişkilendirilen, p42, 44 MAPK sinyal ileti moleküleri de baskılanmaktadır. Bu sonuçlar, HGF/cMET yolağının aktive olmasının, TXNIP ekpresyonundaki artışın sağlanmasında önemli olduğunu göstermiştir.Heparin tarafından da TXNIP ekspresyonu artmaktadır. Heparin tarafından cMET fosforilasyonunun ve p42,44 MAPK fosforilasyonların arttığının gösterilmesi, heparin aracılıklı TXNIP ekpresyonu artışının cMET aktivasyonu ile uyarılan p42, 44 MAPK yolağı üzerinden düzenlendiğini düşündürmüştür. Heparin ve HGF birlikte iken ise TXNIP ekpresyonu, cMET, p42, 44 MAPK fosforilasyonu baskılanmaktadır. Önceki verilerimizde elde ettiğimiz hücre proliferasyonunun, invazyonunun, ve hareketliliğinin baskılanması bu sebeple olabilir.Ek olarak TXNIP ekpresiyonunun mezenşimal fenotip gösteren HCC hücre dizilerinde daha yüksek olduğu saptanmıştır. Bu hücre tiplerinin oksidatif strese dirençli olduğu bilinmektedir.Tüm verilerimiz bir arada değerlendirildiğinde TXNIP ekspresyonundaki artışın, HCC hücrelerinin oksidatif strese direnç kazanmasında ve invazyon yeteneklerinin artmasında önemli olabileceği düşünülmektedir.Anahtar Sözcükler; TXNIP, Glukoz, Heparin, HGF, HCC
Histon modifikasyonlarının hücre proliferasyonu üzerine etkileri
Normal karaciğer hücresinin viral yada kimyasal ajanlarla karşılaşması tekrarlayan nekroz/proliferasyon döngüleri ve buna bağlı telomer kısalmasını tetikler. Buda karaciğerde mikroçevre değişiklikleri, kök hücre ve/veya satellit hücrelerin aktivasyonu, sonrasında kontrolsüz hücre bölünmesine ve apoptoza direnç kazanımına bağlı siroz, displastik nodül ve hepatosellular karsinoma (HCC) gelişmesini sağlar. Hepatokarsinogenez sürecinde birçok genin promotor metilasyonu yoluyla susturulduğu gösterilmiş olsa da histon kodu değişikliklerinin rolü henüz bilinmemektedir.Bu çalışmada temel olarak, HCC hücre hatlarından HuH7'da lityum aracılıklı proliferasyon inhibisyonu sonucunda, transkripsiyonel aktivasyon ve/veya baskılama sağladığı literatürde bilinen başlıca histon metilasyon profillerindeki değişim incelenmektedir. Buna göre, lityuma bağlı olarak hücrelerde G1 arresti gözlemlenmiş ve beraberinde H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3 ve H3K36me1 modifikasyonlarında artış bulunmuştur. Ayrıca H3K27me3 modifikasyonundan sorumlu EZH2 metil transferazının transkript ve protein düzeyinde gözlemlenen azalışa rağmen beklenmedik şekilde sorumlu olduğu modifikasyonda tespit edilen artış bize lityumun başka bir mekanizma ile etki ettiğini düşündürmüştür. Lityumun literatürde bilinen kadarı ile GSK3ß ve Akt gibi kinazların inhibitörü olması bize bu kinazların EZH2'yi fosforilleyerek inhibe edebileceği hipotezini kurdurmuştur. Bu hipotezi test etmek için yapılan deneylerde lityum etkisine bağlı olarak 2 ve 6. saatlerde EZH2'nın fosforile formunun miktarca azaldığı gösterilmiştir.Sonuç olarak, HCC hücre hatlarında yapılan analizler bize H3K27me3 modifikasyonu başta olmak üzere histon modifikasyon profillerindeki değişimlerin hücre proliferasyonunda etkili olabileceğini göstermiştir. Bu da HCC tedavisinde histon kodunun potansiyel rolüne bağlı yeni ufukların açılmasına neden olabilmesi açısından önemlidir.
BCR-ABL pozitif hücrelerde tirozin kinaz inhibitörlerinin otofajik hücre ölümü üzerindeki etkileri
Programlı hücre ölümünün mekanizmalarını iyi anlamak, bu mekanizmalardaki herhangi bir bozukluk sonucu oluşabilecek hastalıklara karşı geliştirilecek ilaçlar ve tedavi yaklaşımlarını belirlemede önem arz etmektedir. Günümüzde apoptozdan başka nekroptoz, otofaji gibi farklı programlı hücre ölüm tipleri tanımlanmıştır. Kronik myeloid lösemilerde (KML) bir tirozin kinaz olan BCR-ABL kimerik gen ürününün programlanmış hücre ölümüne karşı hücrelerde direnç oluşturduğu ilk 1990'lı yılların sonlarında ortaya konulmuş ve takip eden yıllarda yapılan çalışmalarda doğrulanmıştır. KML tedavisinde kullanılan İmatinib de dahil çoğu kanser ilacının moleküler etki mekanizmaları en çok bilinen programlı hücre ölümü olan apoptotik yolakta çalışılmıştır. Bahsi geçen diğer programlı hücre ölüm tiplerindeki etkileşimler ise henüz açıklık kazanmamıştır. Genel olarak KML biyolojisi ve tirozin kinaz inhibitörleri ile tedavisinde diğer programlanmış hücre ölüm şekillerinin rolünü araştırmayı hedeflemektedir. Bu amaçla burada sunulan yüksek lisans tezi kapsamında dirençli bir kronik myeoid lösemi alt hücre hattının üretilmesi planlandı. İmatinib dirençli bir hücre hattı, KML ve tedavisi ile ilgili laboratuar araştırmalarına büyük katkı sağlayacaktır. Ne yazık ki bu tür tanımlanmış direnç mutasyonlarını taşıyan bir hücre hattı bulunmamaktadır. Bu tür araştırmalar literatürde mutasyon içeren bir BCR-ABL klonunun daha çok fare hücre hatlarına transfeksiyonu ile yapılmaktadır. Tanımlanmış mutasyonlarla İmatinib'e direnç özelliği gösteren bir KML hücre hattı oluşturmanın büyük yararları olacağı görülmüştür. Tez çalışması kapsamında K-562 hücre hattı giderek artan ilaç dozlarına maruz bırakıldı. Bunun sonucunda ilaca direnç kazanan hücrelerin zaman içerisinde klonal seçilim yoluyla hayatta kalıp üremesiyle K-562 İmatinib dirençli alt klonlar ürettildi. İmatinib direnci annexinV akım sitometrisi ve kaspaz-3 aktivasyon tayini ile doğrulandı. Dirençli ve kontrol hatlarında otofaji belirteçleri incelendi.
Periyodik ateş sendromlarında TNFRSF1A geni varyantlarının öneminin araştırılması
?Tümör Nekroze Edici Faktör Reseptörü ile İlişkili Periyodik Sendrom? ilk kez 1982 yılında Williamson ve arkadaşları tarafından İrlanda/İskoçya kökenli bir ailede ?Ailesel Hibernian Ateş? olarak tanımlanmıştır. 1998 yılında sendromdan sorumlu gen 12 nolu kromozomun kısa kolunda bulunan ?Tümör Nekroze Edici Faktör Reseptörü Süper Ailesi 1A? (Tumour Necrosis Factor Receptor Super Family 1A / TNFRSF1A) olarak tanımlanmış ve sendrom ?TNF Reseptörü ile İlişkili Periyodik Sendrom (TRAPS)? adını almıştır. Sendrom başta Kuzey Avrupa ülkeleri olmak üzere Hindistan, Türkiye, Japonya, İsrail gibi birçok ülkede tanımlanmış olup geniş bir etnik çeşitlilik sergilemektedir.TNFRSF1A geninde şimdiye kadar 98 farklı varyasyon tanımlanmış ve bu varyasyonların 65'inin TRAPS fenotipine yol açtığı bildirilmiştir.Çalışmamızda, klinik bulguları ile periyodik ateş sendromu tablosu oluşturan olgularda, TNFRSF1A geni varyantlarının dağılımının ve sıklığının belirlenmesi amaçlandı. Çalışmaya dahil edilen 30 hastada TNFRSF1A geninin tüm eksonları için DNA dizi analizi gerçekleştirildi. Olgularda, literatürde TRAPS fenotipine yol açtığı tespit edilmiş varyasyonlardan hiçbiri bulunamadı. Ancak, 18 olguda 1 numaralı ekson bölgesindeki sinonim c.36 A>G (G allel frekansı %40, A allel frekansı %60), 27 olguda 4 numaralı intron bölgesinde c.473?33 T>C (T allel frekansı %28, C allel frekansı %72), 18 olguda 6 numaralı intron bölgesinde c.625+10 A>G (A allel frekansı %62, G allel frekansı %38), 16 olguda 7 numaralı intron bölgesinde c.740?9 T>C (C allel frekansı %30, T allel frekansı %70) transisyonları ve önceden bilinen bu değişimlere ek olarak ilk defa bu çalışmada tanımlanan 6 numaralı intron bölgesinde c.626?32 G>T transversiyonu da 1 olguda saptandı.Çalışmamız, ülkemizde periyodik ateş sendromlarında, klinik tablonun oluşmasında, TNFRSF1A geninin öneminin araştırıldığı, geniş olgu grubunda yapılan ilk çalışma niteliğinde olması nedeniyle önem taşımaktadır. Anahtar kelimeler: DNA dizi analizi, Periyodik ateş sendromu, TRAPS, TNFRSF1A.
Zeka düzeyleri IQ:45-75 olan çocuklarda sitogenetik çalışmalar
ÖZET Bu çalışmada, M.E.B Antalya Rehberlik ve Araştırma Merkezine kayıtlı 16 özel alt sınıftan 6'5inda eğitim gören 7-13 yaşlarında ve IQ'ları 45-75 olarak bildirilen 101 öğrencide sitogenetik çalışma yapılmıştır. Kromozomların tanımlanması GTG bant lama yöntemi ile yapılmış, anormal kromozom bulgusunun özelliğine göre GBG ve NOR teknikleri uygulanmıştır, çalışma sonucunda % 5.9'u temel, % 15.9'u heteromorfik olmak üzere toplam % 21.8 oranında kromozom anomalisi bulunmuştur. Temel kromozom anomalilerinden frajil bölge taşıyan olguların karyotipleri 46, XY, fra Xq27.3, 46, XX, fra Xq27.3 ile birlikte fra 3Pİ4 ve İ6q23, 46, XY, fra Xp22, 46,XY,fra 8q22 olarak gözlenmiştir. Ayrıca sayısal kromozom anomalisi görülen 2 kız olguda 47, XX, +21 karyotipi saptanmıştır. Heteromorf izm şeklinde değerlendirilen bulgular bir erkek olguda lqh+,l'si erkek 2 'si kız 3 olguda İ6qh+, 1 erkek olguda 15ph+, 2 erkek olguda 21ps+, 1 kız olguda 21ph+,bir erkek olguda 22 pss, 3 erkek olguda Yqh+,-57- 2 erkek olguda Yqh- ve l'i kız l'i erkek 2 olguda perc.inv(9) kromozomundan oluşmaktadır. Analizler bittikten sonra öğrencilerin "Görüşme Form"larından doğum şekli, doğum sırasındaki anne yaşı ve doğum sonrası yürüme, konuşma ve havale geçirme özellikleri incelenmiştir. X2 testi uygulanarak, bu özellikler ile anormal kromozoma sahip olma arasında anlamlı ilişki bulunamamıştır. Başta mental retardasyona neden olan ve ailesel geçiş gösteren fra X kromozomu ile diğer frajil kromozomları taşıyan olgular ile Down sendromlu çocukların ailelerine bilgi verilerek takibe alınmışlardır. Elde edilen sonuçlar, mental retardasyonu oluşturan etiyolojik faktörler içinde kromozomal bozuklukların önemli rol oynadığını ve ülkemizde özel alt sınıflarda bu çalışmaların yapılması gerektiğini göstermiştir.
Yeni doğanlarda seks kromatin tayini metoduyla X'e bağlı kromozom anomalileri sıklığının saptanması
ÖZEI Bu çalışmada, yeni doğan bireylerde seks kromatin metoduyla seks kromozom anomalilerinin sıklığı araştı rılmıştır. Kontrol grubu olarak 30 sağlıklı dişi birey den örnek alınmış ve seks kromatin ortalaması % 18 bu- lunmuştur. İncelenen 3090 bebeğin 1527'si dişi, 1563 '"S erkek fenotipli olup, seks kromatin oranı % 16.8 olarak gözlenmiştir. Seks kromatin bulgularıyla şüpheye düşü len 20 bireyde hem seks kromatin metodu tekrarlanmış, hem kromozom analizi yapılmıştır. Sonuçta 20 şüpheli olgudan sadece birinde aynı çekirdekte normalde bir tane olması gerekirken iki adet seks kromatin gözlenmiş ve X'e bağlı kromozomal aneuploidi sıklığı % 0.03 olarak saptanmıştır. Kromozom analizi sonucunda. olgumuzun mozaik triple Z sendromuna sahip olduğu ortaya çıkarıl mış ve karyotipi 4-6,XZ/4-7,ZXX şeklinde belirlenmiştir. Bu olgunun ileride karşılaşılabileceği psikolojik ve fizyolojik sorunlar açısından aileye genetik danışma ve klinisyene bilgi verilmesi planlanmıştır.
Akciğer karsinomlarından kurulan doku kültürlerinde sitogenetik çalışmalar
76 ÖZET 16 yassı hücreli karsinom, 6 adenokarsinom, 4 adenosquamoz karsinom, 3 büyük hücreli, 1 küçük hücreli ve 1 de hamartom tanılı toplam 31 olguya alt tümör materyalinden primer doku kültürü kuruldu. GTG bantlama tekniği kullanılarak yapılan sitogenetik incelemede 27 olguda klonal kromozom anormallikleri gözlendi. Yalnız sayısal anormallik saptanan 3 yassı hücreli karsinomlu olguda sırasıyla hipertetraploidi, trizomi 20 ile birlikte X kromozomunda sayısal artış ve 3 tane X kromozomu bulundu. Geriye kalan 12 yassı hücreli karsinomlu olguda en fazla 1 nolu kromozomun p ve q kolları olmak üzere 2,3,6,7,8,9,10 ve X kromozomlarında p ve/veya q da delesyonlar ve iki olguda da Y kromozom kaybı görüldü. Ayrıca 3 ve 7, 4 ve 7, 1 1 ve 12 nolu kromozomlar arasında translokasyonlar, i(2p),inv(9) ve 1(2 lq) en az 2 farklı yassı hücreli karsinomlu olguda gözlendi. Bundan başka klonal olmayan translokasyonlar, izokromozomlar, duplikasyonlar şeklinde yapısal kromozom anormallikleri bulundu. 6 adenokarsinomlu olgudan 3' ünde herhangi bir anormallik gözlenmezken birinde hipotetraploidi, birinde 9 ve 15 nolu kromozomlarda sayısal artış diğerinde ise trizomi 11 ve 13q delesyonlu iki farklı klon tespit edildi. 4 adenosquamoz karsinomlu olgudan 2'sinde i(7p), diğerlerinde İp, 3p ve q, 5q, 6q, 7q, 8q, Xq da delesyonlar gözlendi.77 3 büyük hücreli karsinomlu olguda birinde Y kromozom kaybı diğer ikisinde de 7 nolu kromozomda delesyonlar (q21, q32), 1(9) (p veya q) şeklinde yapısal anormallikler bulunurken klonal fakat her olguda gözlenmeyen translokasyonlar, izokromozomlar, delesyonlar saptandı. Küçük hücreli karsinomlu tek olguda Y kaybı ve trizomi 7 gibi sayısal değişiklikler gözlenirken hamartomlu olguda 6 nolu kromozomda yapısal değişiklik bulundu. Özellikle yassı hücreli karsinomlu olgularda 3 farklı tip translokasyon klonal olarak görüldüğünden, bu bulgular primer kromozom değişiklikleri; belli bir gruba özgüllük göstermeyen kromozomal delesyon ve izokromozom tipi yapısal anormallikler ise sekonder değişiklikler olarak tümör oluşumunda rol oynayabilirler.
Frajil-X sendromlu ailelerde DNA analiz çalışmaları
ÖZET Frajil X sendromu, ailesel zeka geriliğinin en genel nedeni olup, FMR-1 geninin 5'ucunda UTR bölgesinde stabil olmayan CGG tekrarlarının artışı ile karakterize bir sendromdur. Frajil X sendromlu 5 ailenin 16 erkek ve 15 dişi toplam 31 bireyinde DNA izolasyonu, EcoRI ve Eagl ikili enzim kesimi, Southern blot ve FMR-1 genindeki CGG artışını tespit eden StB12.3 probu kullanarak hem CGG tekrarlarının uzaması hemde CpG adasının metilasyon durumunu belirlemek için moleküler çalışmalar yapıldı. Sonuçta, full mutasyon (A=0.8-2.8 kb) taşıyan 10 erkek, ağır mental retardasyon ile % 100 korelasyon gösterirken, full mutasyon taşıyan dişilerin 11(%73) 'nin normal, 3(% 20) ünün hafif ve 1(% 6.7) nin de ağır olmak üzere farklı zeka düzeylerine sahip oldukları belirlendi. Bir dişi bireyde mozaik mutasyon(6.0 ve 4.0 kb) bulundu, ancak zekasının normal olduğu, frajil X kromozomu taşımadığı görüldü. Aynı aileden 3 üyenin premutasyon (A =0.2kb) taşıdığı, bunlardan annenin % 2 oranında frajil X taşıdığı saptandı. Ayrıca, özellikle 3 kuşaklı ailelerde olmak üzere kuşaklar arasında CGG tekrarlarının arttığı gözlendi. Bulgularımızda, da görüldüğü gibi, klinik bulguları frajil X sendromuna uyan bireylerle, frajil X sendromlu ailelerde sitogenetik olarak negatif olan bireylerde, kesinlikle direkt DNA analizinin43 yapılmasının zorunluluğu ortaya çıkmaktadır. Bu teknik sitogenetik olarak tam belirlenemeyen, kliniği değişebilen taşıyıcı dişi, mozaik ve NTM'lerin gösterilmesi için önemlidir. Frajil X sendromunun prenatal tanısında, amniyosentez'den sonra, koryon biyopsisinde de rutin olarak yapılan direkt DNA analizi sonuçlarının, sitogenetik analizlerden daha güvenilir olduğu ortaya çıkmıştır.
Ganglionöroblastomada DNA artış ve azalışlarının karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (KGH) ile analizi
ÖZET Nöroblastoma ve ganglionöroma arasında ara geçiş evresi olan ganglionöroblastomadaki genetik değişiklikler tam olarak bilinmemektedir. Nöronal orijinli tümörlerde sitogenetik çalışmalar koşullar zor olduğu için çok fazla değildir. Bu çalışmada, karşılaştırılmalı genomik hibridizasyon (KGH) ve iki aşamalı dejenere oligonükleotid primer ile polimeraz zincir reaksiyonu (DOP-PCR) kullanılarak, yaşlan 3-4 arasında olan 5 olguya (3 erkek, 2 kız) ait ganglionöroblastoma örneklerindeki genomik kopya sayısı değişiklikleri ile bunların kromozomal yerleşimleri araştırılmıştır. 5 olgunun 3'ünde 2p5.1-pter, 5pl5.1-pl5.3, +7, 13q22-q31, +22 artışları, ve 2'sinde lp35, 4pl5.1, 10qll.2-q21.2, 12q24.32-qter, + 13, 17pl2-pl3 ve 18pll.35-pter gibi kromozom bölgelerinde artışlar bulunmuştur. 3 olgumuzda ortak amplifikasyon bölgesi olarak belirlenen 13q22-q31 bölgesinde tanımlanmış olan bir onkogen bulunmamaktadır. Bu bölge, ganglionöroblastomanın ortaya çıkışında ve ilerlemesinde önemli rol oynayan olası bir onkogen taşıyor olabilir. Ayrıca, nöronal orijinli tümörlerde şimdiye kadar artışı gösterilmemiş olan ve bizim olgularımızın 3'ünde artışı belirlenen kromozom 22, üzerinde taşıdığı YESP, SIS, PDGB, NRASL2 onkogenlerinin ürünleri ile, ganglionöroblastoma gelişimde önemli rol oynuyor olabilir. Anahtar Kelimeler: Karşılaştırılmalı Genomik Hibridizasyon, Dejenere oligonükleotid primerli polimeraz Zincir Reaksiyonu, ganglinöroblastoma
Tekrarlayan düşükleri olan ve sitogenetik olarak karyotipleri normal bulunan çiftlerde kriptik translokasyonların Floresan In Situ Hibridizasyon (FISH) ile araştırılması
ÖZET Bu çalışmada konvensiyonel sitogenetik yöntemlerle karyotipleri normal bulunmuş, beş ve daha fazla spontan düşükleri olan çiftlerde, moleküler sitogenetik bir yöntem olan Floresan In Situ Hibridizasyon (FISH) tekniği uygulanmış ve kromozomların telomerik bölgeleri kriptik translokasyonlar açısından araştırılmıştır. Çalışmaya toplam 5 çift dahil edilmiştir. Olguların tümüne GTG bantlama ile kromozom analizi yapıldıktan sonra normal karyotipe sahip bireyler immünolojik, endokrin ve anatomik faktörler açısından incelenmiştir. Değerlendirilme sonucunda normal bulunan olgulara telomere özgü çoklu prob seti kullanılarak Floresan In Situ Hibridizasyon (FISH) tekniği uygulanmıştır. FISH ile elde edilen sinyallerin floresan mikroskopta incelenmesi sonucunda; bir çiftin eşinde 3 ve 10 nolu kromozomlar arasında kriptik translokasyon saptanmıştır. Başka bir çiftin eşinde ise 20 nolu kromozomun kısa kolundaki sinyal, farklı bir kromozomda bulunmuştur. Ayrıca 3 ailenin bireylerinde polimorfizm olarak değerlendirilen sinyalin fazlalığı veya yokluğu gözlenmiştir. Bu çalışmanın sonucunda, karyotipi normal bulunan ve nedeni bilinmeyen tekrarlayan düşükleri olan çiftlerin, telomere özgü çoklu prob seti kullanılarak kriptik translokasyonlar açısından değerlendirilmesi gerekliliği ortaya çıkmıştır. Ayrıca bu çiftlerin daha sonraki hamileliklerinde prenatal tanı uygulanabileceğinden ailelerin sağlıklı fetusa sahip olmalarına imkan sağlanabilecektir. Anahtar Kelimeler: Kriptik Translokasyon, FISH, Telomerik Prob, Tekrarlayan Düşükler.
Mesane kanseri tanılı olgularda p53 geni mutasyon analizi
ÖZET Mesane Kanseri Tanılı Olgularda p53 Geni Mutasyon Analizi p53 geni insan malignansilerinin yaklaşık %50'sinde mutasyona uğrayan bir tümör supresör gendir. Tümör supresyon etkisini, pek çok geni regüle ederek, bu genlerin cevaben hücre siklusu regülasyonu, DNA tamiri ve apopitoza gitmelerini sağlayan bir çok yolla gerçekleştirmektedir. p53, mesane kanserinde en fazla mutasyona uğrayan tümör supresör gen olma özelliğini taşımaktadır. Bu yüzden mesane kanserinin prognozunda önemli bir biomarker olabilir. Bu araştırmada, ürotelyal karsinom teşhisi konmuş 22 olguya ait mesane tümör doku örneklerinden ONA izole edilip, PCR metoduyla 5., 6., ve 7. ekson bölgeleri amplifiye edildikten sonra, enzim kesimi yapılarak 5. ve 7. eksonlarda p53 geni mutasyon analizi gerçekleştirilmiştir. Mutasyon analizi gerçekleştirilen olguların % 45'inde p53 geni mutasyonu saptanmış olup, saptanan mutasyonların %60'ının 5. eksonda bulunan 175. kodon, %40'ının ise 7. eksonda bulunan 249. kodonda olduğu belirlenmiştir. Anahtar Sözcükler: p53 geni, mesane kanseri, PCR, enzim kesimi
Kronik obstrüktif akciğer hastalarında alfa-1 antitripsin genine ilişkin genotipleme çalışması
viiÖZETAlfa 1 antitripsin geni 14. kromozomun uzun kolunda (14q32.1) yer almakta olup, 5ekzon ve 4 introndan oluşur. 12301 bç uzunluğunda olan Alfa 1 antitripsin genikaraciğerde eksprese olur ve 394 aa'lik tek bir polipeptit zincirinden oluşan, 52kDabir glikoprotein olan Alfa 1 antitripsin proteinini kodlar. Bu araştırmada, AfyonKocatepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları Polikliniği ileAfyonkarahisar Göğüs Hastalıkları Hastanesi'nde KOAH tanısı alan ve AnabilimDalımız Tıbbi Genetik Laboratuvarına refere edilen toplam 40 erkek olguda PCR-ELISA yöntemi kullanılarak AAT geninde yaygın olarak gözlenen S,Z ve Malellerine ait genotipleme çalışması yapıldı. Çalışılan 40 olgunun tümünde PiM /PiM genotipi saptandı. Veriler literatür ışığında değerlendirildi. Bölgesel olgularailişkin mutasyon değerlendirilmesi için daha geniş olgu serisinin çalışılmasıgerekildiği kanısına varıldı.PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com
Parkinson hastalarında dermatoglifik örneklerin incelenmesi
ÖZETParkinson Hastalarında Dermatoglifik Örneklerin İncelenmesiKromozomlardaki sayı ve yapı düzensizlikleri minör etkili genlerin oluşturduğudermatoglifik örneklerin bozulmasına neden olmakta ve böylece kalıtsal hastalıkların tanısınayardımcı olmaktadır. İlk kez Down sendromuyla ilişkili olduğu ortaya konandermatoglifiklerin günümüzde pek çok sendromla özel bağlantılar gösterdiği bilinmektedir.Bu nedenle bu gibi hastalıkların tanısında dermatoglifiklerden yararlanılabilir.Parkinson hastalığı Alzheimer'dan sonra toplumda rastlanan ikinci nörodejeneratifhastalıktır, erkeklerde %2, kadınlarda ise %1.3 sıklıkla rastlanmaktadır. Parkinson hastalığınınnedeni tam olarak bilinmemektedir. Bugün için en geçerli görüş genetik ve çevreselfaktörlerin bu hastalığın oluşumuna birlikte katkıda bulunduğu yönündedir.Bu çalışmada amaç Parkinson hastalarının dermatoglifik örneklerinde bir taramayaparak bu örnekleri sağlıklı bireylerden oluşturulmuş kontrol grubundan alınandermatoglifik örneklerle karşılaştırarak, parkinson hastalarının dermatoglifik örneklerindespesifik farklılıkların olup olmadığını ortaya koymaktır.?Röntgen Filmi? yöntemi kullanılarak hasta ve kontrol grubundan elde edilen dermalörnekler değerlendirildiğinde hasta grubunda kontrol grubuna göre: sağ el I. Parmakta düğümsayısında artış ve ilmek sayısında azalma, sol el interdigital I ve III bölgelerinde triradiussayısında azalma, sağ el interdigital I bölgesinde bulunan triradius sayısında azalma, sağ vesol el tenar bölgesi ile sağ el hipotenar bölgesinde bulunan triradius sayısında azalma, sağ ela-b çizgi sayısında azalma tesbit edilmiştir.Anahtar sözcükler: dermatoglifikler, parkinson, triradiusV
Konjenital işitme kayıplı olguların Cx26 ve Cx30 genleri açısından genotiplendirilmesi
ÖZETKonjenital şitme Kayıplı Olguların Cx26 ve Cx30 Gen Mutasyonları AçısındanGenotiplendirilmesişitme kaybı kişinin sosyal, eğitim ve zeka gelişimini olumsuz etkileyen ve her 1000yeni doğumda yaklaşık 1 oranında görülen en yaygın algılama bozukluklarındanbiridir. Konjenital işitme kaybı bulunan olguların yaklaşık yarısı genetik nedenlidir.Cx26 ve Cx30 gen mutasyonlarının, sendromik olmayan konjenital işitme kaybınaneden olduğu bildirilmiştir. Kokleadaki gap junction kanal yapısında yer alan Cx26ve Cx30 proteinlerini kodlayan genler üzerinde oluşan 35delG, 167delT (Cx26geninde) ve del(GJB6-D13S1830) (Cx30 geninde) mutasyonlarının proteinlerdemeydana getirdiği bozukluğun potasyum iyon döngüsünü engellemesiyle işitmekaybı meydana gelir. Bu çalışmada olguların Cx26 ev Cx30 mutasyonları açısındangenotiplendirilmesi amaçlanmıştır.Afyonkarahisar li'nde bulunan Karahisar şitme Engelliler Okulundakikonjenital işitme kaybı tanısı konmuş 47 olgu araştırma kapsamına alındı. Cx26 geniüzerinde oluşan 35delG ve 167delT, Cx30 geni üzerinde oluşan del(GJB6-D13S1830) mutasyonlarının genotipleme çalışması için PCR-EL SA tekniğikullanıldı.ncelenen 47 olgudan elde edilen sonuçlara göre 7 olguda (~%14,9) 35delGmutasyonu saptanmıştır. Bu mutasyonların 4 tanesi homozigot mutant (~%8,5) ve 3tanesi heterozigot mutant (~%6,4) olarak belirlendi. Olgularda 167delT ve del(GJB6-D13S1830) mutasyonlarına rastlanmamıştır.Sonuç olarak bizim çalışmamızda da literatürlerle uyumlu olarak konjenitalişitme kaybına neden olan ve en sık görülen mutasyonun 35delG olduğubelirlenmiştir.Anahtar Sözcükler: genetik, işitme kaybı, konjenital, Cx26 geni, Cx30 geni,35delG.
Farklı gruplardan antibiyotiklerin klinikden izole edilen eschericia coli'lerin üs cinsinden üremelerine
- 60 - ÖZET Farklı grublardan antibiyotiklerin, klinikden izole edilen 5 Escherichia coli susunun üs cinsinden üremesine etkileri araştırıldı, Farklı şrübiardan antibiyotik olarak Penisiilinierden Ârapisillin, üçüncü kuşak öephalosporinlerden Cefoperazon, Tetrasikiinlerden Oxy- tetrasikiin, Âminoglycos idlerden Gentamisin seçildik Havalandırılan D8T Broth8 da optimum üretim koşulları saptanarak standardize edildi. En uygun dalga boyu olarak bulunan 4-95 nra"5de, kültürlerin zamana karşı optik dansi- te değerleri ve mililitredeki koloni oluşturan bakteri sayıları saptandı. Bu delerler yarı logaritmik kadıda yerleştirilerek standart üreme esrileri elde edildi,. Üretim süresi ve koşullarına bağlı olarak her antibiyotiğin farklı konsantrasyonlarının etkisi zamana karşı optik dansite okunarak araştırıldı. barklı antibiyotiklerin, E.coli'lerin üs cinsinden üremelerine etkisi, ortamdaki etkin konsantrasyonlarına ve deney süresine bağlı olarak demişti- Deney koşullarının standardize edildiği bu. tip çalınmalar yeterli zaman içersinde yapıldığında, en az hata taşıyan tekrarlanabilir sonuçların elde edilebileceği gözlendi.Sıvı besiyerinde yapılan deneylerde, optimum antibiyotik konsantrasyonu saptanırken; standart koşullarda yeterli zaman aralısında çalışılması gerektiği kanısına varıldı.
Toluenin in vitro şartlarda insan periferik kan lenfositlerine etkisinin SCE (Sİster Chromatid Exchange) yöntemi ile incelenmesi
.
Ege Bölgesindeki glukoz-6-fosfat dehidrogenaz (G6PD) eksikliğine yol açan Akdeniz mutasyonunun DNA teknolojisi ile araştırılması
ABSTRACT SCREENING OF G6PD MEDITERRANEAN MUTATION CAUSING TO SEVERE GLUCOSE-6-PHOSPHATE DEHYDROGENASE DEFICIENCY IN THE AEGEAN REGION BY USING DNA TECHNOLOGY KEYWORDS Aegean region, Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase(G6PD), Severe G6PD deficiency, Acute hemolytic anemia, Fluorescent spot test, G6PD Mediterranean mutation, PCR based mutation screening, Protection from hemolytic crisis. G6PD deficiency is described as a differential decrease of measured normal activ ity of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase(G6PD; E.C.I. 1.1. 49). G6PD deficiency is one of the most common of all clinically significant inherited metabolic disorders. About 7% of the world population is affected from G6PD deficiency. Health problems caused by severe G6PD deficiency include acute hemolytic anemia induced by specific drugs, chemicals, food and infections, neonatal jaundice and hereditary nonspherocytic hemolytic anemia. Decrease on the level of G6PD activity is measured quantitatively or nonquantitatively by determining the amount of NADPH regenerated during the en zymatic reaction. Fluorescent spot test is one of the suggested and standardized non- quantitative tests in the diagnosis of severe G6PD deficiency. So far, 442 biochemical G6PD variants originated from 60 mutations in the G6PD gene(Xq28) have been currently identified according to information obtained in 1 994. Health problems related to G6PD deficiency can be definitely prevented provided that it is determined by biochemical and molecular updated diagnostic tests, and acute hemolytic crisis prevention list is given those who are severely G6PD deficient.Ege bölgesinde ciddi düzeydeki G6PD eksikliğine yol açan Akdeniz mutasyonunun DNA teknolojisi ile araştırılması, çalışmanın amacı olarak belirlendi. Çalışma grubu, Ege bölgesindeki yerleşim birimlerinden gelen 45 aileyi kapsayan 130 bireyden oluşturuldu, înternal ve ekstemal olarak standardize edilen floresans spot testi ile 130 bi¬ reyden 42'sinde ciddi düzeyde G6PD eksikliği saptandı. Alınan kanlardan fenol-kloroform ekstraksiyonu ve etanol ile çöktürme yön¬ temiyle DNA'lar izole edildi. Akdeniz mutasyonunun saptanmasında, PCR+ MboII enzimiyle kesim+ mini horizontal agaroz jel elektroforez teknikleri kullanıldı. G6PD geninde Akdeniz mutasyonunun bulunduğu exon 6-7 bölgesini çoğaltmada Luzzatto L, (1994) grubunun kullandığı 91 ve 92 nolu primerler, tercih edildi. Standart olarak Ak¬ deniz mutasyonu saptanan ve saptanmayan eksternal kontrol DNA'lar kullanıldı. Elde edilen sonuçlar, örnek değişimi yapılmak suretiyle Uluslararası G6PD Eksikliği Re¬ ferans merkezince de (Hematoloji bölümü, Hammersmith Hospital,Londra) doğrulandı. Mutasyon sıklığının saptanmasında yakın akraba olmayan 37 olgu esas alındı. 37 olgunun 29 tanesinin(%78.3) Akdeniz mutasyonu ve geri kalan 8 tanesinin de(%21.6) nonmed olduğu saptandı. Çalışılan bölgede hakim olan varyantın ve mutasyon tipinin Akdeniz(563T) olduğu deneysel olarak doğrulandı. Uluslararası geçerli standartlara uyularak, Ege bölgesinde ciddi düzeydeki G6PD eksikliğinin moleküler temeli ilk defa tanımlanarak, yerel ve evrensel ölçekte G6PD eksikliğinin moleküler temelini aydınlatma çalışmalarına katkıda bulunuldu. Klinisyenlere danışılarak hazırlanan güncel akut hemolitik kriz önlenim tablosu, ciddi düzeyde G6PD eksikliği olan kişilere gönderilerek elde edilen bulgular, uygulamaya konuldu.
NF1 Geni 3'Ucu UTR utr bölgesi mutasyonlarının sscp analizi
Nörofibromatözis 1 Hastalığına neden olan NF1 gen ürünü Nörofibrominin GTPaz ailesi içindeki p21 Ras proteinleri ile etkileştiği bilinmektedir. Nörobibromin üzerinde GAP (GTPase Activating Protein) ile benzer diziye sahip bir bölge açıklanmıştır. Nörofibromin ve GAP'ın her ikisi de Ras yoluyla sinyal iletiminde görevlidir. Ras-GAP proliferatif sinyali iletirken Nörofibromin farklılaşma sinyali oluşturmaktadır. NF hasta tümörlerinde (Shawannomalar) nörofibromin kaybının Ras ın önemli bir negatif düzenleyicisi olduğu gösterilmiştir. Araştırmamızda NF1 geninin 3' ucuna yakın bölgesinde 45-48 Ekzonları içeren bölge üzerinde mutasyon taramayı amaçladık. Mutasyon saptama hassasiyetinin yüksek olduğu bilinen SSCP analizini tarama için uygun bir yöntem olarak seçtik. Poliakrialmid jellerde bantları görüntülemek için oldukça sık kullanılan radyoaktif metod ile çalışma yerine daha güvenli çalışma imkanı sağlayan ve ucuz bir metod olan Gümüş Boyama metodunu kullandık. Sağlıklı bireylerin ve 3 NF1 hastasının lenfositleriyle 7 tümoral kolon dokusunun RT-PCR ürünlerinin SSCP analizinde, mutant bir NF1 alleli saptadık.
Melanositik nevüslerde ve malign melanomda olası genetik değişikliklerin ve mikrosatellit instabilitelerinin sitogenetik ve moleküler genetik yöntemlerle araştırılması
Mikrosatellit instabilitesi Benign melanositik nevüs ve malign melanom (MM) oluşumuna neden olan genetik değişiklikler, tümörigenezin çok aşamalı genetik modeline uyum gösterir. Bu çalışmada, hem melanositik nevüs hem de melanom örneklerinden moleküler ve sitogenetik çalışmalar yapılarak; olası genetik değişikliklerin saptanması amaçlandı. Dokuz MM, altı melanositik nevüs olmak üzere toplam onbeş vakanın doku örneklerinden hücre kültürü hazırlanarak sitogenetik analiz yapıldı. Melanositik nevüslerde sitogenetik olarak bir anomali belirlenmedi. Ancak iki MM örneğinden birinde 46,XX t (7;12) (q22;q24) t (2;11) (p25;q22) translokasyonları, diğerinde ise 47,XX + marker saptandı. Dört displastik nevüs (DN), dört "compound" nevüs, yedi MM ve altı konjenital nevüs olmak üzere toplam 21 vakada parafin bloklardan izole edilen DNA örnekleri, dört ayrı mikrosatellit markeri kullanılarak PCR yöntemiyle amplifiye edildi. Denature edici jelde yürütüldükten sonra gümüş boyama yapıldı. Çalışılan dört ayrı markerin her birinde mikrosatellit değişimleri saptandı. D2S123 markerinde, iki MM dokusunda LOH (Heterozigosite kaybı), bir DN dokusunda MIN (Mikrosatellit instabilitesi); D14S65 markerinde bir DN dokusunda MIN; BAT40 markerinde bir DN dokusunda MIN; D11S29 markerinde bir MM dokusunda LOH ve bir DN dokusunda MIN saptandı. 21 örneğin 7'sinde (% 34), çalışılan mikrosatellit bölgelerinde genetik değişiklik saptandı. D2S123 markerinin "mismatch" tamir genlerine yalan bir yerde yerleşim göstermesi, bu vakalarda "mismatch" tamir genlerinde kayıp olabileceği ve bunun sonucunda replikasyon hatalarının ve MIN'lerin artabileceği şeklinde yorumlanabilir. İki ayrı örnekte D11S29 markerini tanımlayan 11. kromozomun llq23.3 bölgesindeki genetik değişiklikler, diğer kanser türlerinde de etkili olduğu rapor edilen, bir tümör supresör genin bulunma olasılığını düşündürmektedir.
Epitelyal tümörlerde transforming growth faktör beta tip II reseptör mikrosatelit instabilite belirlenmesi
A. ÖZET EPİTELYAL KANSERLERDE TRANSFORMING GROWTH FAKTÖR BETA RESEPTÖR n GENİ (TGF-p RH) MİKROSATELLİT İNSTABİLİTESİNİN BELİRLENMESİ Sefa KIZILDAĞ Anahtar Kelimeler Kolorektal kanser, Bilateral meme kanseri, TGFJ3-RII, MTN Epitelyal dokularda transforming growth faktör beta (TGF0), transforming growth faktör beta reseptör II (TGFP-RII) ye bağlanarak büyümeyi durdurur. Genomik instabilite gösteren insan kolon ve mide kanserlerinde, TGF3-RÜ geninin polinükleotid tekrar bölgesinde p(A)ıo çerçeve kayması mutasyonları tanımlanmıştır. Bu tip mutasyonlar kısalmış reseptör proteinin sentezlenmesine neden olur ve serin-treonin kinaz aktivitesi gösteren reseptörün aktivitesini durdurarak, TGFp ya dirençli hücrelerin oluşumuna neden olurlar. TGFp ya dirençli bu tip hücreler durmaksızın proliferasyona uğrayarak kanser oluşumuna neden olurlar. Araştırmamızda 41 epitelyal kanserin (15 kolorektal kanser ve 26 bilateral meme kanseri) DNA izolasyonları yapıldı ve TGFJ3-RÜ genine özel primerlerle 73 bp lik p(A)ıo tekrarı içeren bölge, PCR reaksiyonu ile çoğaltıldı. PCR reaksiyonu ile çoğaltılan izole DNA lar %8 lik poliakrilamid jel (8M üreli) de yürütüldü ve gümüş boyama ile görüntülendi. Analizi yapılan 15 kolorektal olgunun hiçbirinde ve 26 bilateral meme tümörünün sadece bir tanesinde TGFJ3-RII geninde instabilite saptanmıştır (%3.84).
Cinsiyet kromatini (barr cisimciği) tayini ve non-fonksiyonel x-kromozomlarının klinik tanıda kullanılması ve önemi
ÖZET Bu araştırma, 9 aylık bir periyodda KTÜ. Farabi Hastanesi Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları, Üroloji ve Kadın Doğum Polikliniklerine başvuran 2070 hastadan cinsiyet anomalisi şüphesiyle anabilim dalımıza gönderilen 12 hasta üzerinde yapılmıştır. Yapılan metodolojik çalışmalar sonucunda laboratuvarımızda rutin olarak uygulanan cinsiyet kromatini (Barr Body) yönünden hastalar incelenmiştir. Bu hastalardan 6 adedinde cinsiyet anomalisi, cinsiyet kromatini yönünden doğrulanmıştır. Bu hastalardan 5 adet kız hastadan 4 ü X-kromatini negatif (% 0.00). Turner sendromu, 1 adedi (% 7.00) mozayik ve 7 adet erkek hastadan 1 adedi (% 20.00) interseks olarak belirlenmiştir. Diğer 6 hasta için ise, diğer etkili faktörleri belirlemek için kromozom analizi önerilmiştir. Gelen hastalardan 9 adedinin akraba evliliği sonucu doğduğu ve anne-baba yaşlarının yüksekliğinin anomali oluşumunda etkili faktörler olduğu tespit edilmiştir. Anahtar Kelimeler : Cinsiyet kromatini (Barr Body), X-kromatini), X- kromozomu inaktivasyonu, Lyon hipotezi, Dosaj- komp enzasyonu
Doğu Karadeniz bölgesinde insan sağlığını etkileyen mikroorganizmalara portörlük yönünden martıların incelenmesi
Bu çalışmada Kasım 1989 - Aralık 1990 tarihleri arasında 616 martı dışkı örneği toplandı ve patojen bakteri yönünden incelendi. Bu alanlarda konaklayan martılar şehir çöplüklerinde beslenmektedir, örneklerden 6 serotip izole edildi. Patojen bakteri olarak Salmonella typhi ve Shigella sonnei bulundu. Otuzüç martı dışkı örneğinde dört tane Salmonella typhi, taşınma oranı % 12.2 ve otuzüç tane martı dışkı örneğinde iki tane Shigella sonnei, taşınma oranı % 6.06 dır. Saprofit olarak dört serotip sırasıyla E.Coli, Enterobacter; Proteus, Enterobacter ve Klebsiella bulundu.Anahtar Kelimeler : Salmonellosis, Shigellosis, Çevre Kirliliği, Portör Martılar
Bir flavonoid olarak rutinin TLR4/TRIF/IRF3 sinyal yolu aktivasyonundaki rolünün hormon duyarlı meme kanseri hücrelerinde belirlenmesi
GİRİŞ VE AMAÇ: Meme kanseri, dünya çapında ikinci en yaygın malign neoplazm türü olmakla birlikte hastalığın tedavisi çeşitli klinik özellikler ve kemoterapötiklerin toksik yan etkileri nedeniyle sınırlı kalmaktadır. Bu nedenle yeni terapötik bileşiklerin meme kanserindeki etkilerinin değerlendirilmesi önem arz etmektedir. Toll-benzeri reseptör 4 (TLR4), Toll-benzeri reseptör ailesinin en önemli üyelerinden biridir ve meme kanseri hücrelerinde aşırı ekspresyonu progresyona eşlik etmektedir. Rutin (RUT) bir polifenolik flavonoid olup, gösterdikleri anti-neoplastik etkinlikler nedeniyle kanser immunoterapisinde dikkat çekmektedir. Bu nedenle bu çalışmada RUT'un TLR4/TRIF/IRF3 sinyal yolu aktivasyonundaki rolünün hormon duyarlı meme kanseri hücrelerinde araştırılması amaçlanmıştır. GEREÇ YÖNTEM: RUT konsantrasyonlarının MCF-7 hücrelerindeki sitotoksisitesi WST-1 analizi ile, TLR4 ekspresyon seviyesi RT-PCR analizi ile, TLR4 ve IRF3 hücresel lokalizasyonu IF boyama ile ve anti-migratif etkisi Strach (Çizik) analizi ile tespit edilmiştir. BULGULAR: RUT' un MCF-7 hücrelerinin canlılığını ve migrasyonunu azalttığı, tipik apoptotik morfolojiyi arttırdığı, TLR4 ekspresyonunu baskıladığı, TLR4'ün endozomal lokalizasyonunu ve IRF3'ün nükleer translokasyonunu azalttığı belirlenmiştir. SONUÇ: Çalışmada RUT'un anti-inflamatuar etkinlik ile hormon duyarlı meme kanserinde TLR4'e karşı antagonist aktivite göstererek TLR4/TRIF/IRF3 sinyal yoluna aracılık edebileceği ortaya konulmuştur. Ayrıca, RUT ve TLR aktivasyonun dahil olabileceği hücre kaskadının ortaya konulması için daha fazla in vitro araştırmaya ihtiyaç duyulmaktadır. Anahtar Sözcükler: Apoptoz, flavonoid, meme kanseri, rutin, TLR4
Triple negatif meme kanserinde wee1 inhibisyonunun terapötik etkisinin araştırılması
GİRİŞ VE AMAÇ: Hücre döngüsü kontrol noktaları, DNA'da oluşan hasar varlığında döngünün durdurularak gerekli onarım ve genomik bütünlüğün sağlanabilmesinde temel rol almaktadır. Hücre döngüsü kontrol noktalarında önemli aktiviteye sahip olan Wee1 kinaz, birçok kanser türünde aşırı eksprese edilmektedir. Bu kapsamda, Wee1 inhibisyonunu hedef alan tedavi stratejileri son zamanlarda oldukça öne çıkmaktadır. Bu çalışmada ilk kez triple negatif meme kanserinde (TNMK) Wee1 inhibitörü olarak Azenosertib' in potansiyel terapötik etkinliğinin moleküler düzeyde belirlenmesi amaçlanmaktadır. GEREÇ VE YÖNTEM: Azenosertib'in MDA-MB-231 TNMK ve MCF-10A kontrol hücrelerindeki sitotoksik etkisi CCK-8 analizi ile belirlendi. Annexin V analizi, akridin oranj/ propidyum iyodür boyamasıyla ve hücre siklusu analizleri ile apoptotik etkisi ve hücre siklusunda etkinliği belirlendi. Azenosertib'in MDA-MB-231 hücrelerinde anti-oksidatif etkisinin belirlenmesi için mitokondri boyaması ve ROS analizi gerçekleştirildi. Son olarak, western blot analizi ile Wee1 inhibisyonunun hücre döngüsündeki etkisi aydınlatıldı. BULGULAR: Azenosertib'in MDA-MB-231 hücrelerinde konsantrasyon ve zamana bağlı olarak hücre canlılığını anlamlı bir şekilde azalttığı belirlenmiştir (p<0.01). Hücrelerde apoptotik ölüme neden olmakla birlikte Wee1 protein düzeyinde artışa neden olarak inkübasyon süresine göre hücre siklusunda etkisi belirlenmiştir. Ayrıca, Azenosertib'in TNMK hücrelerinde mitokondriyal hasara ve intraselüler ROS miktarında artışa neden olduğu tespit edilmiştir. SONUÇ: TNMK hücrelerinde ilk kez Azenosertib'in potansiyel antikanser etkinliği moleküler düzeyde belirlenmiştir. Elde edilen bulgular, Azenosertib'in TNMK hücrelerinde Wee1'i aktivitesini inhibe ederek apoptoza ve oksidatif hasara neden olduğunu göstermektedir. TNMK hücrelerinde ilk kez etkisi gösterilen Azenosertib'in apoptozun yanı sıra farklı ölüm tiplerinde ve diğer kanser türlerindeki terapötik etkinliğinin araştırılmasına yönelik yeni çalışmaların gerçekleştirilebilir.
Benign ve malign plevral efüzyon ayrımında total tiyol, native tiyol ve tiyol disülfit seviyelerinin etkisi
Plevral efüzyon (PE), birçok benign ve malign durumun neden olduğu plevral boşlukta sıvı birikmesidir. Kanser, pnömoni ve kalp yetmezliği gibi bazı yaygın hastalıkların çoğunda plevral efüzyon görülür. Benign ve malign plevral efüzyon tanısı için altın standart video yardımlı torakoskopik cerrahi ve plevral biyopsidir. Fakat bu, invaziv cerrahi bir prosedürdür. Benign ve malign olgulardaki plevral efüzyonun oksidan ve antioksidan denge yönünden incelenmesi tanıya katkı sağlayabilir. Bu çalışmada malign ve bening plevral efüzyonların ayrımı için serum ve plevral efüzyonu antioksidan denge yönünden incelemesi amaçlandı. Bu çalışmada hastalar benign (n=18) ve malign (n=32) plevral efüzyon tanısı almış olarak 2 gruba ayrıldı. Hastalardan eş zamanlı olarak plevral mayi ve serum örnekleri toplandı. Mayi ve serum örneklerinde oksidatif stres belirteci olan Toplam Tiyol (TT), Native Tiyol (NT) ve Tiyol Disülfit (D) Toplam Antioksidan Seviye (TAS), Toplam Oksidan seviye (TOS) , Oksidatif Stress İndeksi (OSİ) düzeyleri incelendi. Benign grubun serum TT (364,44±135,85 µmol/L) ve NT (169,94±63,25 µmol/L) düzeyleri, malign grup TT (459,45±221,26 µmol/L), NT (195,80±156,86 µmol/L) düzeylerine göre düşük ve benign grup D düzeyleri (97,25±44,42 µmol/L) malign grup D düzeylerine göre (131,82±81,89 µmol/L) yüksek olmasına rağmen istatistiksel olarak anlamlı değillerdi. Bununla birlikte benign grup PE mayi TT (385,96±189,56 µmol/L), NT (269,5±135,32 µmol/L), D (58,23±44,77 µmol/L) düzeyleri arasında, malign grup TT (372,96±174,79 µmol/L), NT (266,23±142,90 µmol/L), D (53,28±29,94 µmol/L) düzeylerine göre anlamlı bir fark yoktu. Benign grup ve malign grup serum TAS (1,59±0,18 mmol/L; 1,48±0,27 mmol/L, sırasıyla), TOS ( 2,77±1,67 µmol/L; 3,69±1,64 µmol/L, sırasıyla) ve OSİ ( 0,17±0,11; 0,26±0,13, sırasıyla) düzeyleri ve PE sıvısı TAS (1,82±0,37 mmol/L; 1,97±0,35 mmol/L, sırasıyla ), TOS (34,98±22,55 µmol/L; 33,89±24,02 µmol/L, sırasıyla) ve OSİ (2,01±1,51; 1,71±1,08 µmol/L, sırasıyla) düzeyleri arasında fark olmasına rağmen, bu farklar istatistiksel olarak anlamlı değildi. Sonuç olarak, benign ve malign gruplar arasında istatistiksel olarak fark bulunmaması, ayırıcı tanıda bu parametrelerin kullanılmasının henüz uygun olmayacağı, fakat çalışmanın daha fazla sayıda örnek ve ilave parametrelerle tekrarlanmasında yarar olduğu kanaatindeydik. Anahtar Kelimeler: Plevral efüzyon, total tiyol, native tiyol ve tiyol disülfit
Triple negatif meme kanserinde elimusertib ATR inhibitörünün anti-kanser etkisinin belirlenmesi
GİRİŞ VE AMAÇ: Triple negatif meme kanseri (TNMK) heterojen yapıda diğer meme kanseri alt tiplerine göre daha agresif klinik seyre sahip ve bu nedenle mevcut tedavi seçeneklerine dirençli meme kanseri alt tipidir. Kanser hücrelerinde genomik kararsızlığı DNA hasar yanıtı ve onarım mekanizmalarının aktivitesine bağımlıdır. Bu nedenle son yıllarda kanser tedavisinde Ataksi telenjiektazi ve Rad3 ile ilgili (ATR) inhibisyonunu hedef alan yeni tedavi yaklaşımları dikkat çekmektedir. Mevcut tez çalışmasında ilk kez MDA-MB231 TNMK ve kontrol hücrelerinde bir ATR inhibitörü olan Elimusertib' in anti-kanser etkisinin belirlenmesi amaçlanmaktadır. GEREÇ VE YÖNTEM: Elimusertib'in MDA-MB-231 TNMK ve MCF-10A kontrol hücrelerindeki sitotoksik etkisi WST-1 analizi ile belirlendikten sonra, Annexin V, hücre siklusu analizleri ve akridin oranj/ propidyum iyodür boyaması ile apoptozda etkisi analiz edildi. Mitotracker boyaması ve intraselüler reaktif oksijen türlerinin miktarının belirlenmesi ile mitokondriyal hasar değerlendirildi. Ayrıca, western blot analizi ile ATR-Chk1 DNA hasar yanıtında ve apoptotik ölümde etkisi moleküler düzeyinde aydınlatıldı. BULGULAR: MDA-MB-231 ve MCF-10A hücrelerinde Elimusertib'in doza ve zamana bağlı olarak hücre canlılığını anlamlı bir şekilde azaltmıştır (p<0.05). Elimusertib'in TNMK hücrelerinde erken ve geç apoptotik ölüme, G0/G1 fazında tutulmaya ve mitokondriyal hasara neden olduğu belirlendi. Ayrıca, Elimusertib'in TNMK hücrelerinde ATR temelli DNA hasar yanıtını baskılayarak apoptotik ölüme neden olduğu protein düzeyinde analiz edildi. SONUÇ: Bu çalışmada ilk kez ATR inhibitörü olarak Elimusertib'in TNMK hücrelerinde anti-kanser etkisi belirlenmiştir. Bulgular, Elimusertib'in TNMK hücrelerinde ATR temelli Chk1 yolağını etkin bir şekilde inhibe ettiğini ve özellikle p53 mutant TNMK hastalarında yenilikçi bir tedavi seçeneği olabiliceğini göstermektedir. Anahtar Kelimeler: DNA hasar yanıtı, ATR, Hücre siklusu, Apoptoz, Triple negatif meme kanseri.
ALS hastalarının regülatör T lenfositlerinde otofaji düzensizliğinin araştırılması
ÖZET Amaç: Nöroinflamasyon, amyotrofik lateral skleroz (ALS) hastalığının ayırt edici özelliğidir. Regülatör T hücreleri (Treg'ler), bağışıklık toleransı ve nöroinflamasyonun önlenmesinde önemli rol oynamaktadır. ALS hastalarında regülatör Thücresi ve FoxP3 proteininin ekspresyonunda önemli bir azalmanın gözlendiği gösterilmiştir. ALS'de FoxP3+ regülatör Thücresi kaybının ana nedeni bilinmemektedir. Bu çalışmada, ALS'de FoxP3+ regülatör T hücresinde otofaji düzensizliğinin rolü araştırıldı. Yöntem: Çalışmaya 23 ALS hastası ve 24 sağlıklı kontrol dahil edildi. Periferik kandan mononükleer hücreler (MNC'ler) elde edildi, ardından regülatör T hücreleri izole edildi. İzole edilmiş regülatör T hücreleri, FoxP3 ve LC3 antikorları ile boyandı ve hastalarda ve kontrollerde FoxP3+ regülatör T hücresindeki otofaji seviyelerini belirlemek için LC3 belirteci, akış sitometrisi ile incelendi. Bulgular: FoxP3+ LC3+ hücrelerinin ortalaması hastalarda ve kontrollerde sırasıyla 0,47 ve 0,45 idi. FoxP3+ LC3- hücrelerinin ortalaması hastalarda 0,15 ve kontrollerde 0,20 idi, p = 0,030 (p<0,05). Hastalarda ALSFRS-R düşüş oranı ile otofaji düzeyi arasında anlamlı bir ilişki saptanmadı. Ayrıca hızlı ilerleyen ALS hastaları ile yavaş ilerleyen ALS hastaları arasında FoxP3+ regülatör T hücresindeki otofaji düzeyinde anlamlı bir fark bulunmadı. Sonuç: ALS hastalarında FoxP3+ regülatör T hücresindeki aşırı otofaji seviyeleri, artan hücre ölümünün bir açıklaması olabilir ve nöroinflamasyonun kötüleşmesine ve hastalık başlangıcına neden olabilir. Ancak hastalığın ilerlemesi ile FoxP3+ regülatör T hücresindeki otofaji düzeyi ilişkili bulunmadı. Anahtar Kelimeler: ALS, Regülatör T hücreleri, Otofaji, Nöroinflamasyon
Mezenkimal kök hücrelerin in vitro kolon kanser hücre hatlarındaki etkisi
Mezenkimal kök hücre (MKH) kendini yenileme, plastik adherent ve multipotent özellikleri sebebiyle özel bir grup kök hücredir. MKH'ler birçok dokudan elde edilirler ve özellikle kordon kaynaklı dokulardan elde edilen MKH'ler, invazif olmayışlarından dolayı avantajlıdırlar. MKH'ler başlıca rejeneratif tıp alanında ve ayrıca kanser terapilerinde kullanımı konusunda birçok araştırma mevcuttur. Dünyada sıklığı bakımından üçüncü sırada yer alan kolorektal kanser (KRK) tedavisi hem hasta hem de sorumlu olan hekimler için oldukça zorludur. Çalışmamızda MKH'lerin KRK hücreleri (KRKh) üzerindeki terapötik etkisinin incelenmesi amaçlanmaktadır. Çalışmamızın amacı, KRK hücre hattı olarak HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde, kordon kanı kaynaklı (KK-MKH) ve kordon dokusu olan Wharton jeli kaynaklı MKH (WJ-MKH)'lerin apoptotik etkisini incelemekti. 1/5 ve 1/10 (MKH:Kanser) hücre oranları ile 24 ve 72 saatlik inkübasyonlarda in vitro kültür olarak MKH'nin KRKh üzerindeki apoptotik etkisi araştırıldı. Aynı koşullarda sağlıklı periferal kan mononüklear hücreler kontrol grubu deneyi olarak oluşturuldu. İnkübasyon süreleri bittikten sonra Annexin/PI-FITC apoptoz metodu ile flow sitometrik analiz yapıldı. Hem WJ-MKH hem KK- MKH'lerde her iki KRKh'de, her iki oranda ve inkübasyon sürelerinde anlamlı (p<0.05) apoptotik etki gözlemlendi. Ayrıca ELISA yöntemi ile kaspaz-3 ve HTRA2/Omi protein değişimlerine bakıldı. Her iki hücre hattında 24 saat 1/5 oranının WJ-MKH terapisinin anlamlı (p<0.05) olarak daha yüksek olduğu tespit edildi. Bu veriler hem WJ-MKH'nin hem de KK-MKH'nin kolorektal kanserler için olası bir hücre tedavisi olabileceğini göstermiştir. Ayrıca ELISA ile yapılan çalışmalar hem mitotik hem de sitoplazmadaki apoptotik protein değişimlerini göstererek apoptozun indüklendiği yolaklar hakkında bilgi vermektedir.