PKR kinaz aktivasyonunun koryokarsinom hücrelerinde kemoterapötik ajana duyarlılığına etkisi

Amaç: Bu çalışmanın amacı hücre kültüründe çoğaltılan koryokarsinom (swan 71) hücrelerinin PKR aktivasyonu sonucunda proliferasyon ve apoptotik özelliklerinin ne şekilde değişeceğini belirmeyi amaçlandı. Ayrca PKR aktivasyonunun koryokarsinom hücrelerinde kemoterapötik ajan doksorubisine karşı duyarlılığını belirleyerek, kanser tedavisinde kullanabilecek bir alternatif olabileceğini göstermeyi hedeflendi. Gereç ve Yöntem: İlk olarak hücre kültürü yöntemiyle insan plasenta trofoblast karsinom swan 71 hücreleri çoğatıldı. Hücreler, doksorubisin grubu ve poly I:C/LPS/doksorubisin grubu olarak iki gruba ayrıldı. Doksorubisin grubunda doksorubisin, farklı dozlarda (0.39 μg/ml, 1.56 μg/ml, 6.25 μg/ml, 25 μg/ml, 100 μg/ml) hücrelere 24 saat boyunca uygulandı. PKR aktivasyonu oluşturmak için ise LPS ve poly I:C swan 71 hücrelerine 48 saat uygulandı. Ardından gruplar; kontrol, doksorubisin, poly I:C/LPS ve poly I:C/LPS/doksorubisin olarak oluşturuldu. Deney gruplarına göre, hücrelere uygulanan 50 μl poly I:C ve 500 μl LPS 48 saat boyunca inkübasyona, 100 μl doksorubusin ise 24 saat inkübasyona bırakıldı. LPS, poly I:C ve doksorubisinin swan 71 hücreleri üzerine olan etkilerine belirlemek için MTT canlılık testi yapıldı. Daha sonra bu gruplar arasında doksorubisin ile 24 ve 48 saat muamele edilen hücrelerde ve poly I:C/ LPS 48 ve 72 saat muamele edilen hücrelerde flow sitometri yöntemiyle canlılığa, nekroz ve apoptoz yolaklarına bakıldı. Son olarak, deney gruplarına doksorubisin 24 saat ve poly I:C/LPS 48 saat muamele edildi ve bu hücrelerden protein izolasyonu metoduyla protein elde edildi. Ardından, bradford deneyi ile elde edilen protein miktarı belirlendi. PKR aktivasyonun tespiti ve PKR aktivasyonunda doksorubisinin etkisini belirlemek için western blot deneyi yapılarak p-PKR ve a-tubuline bakıldı. Bulgular: İlk olarak hücre sayım cihazıyla yapılan deneyde doksorubisinin farklı dozları ile (0.39 μg/ml, 1.56 μg/ml, 6.25 μg/ml, 25 μg/ml, 100 μg/ml) muamele edilen swan 71 hücrelerinde kontrole oranla doza ve zamana bağlı canlılık yüzdesinde konsantrasyon arttıkça istatistiksel olarak anlamlı azalmalar gözlendi (p < 0,05, p < 0,001). Doksorubisinin farklı dozları ile muamele edilen PKR aktive edilmiş hücrelerde, kontrole oranla doza ve zamana bağlı istatistiksel olarak anlamlı azalmalar gözlendi (p < 0,05, p < 0,001). Doksorubisin, PKR aktive edilen hücrelerde, doza bağlı ve zamana bağlı olarak hücreleri öldürücü etkiye direnç sağlamıştır ve istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Devamında MTT testi; kontrol, LPS/poly I:C, doksorubisin ve LPS/poly I:C/dox gruplarında değerlendirildi fakat sonuç elde edilemedi. Flow sitometride kontrol, LPS/poly I:C, doksorubisin ve LPS/poly I:C/dox gruplarında 24 ve 48 saat canlılık değerlerine bakıldığında ise poly I:C/LPS grubunda kontrole göre anlamlı derecede artış gözlendi (p<0,05, p<0,001). Poly I:C/LPS/dox grubunda ise doksorubisin grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bir artış saptandı (p<0,05, p<0,001). Daha sonra kontrol, LPS/polyI:C, doksorubisin ve LPS/poly I:C/dox gruplarında 24 ve 48 saat süreyle nekroz yolağına bakıldığında, LPS/polyI:C grubunun kontrole oranla nekroz yolağına gitmediği, LPS/polyI:C/dox grubunun ise doksorubisin grubun göre nekroz yolağına gittiği görüldü. Kontrol, LPS/polyI:C, doksorubisin ve LPS/poly I:C/dox gruplarında 24 saat ve 48 saat boyunca apoptoz yolaklarına bakıldığında, LPS/polyI:C/dox grubunun doksorubisin grubuna göre apoptoza gittiği gözlendi. Son olarak tüm gruplarda p-PKR aktivasyonu western blot analiziyle tespit edildi. PKR aktivasyonunun doksorubisinin duyarlılığını engellediği görüldü. Sonuç: Mevcut çalışmada, PKR aktivasyonunun koryokarsinom hücrelerinde bir kemoterapötik ajan olan doksorubisine karşı direnç gösterdiği gözlendi.