68
Archived Theses
0
DOIs Assigned
0%
DOI Rate
Discipline
Optimization and risk assessment of RAB27A-/- gene therapy alternatives using current molecular techniques and technologies
Griscelli Syndrome Type 2 (GS-2) is caused by a mutation in RAB27A which plays a role in exocytosis and membrane trafficking, resulting in immune deficiency. Here, we investigated 1) the efficacy of CRISPR/Cas9 gene editing of RAB27A using GS-2 MSCs and iPSC lines; 2) the efficacy of LV vectors to transduce MSCs and express RAB27A under the control of the SFFV, PGK and UCOE promoters, and 3) potential risks related to overexpression of RAB27A in immune deficient mice. We designed CRISPR/Cas9 constructs that target mutations in RAB27A and tested the gene correction efficacy on GS-2 MSC and iPSC lines. We generated a new GS-2 iPSC line and optimized cell culture/cryopreservation. Although editing of RAB27A using CRISPR/Cas9 is possible, survival of the stem cells was low. Transduction of GS-2 MSCs with LV vectors showed the highest RAB27A expression with SFFV, followed by PGK and UCOE. RAB27A+ MSCs and HSCs were transplanted into immune deficient mice but did not cause tumor formation. However, RAB27A overexpression may affect stem cell function. In conclusion, we compared gene editing with CRISPR/Cas9 and gene adding with LV vectors for the development of gene therapy for GS-2. Although gene editing results in acceptable levels of repair, the technology results in low cell viability. LV gene transfer was easy and robust, but high expression of RAB27A affected stem cell function. Thus, both methods can be developed into gene therapy for GS-2, but optimization of the procedures, increasing cell viability and fine-tuning of expression levels may be necessary before these therapies are ready for clinical use. Keywords: Griscelli Syndrome Type 2, CRISPR/Cas9, lentivirus, stem cells. (*) This study was supported by grants from the Scientific and Technological Research Council of Turkish Government TÜBİTAK no: 219S675 and Hacettepe University Scientific Research Projects Coordination Unit grant no: TUK-2019-17760 and THD-2022-19940.
İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden spermatogonyal kök hücre ve öncülü primordiyal germ hücrelerinin farklılaştırılması ve çoğaltılmasında endokannabinoidlerin etkisi
İnfertilite vakalarının %50'si erkek faktörlü olup, %15'inde germ hücre aplazisi nedeniyle sperm bulunmamaktadır. Üremeye yardımcı tekniklerinin (ÜYTE) protokolleri, germ hücresi aplazili erkeklerin çocuk sahibi olmaları için yetersizdir. İnsan pluripotent kök hücre (iUPKH) kaynaklı primordiyal germ hücreler (iPGH) ve spermatogonyal kök hücreler (iSKH), erkek infertilitesi için otolog bir germ hücre kaynağı sunmakla birlikte in vitro koşulda elde edilme verimleri düşüktür. Endokannabinoid sisteminin (ECS) fare embriyonik kök hücreleri ve insan testiküler mikroçevresinde bulunduğu bilinmekte, ECS'nin iUPKH, iUPKH kaynaklı iPGH ve iSKH'lerdeki olası varlığı ve etkinliği ise bilinmemektedir. Bu tez çalışmasında, iUPKH, iUPKH kaynaklı iPGH ve iSKH'lerde ECS'nin olası varlığı ve uyarıcı etkisiyle germ hücre havuzunun genişletilerek devamlılığın sağlanabileceği varsayılmıştır. Bu varsayımı test etmek için insan dermal fibroblastları (iDF) pluripotentlik belirteçlerini taşıyan iUPKH'lere yeniden programlanmış; iUPKH'lerden Blimp1+, VASA+ iPGH ve ID4+, PLZF+ iSKH'ler farklılaştırılmış, polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), akım sitometrisi (FCM) ve immünofloresan (IF) işaretleme yöntemleri ile karakterize edilmiştir. iUPKH, iPGH, iSKH'ler picomolar- nanomolar seviyelerinde 2-AG ve AEA salgılandığı sıvı kromatografisi/kütle spektrometrisi ile; iDF, iUPKH, iPGH ve iSKH'lerde CB1R, CB2R, TRPV1 ve GPR55 reseptörlerini ifade ettiği qPCR, FCM ve IF yöntemleri ile ortaya konmuştur. iSKH'lerde CB2R ifadesi diğer tüm reseptörlere ve iDF, iUPKH ve iPGH'lerine göre daha fazladır. CB2R agonistleri diğer reseptör agonistlerine göre reseptör dağılımına uygun olarak iUPKH proliferasyonunu daha fazla arttırmış, CB65'in EC50 değeri gerçek zamanlı olarak 78. saatte 2.092x10-8 M olarak belirlenmiştir. CB65, submaksimal dozda iUPKH'lerin pluripotentliğini sürdürmüş, ID4+ iSKH, PLZF+ SKPH ve SCP3+ spermatositlerin farklılaşmasını 10 ve 12. günlerde uyarmıştır. Bu tez çalışmasında, iUPKH ve iUPKH kaynaklı iSKH'lerin CB2R agonizması ile veriminin artışı ilk defa gösterilmiştir. Erkek germ/kök hücre havuzunun CB65 ile zenginleştirilmesi, klinikte tam germ hücre aplazisi olan infertil erkeklere yönelik ÜYTE ile ilişkili protokollerin bir parçası olabilir.
AOC3'ün inflamatuar ve neoplastik kolon hastalıklarındaki rolünün araştırılması
AOC3 geni kromozom 17 üzerinde yer alan ve inflamasyon sürecinde lökosit trafiğinde yer alan AOC3 (VAP-1) proteinini kodlamaktadır. AOC3 endotel, adiposit, perisit, miyofibroblast ve düz kas gibi pek çok farklı hücre grubu tarafından ifade edilmektedir. Membran bağlı ve soluble olmak üzere iki formu bulunan AOC3 proteini gastrointestinal sistem içerisinde stromal hücrelerden olan miyofibroblastlar tarafından da ifade edilmektedir. Bu tez çalışması kapsamında Aoc3'ün in vivo fare hastalık modellerinde kolit ve kolorektal karsinogenez gelişimi üzerine etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu kapsamda, ilk olarak; Finlandiya Turku Üniversitesinden temin edilen Aoc3 nakavt farelerin genotipi doğrulanmıştır. Ayrıca Aoc3 nakavt ve yabanıl farelerdeki Aoc3 ifadesi arasındaki değişim karşılaştırılmıştır. İkinci olarak; Dekstran Sülfat Sodyum (DSS) kolit modeli için kullanılacak DSS'nin konsantrasyonu optimize edilmiştir. Üçüncü olarak; akut kolit modeli oluşturulmuş ve Aoc3 nakavt farelerin, yabanıl kontrol farelerine göre kolite daha yatkın oldukları gözlenmiştir. Dördüncü olarak; Aoc3 nakavt ve yabanıl farelere Azoksimetan (AOM), DSS ve AOM/DSS kombinasyonu uygulanmış ve takip süreleri sonunda inflamasyonla indüklenen kolon kanseri açısından kolonları incelenmiştir. Ancak AOM/DSS uygulaması Aoc3 mutant farelerin sağ kalımını çok kısalttığı için denek sayısındaki azalmaya bağlı olarak istatistiksel olarak anlamlı sonuç elde edilememiştir. Bunun üzerine beşinci ve son olarak; Apc+/- mutant fareler ile Aoc3 nakavt fareler çaprazlanarak Apc+/- Aoc3+/+, Apc+/- Aoc3+/- ve Apc+/- Aoc3-/- farelerden oluşturulan üç grup takip edilmiş ve sakrifikasyon sonrasında Apc+/- Aoc3-/- farelerdeki kolon polip sayılarında Apc +/- Aoc3 +/+ farelere göre istatistiksel olarak anlamlı artış olduğu saptanmıştır. Sonuç olarak; Aoc3 nakavt farelerin DSS ile indüklenen kolit oluşumuna ve kolonik tümörogeneze yabanıl farelere göre daha yatkın olduğu in vivo hastalık modelinde bu çalışma kapsamında gösterilmiştir.
Oksidatif stres altında mezenkimal kök hücrelerde Src-YAP aktivitesi ve apoptoz ile ilişkisi
İmmunomodulatör ve rejeneratif özellikleri ile birçok hastalığın tedavisinde kullanılan mezenkimal kök hücrelerin (MKH) transplantasyon sonrası kaybının nedenlerinden biri de oksidatif stres ile indüklenmiş hücre ölümüdür. Bu nedenle oksidatif stres altında MKH'lerde oluşan hücresel sinyal yanıtlarının araştırılarak aydınlatılması gelecekte yapılacak tedavilerin geliştirilmesine katkı sağlayacaktır. Tez çalışmasında, H2O2 ile oluşturulmuş oksidatif stres altında MKH'lerde Src-YAP aktivitesindeki değişimlere bakılması ve bunun apoptoz ile Bax eksresyonu ve pYAPY357-p73 etkileşimi üzerinden ilişkilendirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, lipo-aspirattan izole edilerek karakterizasyonları yapılmış MKH'lerde oksidatif stres indüklenmesi için H2O2 konsantrasyonu WST-1 analizi ile 300 μM olarak belirlenmiştir. H2O2'in 15,30, 60, ve 120 dakika uygulamaları sonrası hücre içi ROS düzeylerinin arttığı akım sitometri yöntemiyle tespit edilmiştir. Western blot analizlerinde, Src fosforilasyonun arttığı, bunu YAP'ın ve fosforilasyonlardaki artışın izlediği tespit edilmiştir. Western blot ve immunofloresan analizlerinde, YAP ve fosforilasyonlarının çekirdek-sitoplazma dağılımlarının H2O2 uygulaması sonrası değiştiği saptanmıştır. Bax/Bcl-2 oranı H2O2 uygulaması sonrası arttığı tespit edilmiştir. İmmünpresipitasyon analizinde, nükleer ekstraktta p73 ile çöktürülen örneklerde pYAPY357 protein bandı tespit edilmiştir. Bu tez çalışması, belirlenen amaç doğrultusunda, oksidatif stres altındaki MKH'lerde Src-YAP ilişkisini tespit eden ilk çalışma olmakla birlikte pYAPY357'nin arttığını ve çekirdekte lokalize olduğunu göstermesiyle özgündür. MKH'lerde pYAPY357 ve p73 etkileşimi de ilk kez bu çalışmada gösterilmiştir.
Assessment of the effects of melatonin on the funtional deficits induced by cellular stress in obese donor derived mesenchymal STEM cells
Obesity negatively affects different types of stem cells and BM-MSCs from individuals with a high BMI display a severely impaired differentiation capacity, reduced proliferation and increased ER stress. However, the role of oxidative stress (OS) in the development of obesity-related loss-of-stemness and the potential protective role of melatonin (MT) is currently unknown. Here, we evaluated ER stress, OS and senescence in BM-MSCs obtained from healthy (BMI 20-25), obese (BMI of 25-30) and morbid obese (BMI>30) donors. We assessed the proliferative and three-lineage differentiation potential of BM-MSCs in relation with BMI and we investigated whether treatment with MT with or without TUDCA can modulate ER stress, OS and improve cellular functions of obese donor-derived BM-MSCs. BM-MSCs obtained from all donors were morphologically and phenotypically similar. Obese and morbid obese donor-derived BM-MSCs display signs of increased ER stress and moderate OS, resulting in accelerated senescence, decreased proliferation, increased levels of ROS and decreased differentiation capacity. TUDCA partially reversed the effects of obesity-related loss-of-stem cell function. MT stimulated proliferation of healthy BM-MSCs, but was not able to recover loss-of-stemness. Neither TUDCA nor MT alone or in combination were sufficient to completely rescue the differentiation potential of obese donor-derived BM-MSCs. In conclusion, obesity-related loss-of-stem cell function can be contributed to increased ER stress and moderate OS, that can be partially treated with TUDCA.
Hepatosit büyüme faktörü (HGF) ile lisanslanmış mezenkimal kök hücrelerde anti-fibrotik mirna ifade düzeyleri
Daha sonra doldurulacaktır
Myeloid kanserlerde kemik iliği mikroçevresinin metabolik profilinin incelenmesi
Lösemi tanısında, tedavi sonrasında ve relaps/refrakter hastalık durumunda lösemik hücre metabolizmasında izlenen dinamik değişimlerin en iyi göstergesi lösemi nişinin metabolik profilinin çıkarılmasıdır. Bu amaçla, bu projede in vivo lösemik nişteki metabolik ortamı en iyi yansıttığı kabul edilen, kemik iliği plazma örnekleri kullanılarak AML hastaları (N=28) ve sağlıklı vericiler (N=15) arasında karşılaştırmalı metabolom analizleri yapılmıştır. Analizler için 3 ana grup oluşturulmuştur. Birinci grupta lösemik hücre kitlesinin kemik iliği nişinin metabolik profilinde neden olduğu değişimleri değerlendirebilmek için AML hasta örnekleri ile sağlıklı verici örnekleri karşılaştırılmıştır. İkinci grupta, tedavi sonrası lösemik hücre kitlesinin temizlenmesi ile kemik iliği metabolik profilindeki değişimi gösterebilmek amacıyla tedavi sonrası ve tedavi öncesi AML örnekleri karşılaştırılmıştır. Üçüncü grupta ise tedavi sonrası AML ve sağlıklı verici örnekleri karşılaştırılarak iyileşen AML hastalarında kemik iliği metabolik profilindeki normalle dönüş değerlendirilmiştir. AML hasta örneklerinde öne çıkan metabolitler/lipidler; anlamlı artış gösteren lipid metabolizması ile ilişkili olan; triaclyglycerol, sfingolipidler / metabolitleri, fosfolipidler (fosfotidilkolin, fosfoditil ethanolamin, fosfokolin) ve yağ asitleridir. Yine artmış glikoliz ile ilişkili olarak fosfogliserik asit, isomaltoz, laktobionik asit, sitrik asit düzeylerinde anlamlı artış tespit edilmiştir. Ayrıca AML hastalarında sağlıklı vericiler ile kıyaslandığında en çok etkilenen metabolik yolakların; galaktoz, gliserofosfolipid ve askorbat/aldarat metabolizması ile ilişkili yolaklar olduğu görülmüştür. Sonuç olarak, bu çalışma ile AML'de tanı ve tedavi süreçlerindeki lösemik niş ile sağlıklı hematopoietik nişin metabolik profilleri karşılaştırılmış ve aralarındaki belirgin farklılar gösterilmiştir. Bu bulgular lösemik mikroçevrede meydana gelen, lösemi gelişimi/ilerlemesi veya tedavi direnci ile ilişkili olabilecek metabolik değişimlerin genel profilinin çıkarılmasına katkı sağlayacaktır.
Stres uyaranları ile koşullandırılmış insan astrositlerinin fenotipik ve metabolik profilinin incelenmesi
Astrositler, enerji metabolizmasını düzenleyerek, iyon dengesini koruyarak ve nörotransmitter seviyelerini modüle ederek nöronlara temel metabolik destek sağlar. Ancak, stres maruziyetine bağlı olarak astrositler nöron koruyucu özellikleri yerine nörotoksik bir fenotipe geçerek nörodejenerasyona katkıda bulunabilir. Bu çalışmada, astrositlere farklı uyaranlar uygulanmış, çevresel toksinlere ve stres faktörlerine hücresel yanıtları ile aracılık ettiği bilinen Aril Hidrokarbon Reseptörü (AhR) sinyalizasyonu ile ilişkileri araştırılmıştır. Ölümsüzleştirilmiş insan astrositleri 24 saat boyunca farklı ajanlar ve dozlarına (TNF-α 10,100 ng/mL, LPS 100 ng/mL, TGF-β1 2,5,10 ng/mL, AhR agonisti 6-Formylindolo[3,2-b] carbazole/FICZ 100,1000 nM; AhR-antagonisti 1,5 µM Stem Regenin-1 /SR1) maruz bırakıldıktan sonra moleküler ve metabolomik (GC-MS) analizler gerçekleştirilmiştir; RT-qPCR kullanılarak nöroprotektif/nörotoksik astrositler ve AhR'ye özgü gen ifadeleri analiz edilmiştir. TNF-α ve LPS gruplarında inflamatuvar gen ifadelerinin arttığı, TGF-β1 grubunda ise azaldığı gözlemlenmiştir. Tüm gruplarda nörotoksik/nöroprotektif genlerin ifadelerinde anlamlı değişiklikler göze çarpmıştır. Hücre kültür ortamlarının metabolom analizleri sonucunda TNF-α, LPS, SR1 ve düşük doz TGF-β1 gruplarında ornitin seviyelerinde yükseklik ve enerji metabolitlerinin seviyelerinde düşüş görülmüş, ornitinin nörodejenerasyonda potansiyel bir terapötik hedef olabileceği düşünülmüştür. Bu bulgularla birlikte, astrositlerin AhR agonist (FICZ) ve antagonist (SR1)leri ile uyarılması sonucu astrositlerin hem A1 hem de A2 fenotipine özgü genlerde değişiklikler olması astrositlerin bir ara fazına işaret etmiştir. Anahtar Kelimeler: Astrosit, stres, nörotoksik/nöroprotektif fenotip, AhR sinyalizasyonu, nörodejenerasyon. Bu çalışma HÜ-BAP (Proje no: TYL-2022-20617) ve kısmen TÜBİTAK (Proje no: 220S759) tarafından desteklenmiştir.
APC mutant fare modelinde azaltılmış BDNF ekspresyonunun intestinal tümör gelişimi üzerine etkilerinin araştırılması
Wnt sinyalini negatif yönde düzenleyen adenomatöz polipozis koli (Apc) tümör baskılayıcı genindeki mutasyon, kolon kanserlerinde en çok rastlanan mutasyondur. Wnt sinyal yolağı nın düzenlediği genlerden biri olan beyin türevli nörotrofik faktör Bdnf ), kolorektal kanser ler gibi birçok tümör dokusunda yüksek seviyede ifade olur . Bu tez çalışmasında; Apc mutant farelerde Bdnf ekspresyonundaki azalmanın intestinal tümör gelişimine etkilerini araştırmak amaçlanmıştır. Bu kapsamda; 36 hafta boyunca Apc+/-, Bdnf+/-, Apc+/-Bdnf+/- ve yabanıl tip fare deney ve kontrol gruplarını takip ettik ve Bdnf mutasyonunun Apc mutant fareler üzerindeki etkilerini fenotipik ve moleküler düzeyde araştırdık. Deneyler sonucunda; Apc+/- ve yabanıl tip farelere kıyasla, Bdnf+/- dişi ve erkek fare gruplarında; grubun yarısı normal vücut ağırlığına sahipken diğer yarısında belirgin bir kilo artışı olduğu gözlemlendi. Benzer kilo alım ı eğilimi Apc Bdnf farelerde de gerçekleşti. Apc Bdnf fareler de , Apc farelere kıyasla, ilk 6 ay boyunca anemi, zayıflama, kürkte bozulma, postürde bozulma gibi hastalık fenotip leri gö rülmedi . Apc+/- Bdnf+/- farelerin sağkalım süreleri, Apc+/- farelere göre yaklaşık 2 ay kadar arttı. Apc farelerde Bdnf ifadesinin azaltılması ; ince bağırsaktaki poli p sayısını az miktarda azaltırken, kolondaki polip sayısını belirgin olarak artı rdı . Apc+/ Bdnf+/ farelerin tümörlerinde; Bdnf, Trk B , beta katenin ve Lgr5 gen ifadeleri ile matür ve immatür Bdnf ve beta katenin protein düzeyi, Apc farelere göre azaldı, böylelikle kök hücre dinamiklerinin de değişebileceği düşünüldü. Bu çalışma sonucunda; Apc mutasyonu ile başlayan intestinal tümörlerde tedavi için BDNF'in önemli bir aday molekül olabileceği ni düşünmekteyiz.
MikroRNA-21 baskılanmış meme kanseri kök hücrelerinin insan kemik iliğinden izole edilen telositler ve telosit kaynaklı mitokondriler ile ko-kültürü
Bu tez çalışmasının amacı, meme tümöründe de tanımlanmış telositlerin ve telosit kaynaklı mitokondrilerin, meme kanseri kök hücrelerinin tümör gelişimine katkısının miR-21-5p'in üzerinden incelenmesidir. Bu tez çalışması kapsamında, ilk olarak insan kemik iliği mononükleer hücrelerinden CD34 ve CD117 pozitif telositlerin izolasyonu yapılarak akım sitometri, immün floresan boyama ve TEM analiz yöntemleri ile karakterizasyonu gerçekleştirildi ve telosit hücrelerinden mitokondriler izole edilerek immün floresan boyama ile karakterize edildi. Sonraki aşamada MDA-MB-231 meme kanseri hücre hattından CD24- ve CD44+ kanser kök hücreleri izole edilerek akım sitometri ile karakterizasyonları yapıldı. Ardından kanser kök hücrelerinin miR-21-5p ifadeleri anti-miR-21-5p inhibitörünün transfeksiyonu ile baskılandı. Yapılan ko-kültür çalışmalarıyla kemik iliği kökenli telositlerin ve mitokondrilerin miR-21-5p baskılanmış kanser kök hücre idamesindeki rollerini incelenmek üzere vimentin ve ALDH1A1 protein seviyelerindeki değişimler Western Blot ile analiz edildi. SNAI1, LZTFL1, OCT3/4, ABCC11, CHD1 (E-Kaderin) ve CHD2 (N-Kaderin) gen ekspresyon değişimleri RT-qPCR yöntemi ile değerlendirildi. İzole edilen telositler CD44/CD117/α-SMA/CD31/CD45 ve CD34 yüzey belirteçlerini ifade ettiği, aynı zamanda vimentin ve PDGF-β'ya pozitif oldukları görüldü. Telositlerden izole edilen mitokondriler immünfloresan boyama ile takip edildi. Kanser kök hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu sonucunda miR-21-5p inhibisyonu gerçekleştirildi ve miR-21-5p gen ifadesinin inhibitör kontrole göre 132 kat azalmış olduğu RT-qPCR ile doğrulandı. Telositlerin ve mitokondrilerin miR-21-5p inhibe edilmiş kanser kök hücreleri ile ko-kültür sonrasında ise miR-21-5p, SNAI1, ABCC11, N-Kaderini, vimentin ve ALDH1A1 ifadelerinin düştüğü; E-Kaderin ve LZTFL gen ifadelerinin artığı saptandı. Bu tez ile ilk defa meme kanserinin ilerlemesinde telositlerin ve telosit kaynaklı mitokondrilerin miR-21-5p üzerinden EMT geçişini düşürebileceğini ve kanser metastazını azaltıcı bir etki gösterebilme potansiyeli bulunabileceğini gen/protein seviyesindeki analizlerle ortaya konmuştur.
Investigating the effects of PKNOX2 and its interactors in P53 pathway regulation in bone marrow mesenchymal stem cells
Mesenchymal Stem Cells (MSC) are good platforms to study in-vitro molecular mechanisms. Like all cells, MSCs detect and respond to various stimuli with molecular signal mechanisms. p53 signal pathway is a well-known molecular mechanism for transduction of cellular stresses such as DNA damage. p53 signal pathway is heavily regulated in both transcription and post-translational modification of its elements. PKNOX2, a member of TALE homeodomain protein family, is a transcriptional activator of p53. In a previous study by Günel-Özcan lab group, protein interactors of PKNOX2 were determined by proteomics analysis following Co-immunoprecipitation. For this study, the interactors of PKNOX2 from proteomics was compared with the interactors of p53 obtained from BioGRID database and two proteins, DNAJA1 and RPS3 were selected as possible common interactors with possible signaling functions under stress conditions. In this study, three different sources of DNA damage stress, H2O2, DEB and γ-Irradiation were applied to human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells (BM-MSC) and protein expression levels of DNAJA1, RPS3, p53 and PKNOX2 were measured with western blotting. PKNOX2 expression was found to be decreasing in DEB and γ-Irradiation significantly, p53 expression was found to be increasing in H2O2 application significantly. Expression levels of RPS3 and DNAJA1 were found to be stable under stress. Co-Immunoprecipitation was performed with anti-PKNOX2 and anti-p53 antibodies but the results were inconclusive for any interactions. Co-immunoprecipitation protocol was improved. Further study with this improved protocol is needed to unveil these interactions.
Akut myeloblastik lösemi (AML) hastalığı hücrelerinin aptamer temelli akım sitometrik profillenmesi
kısa, kendisine özel üç boyutlu konformasyonel yapıya sahip ve özel bağlanma bölgeleri bulunan tek zincirli oligonükleotid dizileridir. Aptamerler, SELEX ismi verilen yönemle üzerinde çalışılmak istenen hücreye spesifik olarak üretilebilmektedirler. Aptamerler düşük immünojeniteye sahip olmaları, daha kararlı yapıda olmaları ve üretim aşamasındaki kolaylığından ötürü diğer ilginlik ajanlarına göre özellikle antikorlara muadil bir molekül olarak görülmektedir. AML tanısı, çeşitli tanı yöntemlerine ek olarak hücrenin yüzeyindeki çeşitli yüzey proteinlerine antikorlarla boyama yapılan akım sitometri yöntemi ile desteklenir. Akut miyeloid lösemi hastalığında, sağlıklı insanlara göre yüzey proteinlerinde önemli farklılıklar görülmektedir. Bazı proteinlerde fazla ekspresyon, bazılarında ise daha az ifade edildiği literatürde gösterilmiştir. AML hastalığına ait hücrelerle AML olmadığı bilinen hücreler aynı koşullar altında aptamer bağlanma çalışmaları yapılmış ve akım sitometrik analizleri yapılmıştır. Yapılan deneylerde çıkan sonuçlar kıyaslandığında aptamerlerin AML tanısında antikorlara muadil olduğu çalışmaları destekler şekilde olmuştur. Ayrıca aptamerlerin lösemik kök hücrelerin tanınmasında kullanılabileceği bulunmuştur. Aptamerlerin bu yüzey proteinlerine tutunması ve akım sitometri deneylerinde elde edilen bağlanma profilleri göz önünde bulundurulduğunda hastalığın tanısının aptamlerler aracılığı ile yapılmasının ve aptamerlerin bağlandığı proteinlerin AML'ye özgü olan proteinler olduğunu ve bu proteinlerin tanımlanmasının önü açılacaktır. Anahtar kelimeler: Aptamer, akut miyeloid lösemi, akım sitometri
Allojenik mezenkimal kök hücreler ve mikroakışkan sistemle vücut dışında testisteki spermatogonyal kök hücre mikroçevresinin devamlılığının sağlanması
Prepubertal kanser vakalarında kemo ve radyoterapi uygulamaları nedeniyle erkek hastaların yarısında infertilite görülmektedir. Kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (KİMKH) Sertoli hücreleriyle proliferatif faktörler salgılama karakterleri ve embriyonik kökenleri ortaktır. Mikroakışkan sistemleri (MaS), vücutta mikrovasküler akışı modelleyen yüksek teknolojik tıbbi cihazlardır. Tez çalışmasıyla geliştirilen MaS'ta KİMKH salgıları kullanılarak spermatogonyal kök hücrelerin (SKH) proliferasyonu ve farklılaştırılması hedeflenmiştir. Çalışma; disiplinler arası, rastgele seçilmiş, kontrol grubu içeren, ileriye yönelik in vitro deneysel araştırma şeklinde yürütülmüştür. Bağımlı değişkenler ölçüm parametreleri, bağımsız değişkenler MaS, asılı damla (AD) sistemleri; KİMKH salgılarının kullanılıp kullanılmadığı gruplar ve zamandır (7, 28 ve 42 gün). Histokimyasal boyamalara göre tübül epiteli kalınlığı, lümen çapı, spermatogonyum, spermatosit ve spermatid sayısı KİMKH salgısı kullanılan gruplarda kullanılmayan gruplara göre; MaS gruplarında AD gruplarına göre daha yüksektir (p<0.05). SALL4 immün işaretli SKH sayısının KİMKH ve MaS gruplarında kontrol gruplarına göre yüksek olduğu ortaya konmuştur (p<0.05). PLZF, c-Kit ve VASA işaretlemeleri ile sırasıyla SKH, spermatojenik seri hücreleri ve germ hücreleri akım sitometrisi ile değerlendirilerek histokimyasal ve immünhistokimyasal işaretlemelerin sonuçları doğrulanmıştır (p<0.005). KİMKH-KB ve MaS kullanımında 7, 42. günlerde testosteron seviyesinde kontrol gruplarına göre artış görülmüştür (p<0.005). Çalışmadan elde edilen verilerle KİMKH salgılarıyla desteklenen MaS'ta testis kültürünün, yenidoğan farede in vitro spermatogeneze olumlu etkisi ortaya konmuştur. Gerçekleştirilen özgün tasarım ve cihaz üretimi, ülkemizin önemli bir sağlık sorununda yurt dışına bağımlılığı azaltarak sağlık ekonomisine yeni bir çözüm sunacak bir model oluşturmuştur.
İnsan somatik hücrelerinin uyarılmış plüripotent kök hücrelere yeniden programlanması sürecinde arilhidrokarbon reseptörü sinyalizasyonundaki değişimlerin incelenmesi
Somatik hücrelerin in-vitro ortamda yeniden programlanarak uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (uPKH) geliştirilmesi, hastalık modelleme, ilaç araştırmaları için önemli fırsatlar sunmaktadır. Somatik hücrenin plüripotentliğe doğru de-diferansiyasyonla yeniden programlanma (Reprogramming, YP) sürecinde etkili mekanizmaların aydınlatılması ve optimal koşulların oluşturulmasına yönelik bilgi ve deneyim kazanılması gerekmektedir. Bu tez çalışması, uPKH'lerin YP aşaması ve kültürde çoğaltma sürecinde, bir zenobiyotik reseptörü olan ve hücre kaderinin yönlendirilmesinde kilit rol oynayan Arilhidrokarbon Reseptör (AhR) sinyalizasyonunun değişimleri araştırmak üzere planlanmıştır. AhR sinyalizasyonunun yeniden programlanma sürecindeki değişimlerinin incelenmesi amacıyla yapılan deneylerde başlangıç hücresi olarak mezenkimal kök hücreler kullanılmış, OSKM faktörlerinin aktarımı epizomal plazmitlerin elektroporasyonuyla gerçekleştirilmiştir. Yeniden programlanmanın ilk yedi günlük süreci ve ardından belirlenen zaman aralıklarında ve ileri pasaj uPKH'lerde, hücrelerin morfolojik değişimleri ve AhR sinyalizasyonu ilişkili gen/protein ifadeleri, somatik hücre/MKH kimliğinin kaybı, mezenkimal-epitelyal geçiş (MET) ve plüripotensi-ilişkili gen ifadeleri araştırılmış, ayrıca AhR agonist (FICZ) ve antagonist (StemRegenin-1) kullanımı ile ön deneyler yapılmıştır. MKH'lerin YP sürecinde AhR ve ilişkili moleküllerin uyarıldığı gözlemlenmiştir. İleri pasaj uPKH'lerde ise AhR gen ifadesinin baskılandığı, AHRR ve pluripotensi ile artan IDO-1 (İndoleamin-pirol 2,3-dioksijenaz)'in ifadesinin arttığı gösterilmiştir. Bu bulguların, hücre biyolojisi ve köklülük durumunun belirlenmesinde AhR sinyalizasyonunun regülatör rolünü düşündürmüştür. Anahtar Kelimeler: Uyarılmış plüripotent kök hücre, yeniden programlama, zenobiyotik, plüripotensi, Aril hidrokarbon Reseptörü (AhR). Bu çalışma Hacettepe Üniversitesi BAP, TYL-2022-19977 No.lu proje kapsamında desteklenmiştir.
Podosit hasar modelinde indüklenmiş mezenkimal kök hücrelerin etkisi
Mezenkimal Kök Hücre (MKH) tedavisi, bu hücrelerin kendini yenileyebilme, multipotent ve immünmodülasyon özellikleri yanı sıra reddedilme risklerinin düşük olması ile, Fokal Segmental Glomerüloskleroz (FSGS) gibi progresif yıkıcı hastalıkları için önemli bir terapötik seçenek olabilir. Podosit hasarı nedeniyle böbrek yetmezliğine ilerleme potansiyeli olan FSGS'nin tedavisinde kullanılan kortikosteroid ve diğer immunosupresif ilaçlar kısmen işe yaramakta, son dönem böbrek yetmezliği nedeniyle böbrek transplantasyonu olan hastalarda ise nakil sonrası hastalık tekrar nüks edebilmektedir. Bu tez çalışmasında insülin büyüme faktörü-1 (IGF-1) ve hepatosit büyüme faktörü (HGF) ile MKH'lerin indüklenmesinin (IGF-1+HGF_MKH), MKH'lerin terapötik etkisini güçlendireceği hipotezini test etmek için puromisin aminonüklozid (PAN) ile in vitro ve in vivo podosit hasar modeli üzerinde IGF-1+HGF_MKH etkisinin incelenmesi planlandı. Öncelikle IGF-1+HGF_MKH'lerin detaylı karakterizasyonu yapıldı. IGF-1+HGF_MKH'lerin CD200, CD271, CD184/CXCR4, SSEA4 tümörojenite ile ilişkili belirteçlerini ifade etmediği, yara çizgisinde daha hızlı kapanış, IDO-1 ve TGF-β gen ifadelerinde, pikolinik asit metaboliti, IL-6, MCP-1 ve anjiojenin salgı düzeylerinde artış gözlendi. In vitro PAN hasarı yapılmış podosit hücreleri üzerinde IGF-1+HGF_MKH'nin bozulmuş podosit aktin hücre-iskeleti yapısını düzelttiği, podosite özel INF2 gen ifadesini artırdığı görüldü. In vivo sıçan FSGS modelinde IGF-1+HGF_MKH uygulamasının konvansiyonel MKH'lere göre proteinüriyi daha fazla azalttığı ve ultrastrüktürel olarak slit diyafram kayıplarını geri döndürdüğü saptandı.
Assessment of the antioxidative and antiapoptotic effects of delta-opioid peptide D-ALA2-leu5-enkephalin on survival on hematopoietic stem cells
Hematopoietic Stem Cells (HSCs) are adult stem cells with the capacity for self-renewal and differentiation into all blood cell lineages. When HSCs are used for transplantation or gene therapy purposes, they can be exposed to short term cell culture and/or freezing procedures. However, the viability and function of HSCs may be negatively affected by oxidative and endoplasmic reticulum stress induced by these processes. There is a need for the development of novel short term HSC expansion protocols that are highly effective, non-toxic and protect cell viability. Therefore, in the framework of this thesis, the role of Delta Opioid Receptor (DOR) activating synthetic peptid D-Ala2-Leu5-Enkephalı̇n (DADLE) on in vitro expansion, oxidative stress, ER stress and hypothermic storage of HSCs was assessed. Umbilical Cord Blood CD34+ HSCs were exposed to oxidative stress induced by H2O2 and ER stress induced by Tunicamycin (TM) and Thapsigargin (TG). Cell proliferation was assessed using WST-1; cell cycle analysis were done using BrdU; apoptosis was measured with Annexin-V/Propidium Iodide and the formation of Reactive Oxygen Species were assessed using H2DCFDA. RT-qPCR was used to investigate the effect of these stress conditions on gene expression of HSCs. Although DADLE was able to protect HSCs in vitro from oxidative stress and ER stress inducing molecules, DADLE was not able to protect HSCs from hypothermia-induced apoptosis. In this study, the effects of DADLE on HSCs were determined for the first time. Alone or in combination with other anti-oxidants or ER stress protective agents, DADLE might be helpful in the development of novel protocols for the ex vivo expansion of HSCs for clinical use, by promoting their survival through enhanced viability and by supporting their long-term maintenance and/or stemness. Key Words: DADLE, Hematopoietic Stem Cells (HSCs), Oxidative Stress, ER Stress, Hypothermia.
İnsan göbek kordon veni CD146+ hücrelerin ve bu hücrelerden elde edilen matriks proteinlerinin in vitro biyofilm modellerinde değerlendirilmesi
Yaraların tedavilerinde antimikrobiyal etkileri olan hücrelerin veya hücrelerden arındırılmış deselülerize matrikslerin yara bölgesine uygulanması son yıllarda dikkat çekmektedir. Bu tez çalışmasının amacı, antimikrobiyal etkiye sahip olabileceği düşünülen CD146+ kök hücrelerin ve bu hücrelerden elde edilen ekstraselüler matriks proteinlerinin (deselülerize matriks) in vitro biyofilm modellerinde değerlendirilmesidir. Bu tez çalışması kapsamında, CD146+ kök hücrelerin karakterizasyonu; hücre yüzey belirteçlerinin tayini ve farklılaşma analizleriyle, deselülerize matriksin karakterizasyonu; histolojik/immünfloresan boyamalar ve proteom analizleri ile belirlendi. CD146+ kök hücrelerin, biyofilm oluşumuna katkısını gözlemleyebilmek için, Pseudomonas (P.) aeruginosa ve Staphylococcus (S.) aureus bakterileri ile ko-kültürleri yapılarak hücre canlılık ve proliferasyonları WST-1, Annexin V/PI ve kristal viyole ile değerlendirildi. Aynı zamanda CD146+ kök hücrelerin, olası antimikrobiyal etkilerinin gözlemlenmesi amacıyla disk difüzyon yöntemi kullanıldı. CD146+ kök hücrelerin ve deselülerize matriks proteinlerinin biyofilm oluşumuna etkileri damlamalı akış modelinde test edilerek biyofilm oluşumunda görev alan genlerin ekspresyon seviyeleri kantitatif reverse transkriptaz-PZR yöntemiyle belirlendi. Elde edilen veriler sonucunda; CD146/105+ kök hücrelerin adipojenik yönde farklılaşabildiği ancak osteojenik farklılaşma kapasitelerinin bulunmadığı saptandı. Deselülerize matriks karakterizasyonu, DAPI ve Masson-Trikrom boyamaları ile tayin edildikten sonra proteom analizleriyle matriks bileşenlerinde kollajen, glikoprotein, proteoglikan ve büyüme faktörleri saptandı. Bakteri + hücreli/deselülerize kültürlerde, bakterilerin proliferasyonlarını arttırdıkları gözlemlendi. P. aeruginosa ve S. aureus kullanılarak tasarlanan biyofilm modelinde, deselülerize yapının P. aeruginosa biyofilm oluşumunu anlamlı olarak azalttığı, S. aureus için ise hücreli gruba kıyasla deselülerize grupta anlamlı bir fark bulunmadığı belirlendi. Gen ekspresyon analizi sonuçlarına göre, P. aeruginosa biyofilm ile ilişkili genlerden rhlR ve LasR için anlamlı azalım saptanmış olup, bu biyofilm hücre sayım sonuçlarını destekler niteliktedir. S. aureus' un tutunma genleri olan icaADBC genlerinin hepsi deselülerize grupta yüksek oranda eksprese edilmiştir. Bu tez çalışması, hedeflenen amaç doğrultusunda insan kaynaklı fetal kök hücrelerin ve onlardan elde edilen matriks proteinlerinin klinik uygulamalarda önemini ortaya koyan ilk çalışmadır. Anahtar kelimeler : CD146+ hücreler, kök hücreler, biyofilm, ekstraselüler matriks proteinleri, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, göbek kordonu.
Gene expression omnibus (GEO) veribankası kaynakları kullanılarak nöral krest kaynaklı dental kök hücrelerinin, nörojenik rejenerasyon ile ilişkili gen ifade profillerinin karşılaştırılmalı olarak incelenmesi
Merkezi ve periferik sinir sistemi hücre ve dokuların önemli bir kısmı nöral krest kökenlidir ve diş ve çevresinde yer alan nöral krest kökenli mezenkimal kök hücrelerin nörodejeneratif hastalıklara yönelik rejeneratif terapilerde kullanılabileceği düşünülmektedir. Bu araştırmanın amacı, dental ve periodontal alanda yer alan mezenkimal kök hücre tiplerinin nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde kullanım potansiyellerinin, moleküler biyoloji düzeyinde biyoinformatik yöntemleri ile değerlendirilmesidir. Bu araştırmada; Gene Expression Omnibus (GEO) veri tabanında yer alan araştırmalardan elde edilen veriler, Transcriptome Analysis Console ve STRING-db yazılımları kullanılarak analiz edildi. Analizlerde, dental kök hücreler, nörojenik farklılaşma kapasiteleri kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler ile karşılaştırıldı. Dental kaynaklı kök hücrelerin, kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelere göre nöronal yapıların gelişimi ve fonksiyonuyla ilgili ifade düzeylerinin daha yüksek olduğu görüldü. Bu etkinliğin, ortaya çıkmasında ASPM, SLİT2, PTN ve SEMA3A gibi genler ve ilişkili oldukları proteinlerin rol oynayabileceği belirlendi. Dental kaynaklı kök hücreler, kendi aralarında değerlendirildiğinde ise benzer profillere sahip oldukları görüldü. Dental pulpa kaynaklı kök hücrelerde daha yüksek düzeyde ifade edilen LRRTM2 ve WFDC-1 genler ve ilişkili proteinlerin özellikle sinaptik iletim ile ilgili biyolojik süreçler yer aldığı görüldü. Dental kaynaklı kök hücreler, köken aldıkları nöral krest hücreleri ile kıyaslandığında incelenen 40 binden fazla genden sadece %30'unun benzer düzeyde ifade edildiği görüldü. Sonuç olarak; transkriptom verilerine göre dental kaynaklı kök hücrelerin gen ifade profilleri açısından, kemik iliği kaynaklı mezenkimal hücrelere göre nöronal yapılara yönelik rejeneratif tedaviler için daha uygun oldukları görülmektedir. Anahtar Kelimeler: Dentak kaynaklı kök hücreler, nöral krest hücreleri, nörodejeneratif hastalıklar, dental pulpa kaynaklı kök hücreler, transkriptom
Baş boyun kanserli hastaların tükürük örneklerinden izole edilen eksozom ve bakterilerin, sağlıklı kemik iliği mezenkimal kök hücreler üzerine etkilerinin değerlendirilmesi
Baş ve boyun kanserlerinin gelişiminde tümör mikroçevresinde yer alan, hücreler arası ve çevre sağlıklı dokular ile etkileşimden sorumlu olan komponentler son yıllarda dikkat çeken bir konu haline gelmiştir. Bu tez çalışmasının amacı, skuamoz hücreli baş ve boyun kanserlerinde tükürükten izole edilen eksozomların ve spesifik bakteri türünün (Streptococcus (S.) mitis) kanserleşmedeki etkisinin, sağlıklı kemik iliği mezenkimal kök hücreler (MKH) üzerinden değerlendirilmesidir. Bu tez çalışması kapsamında baş ve boyun kanseri hastalarının tükürük örneklerinden eksozom izolasyonu yapılarak, akım sitometri, ELISA ve geçirimli elektron mikroskopu ile karakterizasyon yapıldı. Aynı zamanda bu klinik örneklerden S. mitis izolasyonu da yapılarak, polimeraz zincir reaksiyonu, optokin duyarlılık testi ve katalaz testi ile karakterizasyon analizleri gerçekleştirildi. Sağlıklı kemik iliği mezenkimal kök hücreler ile ko-kültür çalışmaları yapılarak mezenkimal-epitelyal geçiş ile ilşkilendirilen sitokin/kemokin/büyüme faktörlerinin ekspresyonları sitokin array ile, CD44 ve integrin alfa 6 ekspresyonları akım sitometri ile, vimentin ekspresyonları ise immünfloresan inceleme ile değerlendirildi. Elde edilen veriler sonucunda; vimentin, integrin alfa 6 ve CD44 ekspresyonlarının tüm gruplarda görüldüğü ancak S. mitis / MKH ko-kültür grubunda diğer gruplara göre farklılık gösterdiği saptandı. Ko-kültür ortamlarındaki sitokin/kemokin/büyüme faktörleri değerlendirildiğinde bakteriyel floranın eksozomlara eklenmesinin mezenkimal-epitelyal geçişi desteklediği görüldü. Bu tez çalışması, hedeflenen amaç doğrultusunda baş ve boyun kanserli hastalardan izole edilen eksozom ve bakterilerin, ko-kültür çalışmalarıyla mezenkimal-epitelyal geçişte etkilerini değerlendiren ve klinik uygulamalar açısından önemini ortaya koyan ilk çalışmadır.
Sağlıklı insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden (uPKH'lerden) NGN2, LHX3 ve ISL1 üçlü kasedi kullanarak motor nöron eldesi
Nörodejeneratif hastalıklar bireylerin yaşam standartını düşüren, önemli fonskiyonel kayıplara yol açan, ilerleyici ve ölümcül hastalıklardır. Amyotropik lateral skleroz (ALS) hastalığı motor nöron dejenerasyonunun yol açtığı bir hastalıktır ve alt-üst motor nöronları etkilemektedir. ALS hastalığında Superoxide dismutaz (SOD1) genin yanı sıra yaklaşık 40 gen mutasyonunun da bu hastalıkta etkin olduğu görülmüştür. Spinal müsküler atrofi (SMA), SMN1 ve SMN2 genlerindeki mutasyonlar sonucu ortaya çıkan kalıtsal bir hastalıktır. SMA hastalığı motor nöronları etkileyerek kas distrofisine sebep olur. Bireyin merkezi, periferik ve iskelet kas sisteminin kontrollü kas hareketlerini etkiler ve giderek artan güçsüzlük, kas kütlesi kaybı semptomları ile karakterizedir. Nörodejeneratif hastalıkları çalışabilmek için çeşitli yöntemler kullanılmakta fakat insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (uPKH'ler) insan hastalıklarının seyrini anlayabilmek ve kişisel tedavi yöntemlerini geliştirmek için güçlü bir alternatif oluşturmaktadır. Bu tez çalışmasında sağlıklı insan uPKH'lerinden Neurogenin 2 (NGN2), Islet 1 (ISL1), LIM homeobox 3 (LHX3) üçlü piggyBac plasmid kaseti kullanılarak motor nöron elde edilmiştir. uPKH'lere piggyBac üçlü kaseti lipid-aracılı transfeksiyon yöntemi ile transfekte edilmiş ve stabil transfekte olan hücreler puromisin seleksiyonu ile seçilmiştir. Doksisiklin ile uyarılan hücrelerde transkripsiyon faktörlerinin aşırı ifadesi sağlanarak uPKH'lerin nöral soya geçişi sağlanmıştır. Elde edilen motor nöronların karakterizasyonu nöronal gen ifadelerine bakılarak ve nöronal belirteçlerle immün floresan boyanarak yapılmıştır. İleride çeşitli ilaç denemelerinin yapılacağı motor nöron hastalıklarını modellemek için kullanılacak bu yöntem ile ön veri sağlanmış ve yöntem optimize edilmiştir.
Sağlıklı insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden kortikal nöron elde edilmesi
Uyarılmış pluripotent kök hücreler kişiye özel tedavi olanağı sağlaması, hastalık modelleme ve ilaç denemeleri açısından benzersiz bir kaynaktır. Hastandan alınan kan veya fibroblast hücrelerinden çeşitli transkripsiyon faktörleriyle veya küçük moleküllerle hedef doku ve organ oluşumu sağlanabilir. Böbrek, kalp, karaciğer, beyin vb. doku ve organlara farklılaştırma imkânı bulunmaktadır. Bunların arasında en ilgi çekici olanı şüphesiz beyindir. Diğer doku ve/veya organların aksine biyopsi imkanının olmaması nedeniyle çalışılması zor bir bölgedir. Hastadan alınan kan ve/veya fibroblast örneğine Yamanaka faktörlerinin transferi ile pluripotentlik özellik kazandırılmasının ardından uygun farklılaşma protokolleri ile sinir hücrelerine veya organoide farklılaşma sağlanabilir. Bu tez çalışmasının amacı sağlıklı insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden (uPKH) altı adet küçük molekül kullanarak 12-15 gün içerisinde kortikal nöron eldesini sağlamaktır. Bu kapsamda karakterizasyonu tamamlanmış olan sağlıklı insan uPKH'leri kültürde çoğaltılmıştır. Pluipotentsi belirteçlerini koruduğu kontrol etmek amacıyla qPCR ve immun floresan boyamalar ile teyit edilmiştir. Nöronal yönde farklılaşma deneyleri için hücrelere altı küçük molekülden oluşan kokteyller her gün farklı dozlarda uygulanmıştır. Hücrelerin morfolojik durumu her gün ışık mikroskobu altında izlenmiştir. Protokolün sonunda hücrelerden RNA toplanmış ve immun floresan boyamalar yapılmıştır. Yapılan qPCR deneylerinin sonucunda pozitif kontrole göre elde edilen hücrelerde kortikal nöron belirteçlerinden DCX , FOXG1 ve REELİN ifadelerinde anlamlı bir artış gözlenmiştir. İmmun floresans boyamalarda nöron belirteçleri olan MAP2 ve TUJ1 pozitif hücreler gözlemlenmiştir.
APC mutant fare intestinal organoidlerinde WNT yolak modülasyonunun kök hücreler üzerine etkilerinin araştırılması
Kolorektal kanser (KRK) gelişiminin en önemli nedenlerinden bir tanesi WNT sinyal yolağında rol alan genlerin mutasyonlarıdır. Vakaların büyük çoğunluğunda WNT sinyal yolağı yıkım kompleksinde negatif düzenleyici olarak görev almakta olan APC tümör baskılayıcı gen mutasyonlarına rastlanmaktadır. Çok hızlı bir çoğalma ve yenilenme sürecine sahip olan intestinal epitel hücrelerde WNT sinyal yolağı yüksek aktivite göstererek intestinal kök hücrelerin ve doku homeostazının düzenlenmesinde aktif görev almaktadır. APC genine ait mutasyonların çoğunluğu yıkım kompleksinin bir diğer elemanı olan AXIN bağlanma bölgesinde gerçekleşmektedir. Yıkım kompleksi elemanlarında oluşan çeşitli mutasyonlar nedeniyle görevini tam olarak yerine getirememektedir. Β-catenin proteini yıkım kompleksi tarafından sitoplazmik bölgede proteozomal degradasyona uğrayamadığında çekirdeğe translokasyonu gerçekleşmekte ve böylece TCF/LEF transkripsiyon faktörünün düzenlenmesinde görev aldığı WNT hedef genlerinin transkripsiyonel aktivitesini arttırmaktadır. Bu tez çalışması kapsamında laboratuvarıma özgü mutant ApcΔ750 fare ince bağırsak dokularından üretilen olan intestinal organoidlerde WNT ilişkili genlerden Ctnnb1, Axin2 ve Lgr5 RNA düzeyinde incelenmiştir. Analizlerin sonucunda bu genlerin ifadelerinin ApcΔ750 intestinal organoidlerde yüksek olduğu ispatlanmıştır. Tez çalışmasının birincil amacı olarak, anti-kanser etkisi olduğu bilinen XAV939 ve Niklozamit ilaçlarının ApcΔ750 organoidlere uygulandığında Ctnnb1, Axin2 ve Lgr5 gen ifadelerinin RNA düzeyinde azaldığı gösterilmiştir. Ayrıca immünfloresan boyama tekniği uygulanarak kript ve villus domeynlerindeki Ctnnb1 protein seviyesi incelenmiştir. Böylece XAV939 ve Niklozamitin KRK oluşumu öncülü organoidlerdeki Wnt sinyal yolağını inhibe ettiği ve bununla ilişkili olarak İKH aktivasyonunu baskıladığı gözlenmiştir. Çalışmanın ikincil bir amacı ise laboratuvarımızda üretilen ApcΔ750 fare modelinin in vitro çalışmalarda da başarı sağladığını gösterebilmektir.
Nörofibromatozis tip 1(NF1) kaynaklı mezenkimal stromal hücrelerin detaylı karakterizasyonu
Nörofibromatozis Tip 1 (NF1) genetik hastalıklar içinde sık rastlanan, Nörofibromin (NF1 geni) tümör süpresör geninde mutasyon sonucu ortaya çıkan ve otozomal dominant olarak kalıtılan bir hastalıktır. Gen ürünü olan nörofibromin'in eksikliği sinir sistemi gelişiminde aksamaya, hücre içi mitojenik sinyallerde ve beraberinde hücre proliferasyonu ve farklılaşmasında değişikliklere sebep olur. Bunun sonucunda neoplazm gelişimine yatkınlık oluşur. En sık görülen tümörler, nörofibromlar, Schwann hücrelerinden gelişen, içlerinde fibroblastlar, zengin damar yapıları ve mast hücreleri bulunduran kompleks tümörlerdir. Deri ve derialtı nörofibromlarının, ayrıca pleksiform nörofibrom adı verilen, büyüklük ve yerlerine göre belirgin görüntü ve işlev sorunlarına yol açabilen, malign karakter de kazanabilen tipleri vardır. NF1 hastalarında sık rastlanan diğer klinik bulgular arasında kemik defektleri, kanamaya yatkınlık, yara iyileşmesinde gecikme ve hematolojik maligniteye yatkınlık yer almaktadır. Bu çalışmada NF1'in klinik bulgularının ortaya çıkmasında veya seyrinde mikroçevre elemanları olarak mezenkimal kök/stromal hücrelerin(MSH)/fibroblastların katkısının araştırılması amaçlanmıştır. Stromal karakterde destek hücreleri olan MSH/Fibroblastlar çeşitli büyüme faktörleri, sitokin, kemokinler salgılayarak indirekt veya diğer hücrelerle (örn. tümör hücresi, endotel, epitel) direkt ilişkileri yoluyla hücrelerin proliferasyon, apoptosis, migrasyon gibi biyolojik davranışlarını etkilemektedirler. NF1 hastalarının MSH/Fibroblastları da taşıdıkları mutasyondan dolayı farklılaşma ve yaşam süresi bakımından normal bireylerinkilerden farklı olabilirler. Bu çalışmada NF1'de mezoderm kökenli bu hücrelerin mikroçevre ve NF1 patogenezi üzerine etkilerinin incelenmesi amacı ile hasta ve sağlıklı bireylerin dokularından elde edilen MSH/Fibroblastların ayrıntılı karakterizasyonu ile adipojenik ve osteojenik farklılaşma potansiyelleri incelenmiş, hastaların dermal, pleksiform nörofibrom dokuları ve/veya cafe au lait veya sağlıklı cilt bölgesinden MSH/Fibroblastların karakterizasyonları, yara iyileşmesindeki (scratch assay) farklılıkları ve ayrıca Schwann hücreleri ile etkileşimlerinin araştırılmasına yönelik çalışmalar yapılmıştır.
Kemik iliği yağ tabakasından elde edilen mezenkimal kök hücrelerin karakterizasyonu ve subkutan yağ ve kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücreleri ile karşılaştırılması
Tonyalı G., Kemik İliği Yağ Tabakasından Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin Karakterizasyonu ve Subkutan Yağ ve Kemik İliği Kökenli Mezenkimal Kök Hücreleri İle Karşılaştırılması. Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Kök Hücre Programı Yüksek Lisans Tezi, Ankara, 2020. Kemik iliği yağ dokusu (KİY) diğer adipoz dokulardan farklı özelliklere sahiptir. Son yıllarda yapılan çalışmalarla kemik iliği yağ dokusunun akut myeloblastik lösemi (AML) gelişimi/progresyonu üzerine etkileri gösterilmiş, farklı tip kanserlerde de kemik metastazlarına katkıları bildirilmiştir. Bu tez çalışmasında, sağlıklı donörlerin ve lösemiye yatkınlık oluşturduğu bilinen Fankoni anemili hastaların KİY tabakasından elde edilen mezenkimal kök hücrelerin (MKH) karakterizasyonu yapılmış, in vitro adipojenik uyarıya cevapları incelenmiş ve standart yöntemle Kİ mononükleer hücrelerinden elde edilen Kİ-MKH'ler ve subkutan yağ dokusundan (SKY) geliştirilen MKH'ler ile karşılaştırılmıştır. Bunun yanında, lösemik hücre ile Kİ mikroçevre etkileşiminde ve lösemi patogenezinde rolü olabileceği ileri sürülen moleküllerden galektin-3, FABP-4, Leptin-R, PDGFR-α ifadeleri de incelenmiştir. Literatürde KİY dokusu ile yapılan çalışmalardan farklı yöntemle KİY tabakasının kültürü ile elde edilen MKH'lerin, Kİ-MKH ve SKY-MKH'lerinden farklı özelliklere sahip olduğu, adipojenik gen ifadeleri ve cevap oluşma sürelerinde farklılıklar bulunduğu, adipojenik uyarım altında moleküler değişimlerin farklılık gösterdiği, FA hastası MKH'lerinin adiposit farklılaşma cevaplarının da sağlıklı Kİ-MKH ve KİY-MKH'lerinden farklılık gösterdiği saptanmış, bu durumun FA hastalarında Kİ'de adipojenik disregülasyonuna işaret edebileceği düşünülmüştür. Ayrıca AML (HL-60) hücreleri ile ko-kültür ortamında meydana gelen fenotipik değişiklikler araştırılmış, ön veriler elde edilmiş, ileri araştırmaların yapılması hedeflenmiştir.
Mezenkimal kök hücre üretiminde in vitro temelli metabolomik ve analizler
Çalışmamızda MKH'ler FBS, PL, PPP ve KİP varlığında ve ayrıca LPS varlığında inflamatuvar ortama maruz bırakılarak farklı eklentilerin etkisi araştırılmıştır. Eklentilerinin MKH proliferasyonu, farklılaşma özelliklerine etkileri, hücrelerin ve kültür ortamının metabolomik profili çalışılmıştır. Analizler sonucunda 479 metabolit anlamlı değişmiş, intrasellüler 242 metabolit tanımlanmıştır. Besiyerleri ve hücre kültürleri süpernatanlarında 605 ekstrasellüler metabolit saptanmış, bunların 116'sı tanımlanmıştır. PL içeren ortamda MKH'lerin daha çok glikolitik metabolizmaya yöneldiği, glutamin tüketiminin yüksek olup hücrelerin glutaminolizise yöneldiği ve inflamasyon durumunda bu yolakların rolü olabileceği, MKH'lerin PL ortamında daha immünsupresif, antiinflamatuvar ve senesensi önleyici özelliğe sahip olabileceği düşünülmüştür. FBS içeren besiyeri ortamında genel olarak amino asit seviyeleri diğer eklentilere göre daha yüksek bulunmuş, metionin, treonin ve alaninin FBS ortamında, glutamik asit ve aspartik asitin ise PL ortamında daha fazla tüketildiği saptanmıştır. Hücrelerin immünolojik özelliklerini belirlemede önemi gösterilmiş olan LysoPC PL'ta, LysoPE FBS'de daha yüksek bulunmuş, bu eklentilerle çoğaltılan hücrelerin immünmodulatuvar özelliklerinin farklı olabileceği düşünülmüştür. LPS uyarımı sonucu elde edilen bulgular da bunu desteklemiştir.
Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin araştırma amaçlı bankalanmasında standardizasyon ve kalite süreci - bir uygulama modeli: "pedi-stem"
Uyarılmış pluripotent kök hücre (uPKH), vücudun herhangi bir hücresinin genetik yapısı değiştirilerek, bu hücreye laboratuvar ortamında embriyonik kök hücre benzeri pluripotent özellik kazandırılması ile elde edilir. uPKH, başta nadir/kalıtsal hastalıklar olmak üzere, birçok hastalık mekanizmasının anlaşılması, yeni ilaç/hücre/gen araştırma ve tedavilerinin, organoid teknolojilerinin geliştirilmesi alanındaki potansiyeli ile çoklu üretim/bankalama gereksinimi doğmuş olan hücre modelidir. Dünyada, araştırma amaçlı uPKH bankalamanın yanısıra gen tedavisi ilacı olarak tedavide kullanılmak üzere pre-klinik/klinik çalışmalar başlatılmış olup bu hücrelerin tedavide kullanılmak amacıyla bankalanmasında biyolojik/biyoteknolojik ilaçların düzenlemeleri geçerlidir. Ancak araştırma amaçlı uPKH bankalanmasında standardizasyon ve kalite süreci henüz tamamlanmış değildir. Bu tez kapsamında, insan üzerinde kullanılmayacak biyolojik materyalin araştırma amaçlı biyobankalanması için hazırlanmış olan ilk standardın (ISO 20387:2018), bir (uPKH) biyobanka oluşumunda referans alınarak, "uPKH üretim" basamağı ile ilgili kalite unsurlarını belirlemeye yönelik özgün değerlendirmeler, neden-sonuç analizleri (Ishawa diyagramları) ve deneysel çalışmalar yapılmıştır. Bu kapsamda, araştırma amaçlı ulusal bir uPKH banka modeli için bilimsel/yazınsal araştırmaya dayalı iş akışı, organizasyon şeması ve banka birimleri gibi temel bileşenler sunulmuştur. Ayrıca, uPKH üretim/yeniden programlama sürecinde, tanımlanmış hücrelerin erken aşamada ayrıştırılmasında kullanıma yönelik, hücrelerdeki metabolik değişim parametrelerinden mitokondriyal kütle ve aktivite değerlendirmeleri sonucunda ROS parlaklığının, değişen ortam koşullarına duyarlılığı dikkat çekmiştir. ROS temelli bir ölçüm sisteminin uPKH elde edilişinde kullanılabilecek bir kalite süreç bileşeni olabilirliğini destekleyici ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Bu çalışma, araştırma amaçlı uPKH bankacılığına yönelik yapılmış, ilk ulusal tez çalışmasıdır.
Mezenkimal kök hücre yaşlanmasında NF-KB/P65 ve PKNOX2 protein-protein etkileşimlerinin incelenmesi
Mezenkimal kök hücreler in vitro kültürde pasajlamalar sonucu replikatif yaşlanmaya uğrayarak kök hücre özelliklerini kaybeder. Grubumuzun daha önceki çalışmalarında sağlıklı Kİ-MKH'de PKNOX2 proteini ile yapılan ko-immünopresipitasyon (ko-İP) sonrası proteomiks analizlerinde PKNOX2 ile etkileşime giren proteinler arasında yaşlanma ilişkili sekretomların ana düzenleyicisi olarak kabul edilen Nüklear Faktör-κB'nin p65 alt ünitesi (NF-κB/p65) bulunmuştur. Bu tez çalışmasında; 1) kültür ortamında yaşlandırılan Kİ-MKH'lerde PKNOX2 ve p65/RelA protein düzeylerinde değişim olup olmadığının araştırılması, 2) PKNOX2 ve NF-κB/p65 (RelA) etkileşiminin kanıtlanması ve 3) yaşlanma sürecindeki etkileşim değişimlerinin olup olmadığının incelenmesi amaçlanmıştır. Replikatif yaşlanma SA-β-Gal boyaması ve p16, p21 protein seviyeleri ile değerlendirildi. Genomik stres, γH2AX seviyeleri immünofloresans görüntüleme ile tespit edildi. Western blotlama sonuçları, PKNOX2 protein düzeylerinin replikatif yaşlanma ile azalma eğiliminde olduğunu gösterdi. 200 μM H2O2 ile indüklenen oksidatif stresin Kİ-MKH'de genel olarak NF-κB/p65 protein düzeylerini arttırdığını gösterdi. Ko-İP sonrası western blotlama ve in situ proximity ligation assay (PLA) teknikleri ile NF-κB/p65 ve PKNOX2 etkileşimde olduğu in vitro ve in situ tespit edildi. PLA analizleri, NF-κB ve PKNOX2'nin etkileşimlerinin Kİ-MKH'lerinin hem sitoplazma hem de çekirdeğinde mevcut olduğunu gösterdi ve etkileşim düzeylerinin 9. pasajda arttığını ve pasaj 12'de düştüğünü gösterdi.
Hematopoetik kök hücre gen tedavi kültür koşulları ve engrafman optimizasyonu
RAG2, ağır kombine immün yetmezliği (AKİY), nadir görülen, T-/B-/NK+ kalıtsal bir primer immün yetmezliktir (PİY) ve hematopoetik kök hücre (HKH) nakli ile tedavi edilmektedir. Uygun donör bulunmadığında bu hastaların başka tedavi seçeneği olmadığından otolog hücreler kullanılarak gen tedavisi (GT) geliştirilmesine gerek duyulmaktadır. AKİY'lere yapılan nakillerde, HKH'lerin kemik iliği (Kİ)'ne yerleşmesi ve uzun ömürlü engraftman sağlanması için hafif hazırlık rejimleri uygulanmaktadır. RIC'e bağlı toksisite ve yan etkileri önlemek amacıyla alternatif hazırlık rejimi protokollerinin geliştirilmesine de gerek duyulmaktadır. Bu tez çalışması kapsamında; 1) ex vivo fare HKH kültür koşullarının optimizasyonu yapılmıştır, 2) Busulfan (BU) yerine, zararsız granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) ve very late antigen 4 inhibitörünün (VLA-4I) HKH engraftmanı destekleyebilmesi araştırılmıştır, 3) RAG2 fareler, LV-SF-RAG2co veya LV-UCOE-RAG2co devamlı aktivasyonu sağlayan promotör içeren lentiviral konstraktlar ile transdüse edilmiş HKH'lerle nakledilmiştir. Bu çalışmada kısa dönem ex vivo HKH kültürlerinde sadece mTpo'nun eklenmesi yeterli olduğu gösterilmiştir ve bu koşullar LV transdüksiyonlarda kullanılmıştır. Metilasyona dirençli UCOE promotörü, daha güçlü SF promotörüne göre RAG2 farelerde GT 6 ay sonrası periferik kan ve dalakta daha yüksek CD3 ve CD19 oranları vermiştir. G-CSF veya VLA-4I hazırlık rejimi uygulanan RAG2 farelerin HKH nakli ve HKH GT'den sonra engraftman kinetikleri BU grubundan farklı olmasına rağmen 6 ayda immün hücreleri değerlendirildiğinde hem G-CSF hem de VLA-4I'nin kullanımının BU kadar etkili olduğu gösterilmiştir. Bu tez çalışması ile sadece RAG2 için değil, aynı zamanda diğer AKİY hastalıklarında uygulanabilecek yeni bir hazırlık ve tedavi süreci geliştirilmiştir ve ileride klinikte hastaların tedavi veya tedavi desteği olarak kullanılabilmesi için bir alt yapı oluşturulmuştur.
Methionine metabolism in human fetal, adult and cancer stem cells
Methionine is an essential amino acid critical in protein synthesis and methylation reactions. In this thesis, it is aimed to determine the effect of methionine on different human stem cell groups. Mesenchymal stem cells (MSC) derived from human bone marrow (BM) and umbilical cord blood (UCB), breast cancer stem cells isolated from MDA-MB-231 cell line, were treated with different doses of L-methionine in culture. Cell surface marker and cell cycle assessment were performed by flow cytometry. WST-1 was applied for the cell viability determination. Changes in gene expressions (OCT3/4, NANOG, DMNT1, DNMT3A and DNMT3B, MAT2A and MAT2B) with methionine supplementation were examined by RT-qPCR, the changes in histone methylation (H3K4me3, H3K27me3) levels were demonstrated by western blot analysis and SAM/SAH levels by ELISA. As a result of treatment with 0, 10, 25, 50 and 100 µM methionine, cell viability was determined >80% and methionine application for five hours was determined as a fixed time in future studies. In all three cell groups, the cells were mostly arrested in the G0/G1 phase for each culture condition. It was evaluated that BM-MSCs increased all investigated gene expressions in the culture medium containing 100 µM methionine, in addition to SAM/SAH levels. On the other hand, UCB-MSCs were found to increase OCT3/4, NANOG and DNMT1 gene expressions and decrease MAT2A and MAT2B expressions in culture medium containing 10 µM methionine. Moreover, an increase was observed in the He3K4me3 methylation profile. In addition, OCT3/4, NANOG, DNMT1 and MAT2B gene expressions in CSCs increased more at 50 and 100 µM starting from the addition of 25 µM methionine. An increase was determined in H3K4me3 protein expression at 50 and 100 µM methionine supplemented culture condition. This study demonstrates that methionine plays a critical role in metabolism and epigenetic regulation in different stem cell groups, and induces the maintenance of stem cells by regulating pluripotency-related gene expression and protein levels. Keywords: : methionine, stem cell, pluripotency, methylation, metabolism
Assessment of the role and antioxidative and antiapoptotic effects of delta-opioid peptide d-ala2-leu5-enkephalin on the viability of hematopoietic stem cells
Mammadova A., Assessment of the Role and Antioxidative and Antiapoptotic Effects of Delta-opioid Peptide D-Ala2-Leu5-Enkephalin on the viability of Hematopoietic Stem Cells, Hacettepe University Graduate School of Health Sciences Stem Cell Program Master Thesis, Ankara, 2019. Hematopoietic Stem Cells (HSCs) are adult stem cells with the capacity for self-renewal and differentiation into all blood cell lineages. When HSCs are used for transplantation or gene therapy purposes, they can be exposed to short term cell culture and/or freezing procedures. However, the viability and function of HSCs may be negatively affected by oxidative and endoplasmic reticulum stress induced by these processes. There is a need for the development of novel short term HSC expansion protocols that are highly effective, non-toxic and protect cell viability. Therefore, in the framework of this thesis, the role of Delta Opioid Receptor (DOR) activating synthetic peptid D-Ala2-Leu5-Enkephalı̇n (DADLE) on in vitro expansion, oxidative stress, ER stress and hypothermic storage of HSCs was assessed. Umbilical Cord Blood CD34+ HSCs were exposed to oxidative stress induced by H2O2 and ER stress induced by Tunicamycin (TM) and Thapsigargin (TG). Cell proliferation was assessed using WST-1; cell cycle analysis were done using BrdU; apoptosis was measured with Annexin-V/Propidium Iodide and the formation of Reactive Oxygen Species were assessed using H2DCFDA. RT-qPCR was used to investigate the effect of these stress conditions on gene expression of HSCs. Although DADLE was able to protect HSCs in vitro from oxidative stress and ER stress inducing molecules, DADLE was not able to protect HSCs from hypothermia-induced apoptosis. In this study, the effects of DADLE on HSCs were determined for the first time. Alone or in combination with other anti-oxidants or ER stress protective agents, DADLE might be helpful in the development of novel protocols for the ex vivo expansion of HSCs for clinical use, by promoting their survival through enhanced viability and by supporting their long-term maintenance and/or stemness. Key Words: DADLE, Hematopoietic Stem Cells (HSCs), Oxidative Stress, ER Stress, Hypothermia.
Mezenkimal kök hücrelerin ın vıtro koşullarda testis mikroçevresi ve spermatogonyal kök hücre havuzunun korunmasına etkisinin araştırılması
Önen, S. Mezenkimal Kök Hücrelerin in vitro Koşullarda Testis Mikroçevresi ve Spermatogonyal Kök Hücre Havuzunun Korunmasına Etkisinin Araştırılması. Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Kök Hücre Programı Yüksek Lisans Tezi, Ankara 2019. Çocukluk çağı kanserlerinde kemo-radyoterapi sonrası testiste germ hücresi hasarı sonucu hastalarda %46 oranında infertilite görülmektedir. Erkeklerde puberteye kadar spermatogenez başlamadığından testisten olgun sperm eldesi mümkün olmayıp, spermatogonyal kök hücrelerin, in vitro koşullarda uzun süreli kültürü sağlanamamaktadır. Mezenkimal kök hücreler, spermatogenezin devamlılığında asıl etkili Sertoli hücreleriyle embriyonik köken, gen ekspresyon profili ve farklılaşma potansiyeli açısından benzerdir. Sertoli hücrelerine kimyasal destek sunacak mezenkimal kök hücreler, in vitro koşulda testis nişinde kök hücre havuzunun korunmasına katkı sağlayabilir. Bu çalışmanın amacı, in vitro koşulda allojenik mezenkimal destekli hava sıvı interfaz tekniği ile tasarlanmış indirekt kokültür sistemindeki C57BL/6 türü yenidoğan fare testis şeritlerinde yapı, işlev ve spermatogonyal kök hücre canlılığının 1, 2, 4 ve 6 hafta süreyle korunmasıdır. Mezenkimal kök hücreler deneylerde kullanılmak üzere karakterize edilmiş; kokültür sisteminin etkinliği akım sitometrisi, histokimyasal ve immünohistokimyasal kantitatif yöntemlerle ortaya konmuştur. Mezenkimal kök hücreler, in vitro koşullarda indirekt kokültür ortamında 1-6 hafta arasında seminifer tübül (p<0.05) ve 2. 6. haftada lümen alanını (p<0.05) arttırıcı etki göstermiştir. Mezenkimal kök hücreler kokültür ortamında 1-6 haftalar arasında SALL4 ile işaretli; 1 ve 2. haftada PLZF ile işaretli spermatogonyal kök hücre; 6. haftada c-Kit işaretli ileri farklılaşmış spermatojenik seri hücre sayısını kontrole göre arttırmıştır (p<0.05). Sonuç olarak, kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin in vitro kokültür sisteminde destekleyici etkisi ortaya konduğundan, klinikte gonadotoksik tedavi öncesi izole edilen testis şeritlerinin bu sistemle in vitro koşullarda korunabilmesinde kullanılabilecek tedavi stratejilerine iyi bir aday olabileceği saptanmıştır. Anahtar sözcükler: Testis, organ kültürü, kokültür, mezenkimal kök hücre, spermatogonyal kök hücre
Characterization of acute myeloid leukemia stem cells by niche like coculture system
AML heterogeneity show evidence of hierarchical cellular organization and at the top of this hierarchical structure there is a rare group of LSCs. It was mentioned that there is an association between LSCs and disease prognosis. For better understanding of the leukemogenesis and therapy resistant mechanism, LSC in vitro culture is important and still challenging area. In this study, LSCs were maintained using niche like co-culture system in AML patient samples for long-term culture. Proliferation rate, blastic colony formation capacity, leukemia cobblestone formation capacity and ALDH activity was evaluated for determining the LSC frequency, and their self-renewal and leukemia formation capacity in leukemia population. For short-term culture, proliferation index was determined using CFSE analysis. Unlike healthy donor samples, blastic colony formation and cobblestone area formation were observed in AML samples. Majority of cell populations in the control samples show low ALDH activity whereas, AML samples show intermediate ALDH activity. Besides, in ALDH intermediate population LSC percentage was stable during long-term culture for AML samples. For remission samples the LSC percentage decreased. There was a dispersion among sample proliferation capacity because of the heterogeneity. Selected LSC surface markers (VEGFR-2, CD25, TIM3 ve CLL-1) can be used to determine LSC in leukemia samples for distinguishing HSCs and their expressions levels higher in AML diagnose and relapse samples than remission samples. In conclusion, using this niche like coculture system especially at the time of diagnose and ALDH assay, we can determine the LSC frequency and get information for early prognose. This in vitro assay can be used to assess investigating pathways of chemoresistance and screening of new LSC-targeted therapies.
Kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinde PKNOX2 proteinin ATM ve RNF8 ile etkileşimlerinin incelenmesi
Son araştırmalar transkripsiyon faktörü PKNOX2'nin tümör baskılayıcı bir protein olduğunu ve Fanconi anemisi hastalarının kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerinde (Kİ-MKH'lerinde) azaldığını göstermiştir. Günel-Özcan grubunun yayınlanmamış çalışmasında PKNOX2 ko-immunopresipitasyon sonrası proteom analiz listesinde PKNOX2'nin etkileştiği proteinler arasında ATM ve RNF8 proteinlerinin düşük 'coverage' değeri ile saptanmış olması PKNOX2'nin DNA onarım yolağında rol oynayabileceğini düşündürmüştür. Bu çalışmanın amacı bu hipotezi test etmek için, PKNOX2 proteini ile ATM ve RNF8 proteinlerinin etkileşimini doğrulamak ve bu etkileşimin DNA hasarı ile durumunu Kİ-MKH'lerinde araştırmaktı. Etkileşimlerin doğrulanması için Kİ-MKH'lerine PKNOX2 overekspresyon plazmidi elektroporasyon ile aktarıldı ve protein izolasyonu sonrası, ko-immunopresipitasyon ve Western blotlama yapıldı. Ko-IP sonrası Western Blot analizleriyle PKNOX2 ile ATM etkileşimi doğrulanırken, IgG heavy chain kirliliği olabileceği değerlendirmesi PKNOX2 ile ATM veya RNF8 etkileşiminin varlığı in situ proximity ligation assay (PLA) ile gerçekleştirilmiştir. PLA yöntemiyle bu etkileşimlerin hem sitoplazma hem çekirdek içinde olduğu saptanmıştır. DNA hasarı durumunda etkileşimleri incelemek için ɣ-irradiye edilen Kİ-MKH'lerde DNA hasarı oluştuğu akım sitometri yöntemiyle doğrulanmıştır. PI boyaması ile yapılan akım sitometri analizlerinde hücre döngüsü piklerinde keskin ayrışma olmadığından kesin sonuca varılamamakla birlikte DNA hasarına uğrayan hücrelerin G2 fazında tutuklandığı bulunmuştur. ɣ-irradyasyon ile DNA hasarına uğrayan hücrelerde PLA, PKNOX2 ile ATM etkileşimini gösterememiştir ancak PKNOX2-RNF8 etkileşimi artmıştır. Sonuç olarak PKNOX2 transkripsiyon faktörünün ATM ve RNF8 ile etkileştiği literatürde ilk kez olarak gösterildi. DNA hasarı ile etkileşimlerdeki değişim daha ileri çalışmalar ile doğrulanmalıdır.
Olfaktör mukozal mezenkimal kök hücrelerin nöral farklılaşmasında peptit jellerin etkisinin ın vitro incelenmesi
Merkezi Sinir Sistemi (MSS) hastalıklarında henüz etkili bir tedavi yöntemi bulunmamaktadır. Özellikle de nörodejeneratif hastalıkların görülme sıklığı gün geçtikçe artmakta ve etkin tedavi yöntemleri geliştirilememektedir. Sinir onarımı, büyük ölçüde izole edilmiş hücrelerin ekstraselüler matris ve nörotrofik faktörlerle desteklenmesi gibi sinir doku mühendisliği yaklaşımları ile başarılabilir. Son zamanlarda kök hücreler kendilerini yenileme ve farklılaşma gibi benzersiz özelliklerinden dolayı sinir doku mühendisliği uygulamalarında odak haline gelmiştir. Sinir kök hücrelerinin izolasyon zorluklarının göz önünde bulundurulması mezenkimal kök hücrelerini gündeme getirmiştir. Özellikle de olfaktör mukozal mezenkimal kök hücrelerinin (OM-MKH) nöral farklılaşmaya eğilimli olduğu öne sürülmüştür. Bu bilgilerden yola çıkarak bu tez çalışmasında genç sıçandan izole edilen OM- MKH'leri kullanıldı. İzole edilen hücrelerin nöral farklılaşması doku mühendisliği yaklaşımlarından biri olan kendiliğinden dizilebilen peptit jel ile desteklendi. Ekstraselüler matris görevi gören kendiliğinden dizilebilen PuraMatrix peptit jelinin oligodendrositlere farklılaşmasını ve çoğalmasını desteklediği daha önce gösterilmiştir. Bu tez kapsamında da OM-MKH'lerinin nöral farklılaşması, PuraMatrix peptit jeli ve besi ortamına verilen çeşitli nöral büyüme faktörleri ile desteklendi. Özetle, bu tez çalışması ile OM-MKH'lerinin 2 boyutlu (2B) ve 3 boyutlu (3B) in vitro nöral farklılaşma kapasiteleri ve PuraMatrix peptit jelin bu farklılaşmaya etkileri incelendi. Farklılaşmanın karakterizasyonu beta-III-tübülin, sinaptofizin, glial fibriler asidik proteini (GFAP) ve oligodendrosit belirteci 4 (O4) gibi nöral belirteçler kullanılarak immünohistokimyasal boyama, beta-III-tübülin, sinaptofizin, tirozin hidroksilaz belirteçleri kullanılarak gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ve nöral morfolojiyi belirlemek amacıyla taramalı elektron mikroskop görüntüleme deneyleri aracılığıyla yapıldı. Deney sonuçlarına göre PuraMatrix peptit jelinin OM-MKH'lerinin nöron benzeri hücreye farklılaşmalarını olumlu yönde desteklediği belirlendi. Anahtar Kelimeler: OM-MKH, puramatrix, nöral farklılaşma, sinir doku mühendisliği
Ursodeoksikolik asidin sirolimusa maruz kalmış yağ doku kaynaklı mezenkimal kök hücre hattı üzerine etkilerinin incelenmesi
Mezenkimal kök hücre (MKH) tedavileri günümüzde tıbbın birçok alanında deneysel ve klinik olarak uygulamaya girmiş önemli tedavi yöntemleridir. Klinik vakalarda organ nakli sonrasında immunsupresif ilaçların yanında destek amaçlı olarak hastalara MKH nakledilmesi gittikçe yaygınlaşmaktadır. Yapılan bu çalışmadaki amaç organ nakillerinde immunsupresif amaçla kullanılan Sirolimus'un, insan yağ doku kaynaklı mezenkimal kök hücreler üzerindeki sitotoksik etkilerinin araştırılması ve antioksidan özelliği bilinen Ursodeoksikolik asitin (UDKA), bu toksisite üzerine etkilerinin araştırılmasıdır. İnsan yağ doku kaynaklı mezenkimal kök hücre hattı ticari olarak temin edilmiştir. Özel besiyerleri içinde üretilen insan mezenkimal kök hücreleri yeterli sayıya ulaşana kadar 37 ° C'de inkübe edilmiştir. Etken maddelerin sitotoksik etkileri WST-1 testi ile zaman ve doz bağımlı olarak değerlendirilmiştir. Canlılık ve proliferasyon analizleri için ışık mikroskobu ve hücre sayım cihazı, apoptoz ve hücre siklusu değerlendirmeleri için ise Muse® hücre analiz cihazı kullanılmıştır. Biyokimyasal yöntemlerle lipit peroksidasyonu, süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesi, katalaz (CAT) aktivitesi, glutatyon peroksidaz (GPX) aktivitesi ölçülmüştür. Gruplara uygulanan ajanların sitotoksik dozları WST-1 testi ile bulunmuştur. Anneksin V ile apoptotik olmayan, erken apoptotik, geç apoptotik, toplam apoptotik ve ölü hücreler hem yüzde olarak hem de hücre/ml olarak hesaplanmıştır. Oksidatif stresle oluşan ve reaktif oksijen metabolitlerinin verdiği zararı belirlemek amacıyla lipit peroksidasyonu, SOD aktivitesi, CAT aktivitesi, GPX aktivitesi ölçülmüştür. İnsan yağ doku kaynaklı mezenkimal kök hücrelerde Sirolimus IC50 dozu (48. saat) için 15,85 µM olarak belirlenmiştir. UDKA için ise çalışılan dozlarda sitotoksik etki gözlemlenmemiştir. Bu yüzden en yüksek sabit doz olan 100 µM ile çalışmaya devam edilmiştir. Muse® hücre cihazı ile yapılan ölçümler ve yapılan hesaplamalar doğrultusunda kontrol grubunda ölü hücre %1.03, canlı hücre %98.97 olarak hesaplanmıştır. UDKA grubunda ölü hücreler %2.59, canlı hücreler %97.41 olarak hesaplanmıştır. Sirolimus grubunda erken apoptoz %7.69, geç apoptoz %4.31, ölü hücre %8.10, canlı hücre %79.90 olarak hesaplanmıştır. Sirolimus + UDKA kombine grupta erken apoptoz oranı %3.90, geç apoptoz oranı %1.34, ölü hücre %7.81, canlı hücre %86.95 olarak ölçülmüştür. Hücre siklusu analizinde kontrol ve UDKA grubunda G2/ M fazlarının yüzdeleri sırasıyla % 19.3 ve 18.9' dur. Sirolimus uygulama grubunda G2/ M fazı yüzdesi 15.9 'a düşmüştür. Biyokimyasal bulgular ise MDA düzeylerinde UDKA-kombine grubu; GSH-Px düzeyleri açısından Kontrol- UDKA dışındaki tüm ikili gruplar; CAT düzeyleri açısından kontrol- UDKA; kontrol- kombine; UDKA- Sirolimus ve UDKA- kombine grupları; SOD düzeyleri açısından tüm gruplar arası ikili farkların tümü istatistiksel olarak anlamlı olarak saptanmıştır (p<0.001). Çalışmada, Sirolimusun mezenkimal kök hücrelerdeki apoptozu arttırması literatürle uyumlu bir sonuçtur. UDKA'nın hücre proliferasyonu düzenlediğini gösteren bulguların varlığı ve UDKA'nın antiapoptotik etkileri bu çalışmanın kombine grupta UDKA'nın sirolimus etkisini baskılamasıyla uyumlu olduğu görülmüştür. Organ ve doku nakilleri sonrası immunsupresif tedavi ve yağ doku kaynaklı mezenkimal kök hücre uygulamasında, UDKA kullanımı, mezenkimal kök hücrelerin üzerinde pozitif etkiler göstermiştir.
Hipoksik ortamda otolog serumla elde edilen insan adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerde kriyoprezervasyon etkisi, proliferatif ve kondrojenik farklanma kapasitesinin incelenmesi
İnsan kaynaklı adipoz (yağ) dokusundan elde edilen mezenkimal kök hücrelerin izolasyonu, ekspansiyonu, kriyoprezervasyonu ve izole edilen kök hücrelerin diferansiyasyon kapasiteleri araştırılmıştır. Bu konuda ülkemizde ve diğer ülkelerde yapılmış çalışmalarda farklı izolasyon, ekspansiyon, kriyoprezervasyon ve diferansiyasyon yöntemleri kullanılmış olmasına rağmen hayvan kaynaklı serum içermeyen otolog serum ve hipoksik kültür koşullarında yapılmış bir çalışma yoktur. Cerrahi koşullarda daha önce belirlenen protokoller çerçevesinde 10 adet 25-52 yaş arası kadından alınan abdominal yağ örneklerinden mezenkimal kök hücre eldesi sağlanmıştır. Aynı hastaya ait kök hücreler hipoksik ve normansi koşullarda kültüre edilmiş 1., 3., ve 5. pasajlarda hücre canlılığı, mezenkimal kök hücre karakterizasyonu, dondurup/çözme ve kıkırdak yönüne doğru farklanma bu çalışmada gözlemlenmiştir. Bu çalışmayla birlikte bugüne kadar hipoksik kültür ortamında yağ doku kaynaklı mezenkimal kök hücrelerle ilgili mevcut bilgilere otolog serum uygulaması eklenerek konuda genişleme, yenileme ve iyileştirme oluşturulacağı aynı zamanda standart bir protokol geliştirilip ileride in vivo çalışmalarla desteklenerek klinikte kullanıma ışık tutacağı düşünülmektedir. Bu kapsamda çalışmanın rejeneratif tıp uygulaması ve metodolojik açıdan oldukça önemlidir
AML kasumi-3 ve KG-1 hücre hatlarında hücre polaritesindeki değişiklikler ve in vitro hedef tedavisinin etkileri
Giriş: AML moleküler patogenezinin tanımı son yıllarda çarpıcı bir ilerleme kaydetmiştir. Lösemik transformasyon için hayati önem taşıyan iki ana genetik olay türü tanımlanmıştır: hematopoietik farklılaşmayı yöneten miyeloid transkripsiyon faktörlerinde değişiklikler ve sinyal transdüksiyon ara ürünlerinin aktive edici mutasyonları. Hematopoietik progenitör hücrelerdeki transkripsiyonel kontrolü değiştiren moleküler olaylar, büyüme faktörü reseptörleri için mevcut olan sinyal iletim moleküllerinin kompozisyonunu değiştirirken, sinyal transdüksiyon moleküllerindeki aktive edici mutasyonlar, çeşitli transkripsiyon faktörlerinin aktivitesinde ve ekspresyonunda değişikliğe neden olurlar. Bu süreçler birbirine oldukça bağımlıdırlar ve normal miyeloid farklılaşması için çok önemlidir. AML, olgunlaşmamış progenitör hücrelerin klonal büyümesi ile karakterizedir. Artan çoğalma ve apoptoz direnci ve aynı zamanda farklılaşma inhibisyonu bu patojenik olayın merkezinde ve büyüme faktörü reseptör sinyal yolaklarının yapıcı ve/veya anormal aktivasyonuna katkıda bulunması muhtemel görünmektedir. Sinyal transdüksiyon moleküllerinin anormal ve yapısal olarak aktivasyonu primer AML kemik iliği örneklerinin yaklaşık %50'sinde bulunmuştur. Bu aktive edici olayların en yaygın olanı RTK FLT3, N-Ras ve K-Ras, KIT'te ve diğer RTK'lerde gözlenmiştir. Bu mutasyonlardan bazıları için, miyeloid hücrelerdeki aktive etme ve dönüştürme yetenekleri in vitro veya fare kemik iliğinde gösterilmiştir. Bu patogenezde hücre sitosteleti ve polaritesinde olan değişikliklerle bağlı literatürde çok az veri bulunmaktadır. Amaç: Bu çalışmada, AML KG-1 ve Kasumi -3 hücrelerinde Planar Hücre Kutuplaşması yolağı proteinlerinin ekspresyonunun hastalığa bağlı olarak değişikliğini öğrenmek ve bu değişikliğe FLT3 inhibitörleri olan Quizartinib (Faz II), Midostaurin (Faz II) ve Lestaurtinib (klinik deneylerde) moleküllerinin ve Mezenkimal Kök Hücre co-kültürünün in vitro hedef tedavisine ektisini öğrenmek amaçlanmıştır. Gereç ve yöntem: KG-1, Kasumi-3, Kemik İliği Kök Hücreleri ve Mezenkimal Kök Hücre hatları hücre protokolünde de gösterildiği gibi 75 sm2'lik flasklara ekilir. Hücreler 37oC ve %5 CO2 ortamında 1 hafta inkübe edilir. Bu süre zarfında hücrelerin besiyeri değiştirilir, gerektiğinde pasaj yapılır. Gereken sayıya ulaştıktan sonra hücreler 6 kuyucuklu yeni flasklara ekilir. Her flaskta 3 kuyucuğa Mezenkimal Kök hücreler ekilir. Üç flaska Quizartinib, üç flaska Lestaurtinib ve son üç flaska Midostaurin eklendi. Çalışma 3 tekrar olarak yapıldı. 24 saat inkübasyon sonrası flasklardan hücreler alındı ve mRNA ekspresyonu yapıldı. Alınan RNA örneklerinden Taqman Reverse Transciptase Reagents ile cDNA elde edildi. Alınan cDNA materyali jel elektroforezinde kontrol edildikten sonra her gen için önceden ısmarlanmış Tagman hazır primerler ile elde olunan karışımlar Taqman 2x RT-PCR kullanılarak ABI7000 RT PCR cihazına yüklendi. Reaksiyon eş zamanlı olarak ABI7000 makinesinin bilgisayarından gözlemlenmiştir. Cihazdan alınan Ct değerlerinden Ct değeri hesaplandı ve katlama formülü ile Fold Change değerleri hesaplandı. Bulgular: Alınan değerlere göre Planar Hücre Kutuplaşması yolağı proteinlerini kodlayan genlerin ekspresyonunda değişim gözlemlendi. Hedef tedavisinde kullanılan moleküllerin etkisi ile malum genlerin ekspresyonlarında azalma görüldü. Mezenkimal kök hücre ko-kültürü ve FLT3 inhibitörleri kullanılan modellerde Fold Change değerleri ortalama 3 defa azalmıştır. Tartışma ve sonuç: Deney bulgularımıza göre sağlıklı kemik iliği hücrelerine kıyasla, lösemi hücre hatlarında hücre polarite genlerinin ekspresyonu artmıştır. Bunun da lösemi prognozunu negatif etkilediği bilinmektedir. Diğer yandan, Quizartinib, Lestaurtinib, Midostaurin ve mezenkimal kök hücre ko-kültürü kullanılan modellerde genlerin ekspresyonu, dolaysıyla lösemi prognozu pozitif etkilendiği sonucuna varılmıştır. Bu sonuçlar, kullanılan FLT3 inhibitörü moleküllerinden Quizartinib, Lestaurtinib, Midostaurin için yeni bir etki mekanizmasını ortaya koymaktadır.
Prostat kanser kök hücresinde senesens etkisinin incelenmesi
Prostat kanseri, erkeklerde en sık rastlanan kanserdir ve dünyada erkeklerde kansere bağlı ölümlerde ikinci sırada yer almaktadır. Günümüzde kanseri anlamak ve yeni tedavi stratejileri geliştirmek için birçok çalışma yapılmaktadır. Dünyada kanser üzerine yapılan tüm çalışmalara rağmen hala etkili bir tedavi yöntemi bulunamamıştır. Bunun nedenlerinden biri olarak da yakın zamanda kanser teorilerinden biri olarak kabul edilen ve tümör başlangıç hücreleri olarak da adlandırılan kanser kök hücreleridir. Kanser kök hücreleri; tümör başlangıcı, progresyon, konvansiyonel terapi direnci, nüks ve metastazdan sorumlu hücrelerdir. Bu bakımdan bu hücreleri anlamak etkili ve yeni tedavi statejilerini geliştirmek için oldukça önemlidir. Ölümsüz hücreler olarak adlandırılan kanser hücreleriyle mücadelede diğer önemli konulardan biri de hücresel senesenstir. Senesens (hücresel yaşlanma), hücre döngüsünün kararlı bir şekilde durması olayıdır ve tümörlerin anormal ortamında oluşan yaygın olan bir stres yanıtıdır. Bununla birlikte senesens kanser başlangıcını sınırlayan güçlü bir tümör baskılayıcı mekanizmadır. Bu nedenle senesensin kanserle olan ilişkisinin tüm yönleriyle aydınlatılması oldukça önemlidir. Ayrıca literatürde senesensin kanser kök hücreleri üzerine ilişkisini anlatan makale yok denecek kadar azdır. Bu alan bakımdan literatürde bir boşluk vardır ve bu çalışma ile birlikte literatüre önemli bir katkı sağlanacağı düşünülmektedir. Bu çalışma kapsamında terapi ile indüklenen senesensle i) başta prostat kanser kök hücrelerinde olmak üzere prostat epitel hücrelerinde, prostat kanser hücre hattında ve kök hücre özelliği bulunmayan prostat kanser hücrelerinde hücresel senesens indüksiyonu gerçekleştirmek, ii) senesensin prostat kanser kök hücrelerinde proliferasyon, hücre döngüsü ve apoptoz gibi davranışlar üzerindeki etkilerinin neler olduğunun ortaya çıkarılması amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda floresanla aktive hücre ayırma (FACS) metodu kullanılarak prostat kanser kök hücrelerinin izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Ardından kemoterapötik bir ajan olan Doksorubisinin farklı dozları kullanılarak terapi yoluyla senesens indüksiyon prensibi kullanılarak; hem kanser kök hücrelerinde hem de prostat epitel hücre ve prostat kanser hücrelerinde senesens tetiklenmiştir. İndüksiyonu teyit edebilmek için; senesens ilişikili β galaktosidaz boyama (SA-β gal) ve Ki-67 senesens belirteçleri kullanılmıştır. Senesensin hücre canlılığı, hücre döngüsü ve apoptotik etkileri ise Muse® Cell Analyzer cihazında analiz edilmitir. Bu analizlerin yanı sıra apoptozla ilişkili sinyal yolaklarındaki genler gerçek zamanlı PCR ile analiz edilmiştir. Bu çalışma ile birlikte; senesensin prostat kanser kök hücreleri üzerindeki proliferasyon, hücre döngüsü ve apoptoz etkileri ortaya konmuştur. Subtoksik bir dozda uygulan DOX (10nM, 25 n M ve 50nM ) ile hem kanser kök hücrelerinde hem de diğer hücre gruplarında senesens indüksiyonu sonrasında senesensli hücrelerde düşük Ki-67 seviyesi ve pH 6'da pozitif SA-β gal boyaması saptanmıştır. Bunların yanı sıra hücreler, senesens hücrelerine özgü olan morfolojik değişiklikler göstermişlerdir. DOX ile indüklenen senesens sonrasında hücrelerin G2/M hücre döngüsü kontrol noktasında durdukları saptanmıştır. Bu çalışma ile birlikte apoptoz ve senesens ile ilişkili birçok anlamlı gen saptanmıştır. Tüm bu veriler kanser kök hücrelerin indüksiyonunda terapötik bir ajanın kullanılabileceğini göstermiştir. Bunun yanı sıra proliferasyonu duran prostat kanser kök hücrelerinin hücre döngüsü, apoptotik davranışları ve çeşitli senesens davranışları aydınlatılmıştır.
miRNA kullanılarak NOTCH1 ınhibisyonu ile kanser kök hücre ve tümör mikroçevresinin hedeflenmesi
Pankreas kanseri, 6 ay ortalama hasta sağkalımı ile son derece zayıf sağkalım oranlarına sahip en agresif kanserlerden biridir ve karşılanamayan bir terapötik zorluğu temsil etmektedir. Pankreas kanseri ilerleyişini ve mekanizmaları hala tam olarak anlaşılamamıştır. Yalnızca tümör hücrelerini hedef alan stratejilerin pankreas kanseri hücrelerini ortadan kaldırmada başarısız olduğu ve metastazı, ilaca direnci ve hasta ölümlerini önlediği kanıtlanmıştır. Kanser kök hücreleri hücre göçü / istilası, ilaç direnci ve metastaz özellikleri sebebiyle önemli klinik etkilere sahiptir. NOTCH ve ilişkili sinyal yolaklarının kanser kök hücrelerinde yüksek/artmış aktivite gösterdikleri; bu hücrelerin sürdürülmesi ve sağkalımı için önemli olduğu bilinmektedir. NOTCH1'in pankreas kanseri kök hücrelerinin regülasyonundaki fonksiyonel rolü açıklığa kavuşmamıştır. Planlanan çalışmayla klinikte kullanılan toksik olmayan nanolipozom teknolojisi ile NOTCH1'i hedefleyen miRNA temelli tedavi modeli uygulanmıştır. NOTCH1 hedef alınarak kanser kök hücre özelliklerinin baskılandığı, tümör büyümesi ve yayılmasının durduğu görülmüştür. Tedavi yaklaşımı olarak etkin bir şekilde kullanılabileceği öngörülmektedir .
Ovaryum kanserinin oluşumu ve ilerleyişinde ovaryum kanseri kök hücrelerinden salınan eksozomal miRNA'ların rolü
Ovaryum kanseri jinekolojik kanserler arasında ölüme en çok neden olan genellikle asemptomatik bir kanser türüdür. Tümör kitlesindeki heterojen hücre popülasyonlarının çok küçük bir kısmını oluşturan Kanser Kök Hücreleri (CSC) ise malign progresyona sebep olan, tedaviye yanıtı değiştiren hücrelerdir. Hücresel sinyallemenin ana düzenleyicisi olarak, hem normal hem de kanser kök hücreleri, tümör mikro-ortamını, büyümesini, ilerlemesini ve varsayılan immünolojik fonksiyonu değiştiren çeşitli otokrin ve parakrin sinyalleri orkestra etmek için eksozomlar salgılarlar. Bu eksozom adı verilen endozomal yolak orijinli nano kesecikler (50-180nm) orijinlendiği hücrenin parmak izini taşıması yönü ile özellikle kanserin tanı ve tedavisinde potansiyel belirteçler olma özelliği taşır. Aynı zamanda eksozomlar mRNA ve mikroRNA(miRNA)'lar gibi taşıdıkları kargo içerikleri ile kanser ilerleyişine, immün sistemden ve apoptozisten kaçış, anjiyogenez, invazyon, metastaz gibi onkojenik hedefleri uyararak, antitümör immün yanıtı değiştirerek katkı sağlarlar. Hücreler arası iletişiminde eksozomların ve eksozomal miRNA'ların vasıtası ile bilgi aktarımı kanser gelişimindeki en önemli mekanizmalardan biridir. Ovaryum kanseri kök hücrelerinin (OCSC'ler) onkojenik fenotipi teşvik etmek için tümör mikro ortamları ile nasıl etkileşime girdiği konusunda literatür bilgileri hala eksiktir. Ovaryum kanserinin kompleks mekanizmalar içeren heterojen yapısı nedeniyle tek bir biyobelirteçle tüm alt tiplerinin ve evrelerinin yüksek hassasiyet ve özgünlükle tespit edilmesi mümkün değildir. Bu nedenle tanı ve tedavide tüm vücut sıvılarından elde edilebilen eksozomlar ve serum, plazma gibi vücut sıvılarında korunmuş halde bulunan hücre tipine göre spesifik olan ve kökenlendiği tümör ile ilgili biyobelirteçler içeren eksozomal miRNA'lar kullanılması çok daha büyük bir potansiyel taşımaktadır. Tüm bu bilgiler ışığında bu çalışmada OCSC'lerden türetilmiş eksozomal miRNA'ları ve bu miRNA'ların tümör mikroçevresinin regüle edip düzenleyebilme yeteneğini ortaya çıkarmayı ve böylece bu miRNA'ların ovaryum kanseri hastalarında tanısal olarak kullanılıp kullanılamayacağını araştırmayı hedefledik. Bu tez çalışmasında OCSC'lerden ve OCSC'lerden izole edilen eksozomlardan salınan miRNA'ların ifade düzeyine bakılmış, bu gruplar arasında yüksek oranda değişiklik gösteren miRNA'ların ovaryum kanserinin oluşumu, ilerleyişi, kanser kök hücrelerinin proliferasyonu, invazyonu, migrasyonu üzerindeki rolleri hem in vitro hem de nanolipozom teknolojisi ile primer tümör üzerinde in vivo olarak incelenmiştir. Buna ek olarak OCSC'ler ve eksozomlarında diferansiyel olarak eksprese edilmiş miRNA'ların tümör ile ilişkili makrofaj (TAM) microarray dataları ile de benzerlik gösterdiği, hem OCSC eksozomlarının hem de TAM'ların pek çok ortak miRNA'yı yukarı ve aşağı regüle ettiği gösterilmiştir. Bu microarray verilerinde en çok yukarı regüle olmuş miRNA'lardan biri olan miR-103a-3p'nin, OCSC eksozomlarından salınarak kanser proliferasyonunu, göçünü, istilasını ve anjiyogenezi arttırdığı ve M0 tipi makrofajların immünosupresif M2-tipi makrofajlara polarizasyounu indüklediği de çalışmamız ile ortaya çıkarılmıştır. Bu in vitro etkinin ovaryum kanseri ortotopik fare modelinde nanolipozomal-miR-103a-3p kullanılarak in vivo etkisi de OC hücreleri, CSC'leri ve TAM'lerın tümördeki infiltrasyonu üzerinde gösterilmiştir. Genel olarak çalışmamız, OCSC'lerinin ve OCSC'lerinden salgılanan eksozomların, özellikle onkojenik miR'leri transfer ederek, bunları tümör mikro-ortamı içinde bir ilerleme ve istila aracı olarak kullandığını ve tüm bunlara ek olarak OCSC'lerin bu miRNA'ları TAM'lerin polarizasyonu ve tümördeki infiltrasyonunu sağlamak adına yönlendirerek tümör mikro ortamını ve bu ortamdaki heterojeniteyi regüle ettiğini göstermiştir.
Prostat kanser kök hücrelerinde zoledronik asitin Rab23 GTPaz ve sonic- hedgehog yolak aktivasyonu üzerinde etkisi
Prostat kanseri erkelerde akciğer kanserinden sonra ölümlü ilişkili ikinci kanser tipidir. Kanser Kök Hücresi (KKH) tümör yapısı içinde çok az sayıda hücreden oluşan, kök hücre gibi sonsuz sayıda bölünebilen ve sessiz kalabilen hücre gurubudur. KKH'i tümörün çoğalmasından, geleneksel tedavilere dirençten, invazyondan ve hatta metastazdan sorumlu tutulmaktadırlar. KKH'de SHH, Wnt, Notch ve BMP yolakları gibi çok yönlü sinyal yolaklarının düzenlenmesindeki bozukluklar kanser oluşumu ve yayılması ile ilişkili bulunmaktadır. SHH sinyali bazal/kök hücrelerin KKH'e transformasyonunda yer almakta ve KKH devamlılığı, sağ kalımını düzenlemektedir. Sağlıklı dokularda Rab23 GTPaz, SuFu-bağımlı şekilde SHH yolak aktivasyonunu negative şekilde düzenler. Çalışmamızın amacı zoledronik asit uygulanan insan prostat KKH'de Rab GTPaz ve SHH yolak bileşenleri genlerinin ekspresyon seviyesini araştırmaktır. Insan prostat kanser hücreleri FACSAria flow sitometri kullanılarak sort edilmiş, prostat kanser kök hücreleri CD 133high/ CD44high olacak şekilde ayrıştırılmıştır. Zoledronik asit uygulanarak deney gruplarında IC50 değerleri bulunmuştur. Zoledronik asit uygulanan deney gruplarında Rab23 GTP' az ve SHH yolak bileşenlerinin ekspresyon profilinin incelenmesi için RNeasy Plus Mini Kit ( Qiagen) kullanılarak total mRNA izole edilmiş, cDNA sentezi gerçekleştirilmiştir. Rab GTP'azların ekspresyonu LightCycler® 480 real-time PCR kullanılarak analiz edilmiştir. Saptanan sonuçlar zoledronik uygulanan insan prostat KKH ve control grupları arasında karşılaştırılmalı şekilde incelenmiştir. Bu çalışma, Zoledronik asit etkisinin Rab23 GTPaz ve SHH yolak bileşenleri ve dolayısı ile de KKH özellikleri üzerinde etkisinin saptanması yönünde ilk olabilme özelliğine sahip çalışmadır.
İnsan diş pulpası kaynaklı mezenkimal kök hücreler (DPSCS) ile meme kanseri (MCF7) kök hücreleri kokültüründe kanibalizm ve dormansi ilişkisi incelenmesi
Kanser, insidansı her yıl giderek artan evrensel bir hastalıktır ve son yıllarda dünya kanser istatistiklerine göre ölüm nedenleri arasında ilk sırada yer almaktadır. Kadınlarda ise en sık görülen kanser tipi meme kanseridir ve kansere bağlı ölümlere bakıldığında akciğer kanserinin ardından ikinci sırada yer almaktadır. Bu tez çalışmasında kokültüre edilen mezenkimal kök hücreler ile meme kanseri kök hücrelerinde dormansi ve kanibalizm araştırılması hedeflenmektedir. Anormal fagositoz olarak da adlandırılan hücre kanibalizmi, bir hücrenin diğer bir hücreyi canlı olarak yemesidir. Dormansi ise hücrelerin özellikle kanser sürecinde sessiz kaldığı fakat varlığını kaybetmediği süreç olarak söylenebilir. Kanserli hücrenin mikroçevresi dormansi ile ilişkilidir, bu yüzden çevresinde bulunan hücreler ve sinyallerinin direkt etkili olduğu düşünülmektedir. Mezenkimal kök hücreler hem tümör progresyonunda hem de tümör süpresyonunda etkilidir. Bu yüzden mezenkimal kök hücrelerin modülasyonunun kanser hücrelerindeki davranışının tam olarak açıklanması; hem yeni tedavi yöntemleri geliştirilmesi için, hem de günümüzde mezenkimal kök hücrelerin kullanımında yaşanan klinik problemlerin çözülebilmesi için oldukça önemlidir. Bu çalışma ile meme kanseri kök hücrelerinin diş pulpası kaynaklı mezenkimal kök hücreler üzerindeki kanibalizm davranışının dormansi süreci üzerinde etkisi olup olmadığını göstermek hedeflenmektedir
Anti-inflamatuvar lipid medyatörler ve mezenkimal kök hücrelerin immünomodülatuvar etkileri arasındaki ilişkinin araştırılması
Mezenkimal kök hücreler (MKH) başlangıçta kemik iliğinden izole edilmiş ve takibinde yapılan çok sayıda araştırma ile yağ dokusu, diş dokuları, fetal dokular gibi değişik kaynaklardan izole edilen yetişkin kök hücreleridir. Bu hücreler kıkırdak, kemik ve yağ hücreleri gibi destek dokularına farklılaşabilmektedir. Ancak onların en önemli kullanım alanları eşsiz immünomodülasyon yeteneklerinden dolayı ölümcül akut graft versus host disease (GVHD) başta olmak üzere farklı otoimmün hastalıklardır. Bu çalışma ile anti-inflamatuvar lipid medyatörler olan Lipoksin A4 ve Resolvin D1 moleküllerinin MKH'lerin immünomodülasyon yeteneklerine olan etkilerini araştırmayı amaçladık. Bu amaçla yağ dokusu kökenli MKH'ler ile aktive edilmiş periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) farklı efektör:target oranlarında ko-kültür ettik. Lipoksin A4 ve Resolvin D1 etkinliğini daha iyi anlamak için MKH'lere 15-lipoksijenaz (15-LOX) genini kodlayan plazmit transfeksiyonu yapılarak aynı deneyleri tekrarladık. Etkinlikleri kıyaslamak için hücre kültürü süpernatantlarından Lipoksin A4, Resolvin D1, IFN-g, IL-4, IL-10 ve IL-17a düzeylerini ELISA yöntemi ile tespit ettik. Bulgularımıza göre Lipoksin A4'ün MKH'lerin immünomodülasyon yeteneklerini özellikle yüksek E:T oranlarında arttırabildiğini gözlemledik. 15-LOX trasnfeksiyonu yapılan hücrelerin immünmodülasyon etkilerinin naive MKH'lere göre anlamlı olarak daha yüksek olduğunu gözlemledik. Sonuç olarak, Lipoksin A4 ve Resolvin D1 moleküllerinin naive MKH'lerin immünomodülasyon yetenekleri üzerinde direk bir etki oluşturmayabileceğini, ancak bu moleküllerin sentezlerinde direk rol alan 15-LOX enzimini eksprese eden MKH'lerin normal hücrelerden daha üstün bir etkiye sahip olduklarını bulduk. Daha kesin sonuçlara ulaşmak için in-vitro deneyler ile bulduğumuz bu verilerin in-vivo modeller ile desteklenmesine gereksinim bulunmaktadır.
Oksitosinin takrolimusa maruz kalmış adipoz doku kaynaklı mezenkimal kök hücre hattı üzerine etkilerinin incelenmesi
Takrolimus (FK 506) organ nakillerinde alıcı bireyde immün cevabın oluşmasını engellemek için kullanılan ve bu etkiyi kalsinörin sinyal yolağı üzerinden T hücrelerinin uyarılmasını engelleyerek yapan kemoterapotik bir kimyasaldır. Metabolik olarak incelendiğinde vücutta temel olarak karaciğerde sitokrom P450 enzim sistemi tarafından metabolize edilen takrolimusun farklı hücreler üzerinde yüksek toksik etkilerinin olduğu bilinmektedir. Mezenkimal kök hücreler doku yenilenmesi ve hücresel tedavide kullanılabilmeleri sebebiyle son zamanlarda oldukça önem kazanmışlardır. Bazı klinik vakalarda organ nakli sonrasında hastaya destekleyici amaçla mezenkimal kök hücreler nakledilmektedir. Mezenkimal kök hücreler immünomodülatör etkileri ve rejenerasyona yardımcı olmaları sebebiyle günümüzde gittikçe yaygınlaşan bir kullanıma sahiptir. Oksitosin, primer olarak insanda nöromodülatör olarak işlev gören ve hipofizin nörohipofiz kısmından salgılanan peptit bir hormondur. Oksitosinin hücreler üzerinde oksidatif strese karşı direnç kazandırmak, proliferasyonu arttırmak ve rejenerasyona yardımcı olmak gibi etkileri vardır. Yapılan çalışmada takrolimus adlı etken maddenin, insan adipoz doku kaynaklı mezenkimal kök hücreler üzerindeki sitotoksik etkilerinin araştırılması hedeflenmiştir. Bunun yanında yine aynı şekilde nöral bir peptit hormon olan oksitosinin, adipoz doku kaynaklı mezenkimal hücreler üzerinde takrolimus kaynaklı oluşan toksisiteyi inhibe edip etmediği araştırılmıştır. İnsan adipoz doku kaynaklı mezenkimal kök hücre hattı üzerinde takrolimusun sitotoksik etkisi WST-1 analizi kullanılarak zaman ve doza bağımlı olarak değerlendirilmiştir. Belirlenen zaman ve doz ile yapılan izobologram analizleri sonucunda madde kombinasyonlarının endeks değerleri belirlenmiştir. Takrolimus ve oksitosinin IC50 dozu (72. saat) insan adipoz doku kaynaklı mezenkimal kök hücreler için sırasıyla 17.44 µM ve 13.43 µM olarak belirlenmiştir. İzobologram analizleri sonucu antagonistik olarak belirlenen iki etken maddenin kombinasyonlarının endeks değerleri ED50: 1.418, ED75: 1.25719, ED90: 1.23533 olarak kaydedilmiştir. Apoptotik ve nekrotik ölüm oranlarını belirlemek amacıyla anneksin V yöntemi uygulanmıştır. Analiz sonucunda apoptotik olmayan, erken apoptotik, geç apoptotik, toplam apoptotik ve ölü hücreler hem yüzde olarak hem de hücre/ml olarak hesaplanmıştır. Oksidatif stres ile birlikte oluşan ve reaktif oksijen metabolitlerinin verdiği zararı belirlemek amacıyla lipit peroksidasyonu, süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesi, katalaz (CAT) aktivitesi, glutatyon peroksidaz (GPX) aktivitesi ölçülmüştür. Ayrıca antijen-antikor bağlanma prensibine göre çalışan immünofloresan boyama yöntemi ile hücrelerin içerisinde bulunan yapıtaşları ve meydana gelen kimyasal reaksiyonlar gösterilmiştir. Yapılan çalışmada elde edilen veriler doğrultusunda takrolimusun adipoz doku kaynaklı mezenkimal kök hücreler üzerinde oksidatif stres yaratarak hücrelerin erken apoptoza gitmelerine neden olduğu görülmüştür. Oksitosine maruz bırakılan hücrelerde proliferasyonun arttığı gözlemlenirken takrolimus ve oksitosin kombinasyonlarında takrolimusun hücreler üzerindeki sitotoksik etkisinin azaldığı belirlenmiştir. Çalışma sonunda belirlenen dozun alıcıya modifiye edilmesiyle, hem immünosupresif ilacın hem de mezenkimal kök hücrelerin birbirlerinden negatif yönde etkilenmeden immün sistem üzerinde gerekli baskıyı oluşturacakları düşünülmektedir. Bu duruma bağlı olarak organ nakilleri sonrasında uygulanan tedavi protokollerinde destekleyici olarak oksitosinin kullanımına ışık tutacağı da öngörülen sonuçlar içerisindedir.
Glioblastom kök hücrelerini görüntüleme amaçlı gepı temelli hetero-fonksiyonel peptidler
Altın nanopartiküllerin (ANP) nano-tıp alanında yüksek bir potansiyele sahip olduğu gösterilmektedir. Yüksek elektron yoğunluğu ve benzersiz optik özellikleri nedeniyle, ANP'ler biyo-görüntülemede kontrast maddesi, tanı probları ve hedefleyici sistemler olarak verimli bir biçimde kullanılabilmektedir. ANP'ler ayrıca hipertermi tedavisinde termal enerji taşıyıcısı olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, biyolojik sistemlerde taşınmaları için stabil ve sağlam yapıda olmaları ANP'lerin biyolojik işlevini kritik bir hale getirmektedir. Biyolojik işlev, nispeten sert koşullar ve kuvvetli indirgeyici ajanları içeren fiziksel veya çok basamaklı kimyasal yöntemlerle biyolojik bir yapının ANP'lerle birleştirilmesiyle kazandırılır. Bu çalışmada, tasarlanmış peptid temelli kendiliğinden birliktelik fonksiyonilizasyon metodu glioblastom (GBM) kanser kök hücreleri (KKH'leri) ni özgün hedefleyen fonksiyonilize ANP'lerin oluşturulması için kullanıldı. Tasarlanan peptid dizileri hem gliom hücresine bağlanan peptid hem de ANP yüzeyi ile kendiliğinden bir araya gelen altın bağlanma dizisini içermektedir. Altına bağlanan peptid dizisi, daha önce kombinatoryal FliTrx peptid kütüphane tekniği kullanılarak seçildi. Peptidlerin, 15nm çapında ANP'lerle bağlanma etkinliği lokalize yüzey plazmon rezonans spektroskopisi (LSPR) ile test edildi. Spektral tarama verisi GraphPad Prism 6.0 yazılımıyla değerlendirildi. AlamarBlue testi, fonksiyonel ANP'lerin NIH/3T3, U-87 MG ve GBM KKH hatları üzerindeki olası sitotoksik etkisinin tanımlanmasında kullanıldı. Hücre hatlarına göre, hetero-fonksiyonel peptidlerin bağlanma karakterini test etmek için hücre yayılım testi kullanıldı. Sonuçlar, kimerik peptid ile fonksiyonilize edilmiş ANP'lerin hücreye özgün hedefleme için geliştirildiğini gösterdi. Hetero-fonksiyonel peptidlerin bağlanma için hücre seçiciliğine sahip olduğu bulundu. Geliştirdiğimiz hetero-fonksiyonel peptid stratejisi yalnızca hücre görüntüleme için değil ayrıca potansiyel olarak kemoterapi ajanlarının yan etkisini düşürebilen tümör bölgesine özgün ilaç taşınımı ve nanopartikül ilişkili hipertermi tedavisinin geliştirilmesinde GBM hastaları için umut verici bir yaklaşım olarak kullanılabilir.
Kordon kanı kökenli mezankimal kök hücrelerin kahverengi adipositlere farklılaştırılması
Mitokondriden zengin olan kahverengi yağ hücreleri "depolanmış trigliseritleri" yakarak onların içindeki enerjiyi ısıya dönüştürerek enerji tüketimini sağlayan ve bu özellikleri nedeniyle de diyabet, obezite, ve obeziteyle ilişkili çeşitli metabolik hastalıkların tedavisinde yararlı olma potansiyali olan hücrelerdir. Kordon kanı Mezenkimal Kök Hücre (KK-MKH)'leri Kemik İliği kökenli mezenkimal Kök Hücre (Kİ-MKH)'leri gibi diğer KH kaynaklarından daha az immünojenik olup allojenik ve otolog transplantasyonlarda kullanılabilirler. Şu ana kadar literatürde kordon kanından elde edilen mezankimal kök hücrelerin kahverengi adipositlere farklılaştırılmasını gösteren bir çalışma mevcut değildir. Bu projede kordon kanından elde edilen mezankimal kök hücrelerin in vitro koşullarda kahverengi adipositlere farklılaştırılması ve onların farklılaşma kapasitesi ve etkinliğinin adipoz doku kökenli MKH (AD-MKH)'ler ile kıyaslanması amaçlanmıştır. Çalışmamızda KK-MKH'leri Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Ana Bilim Dalında normal doğum sonrası rutinde atılan 10 adet plasenta ve kordon kanından toplanmıştır. AD-MKH'leri ise Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi Kliniğinde liposakşın/lipektomi ameliyatı olan 6 adet gönüllü hastadan izole edilmiştir. KK-MKH'lerinin beyaz ve kahverengi adipositlere farklılaşma yeteneği AD-MKH'leri ile kıyaslanmıştır. İzole edilmiş MKH'ler akış sitometri analizi ile karakterize edilmiştir. Akış sitometri sonuçlarına göre hem KK-MKH'leri hem de AD-MKH'leri CD34 ve CD45 yüzey markerleri için negatif iken, CD90 ve CD105 yüzey markerleri için yüksek oranda pozitiflik gösterdiler. 3. pasaj MKH'ler, beyaz ve kahverengi olmak üzere iki farklı farklılaşma besi ortamında kültüre edilerek beyaz ve kahverengi adipositlere farklılaştırılmıştır. Kahverengi adipositleri elde etmek için MKH'ler rekombinant bone morphogenic protein 7 (BMP7) içeren farklılaşma medyumu içinde kültüre edilmiştir. Elde edilen beyaz ve kahverengi yağ hücrelerinin karakterize edilebilmesi için yapılan Oil Red O boyaması sonuçlarına göre, AD-MKH'lerden elde edilen beyaz ve kahverengi adipositler sırasıyla %85 ve %61 kırmızı pikseli gösterirken, KK-MKH'lerden elde edilen beyaz ve kahverengi adipositler ise sadece %3 ve %1,9 oranında kırmızı pikseli göstermiştir. Kahverengi adipositlere özgü UCP1 protein miktarı, Western blot ve floresan mikroskop analizleri ile incelenmiştir. Floresan analiz sonuçlarına göre, hem KK-MKH'lerden hem de AD-MKH'lerden elde edilen kahverengi adipositler farklılaştırılmamış kontrol hücrelerine göre daha fazla UCP1 proteini içermektedirler ancak sadece AD-MKH'lerden elde edilen kahverengi adipositlerin sitoplazmalarında yuvarlak parlayan cisimcikler görülmüştür. Bu cisimcikler literatüre göre bir araya gelen çok fazla sayıda kümeleşmiş mitokondriler olabilir. Western blot sonuçlarına göre KK-MKH ve AD-MKH'lerden elde edilen kahverengi adipositler farklılaştırılmamış MKH'lere göre sırasıyla 4 ve 10.64 kat daha fazla UCP1 proteini eksprese etmektedir (P<0.004). Sonuç olarak, AD-MKH'ler hem beyaz hem kahverengi adipositlere yüksek bir verimlilik ile farklılaşırken, KK-MKH'leri adipositlere çok az bir farklılaşma eğilimi göstermiştir. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlara göre, KK-MKH'leri hem beyaz hem de kahverengi adipositlere farklılaştırılmak için uygun KH tipleri değidir. Böylece adiposit hücrelerin transplantasyonu ile yapılan tedavilerde yada rekonstrüktif cerrahilerde kullanımı AD-MKH'ler gibi olumlu sonuç vermeyebilir. Bunun aksine AD-MKH'ler yüksek bir verimlilik ile kahverengi adipositlere farklılaştırılabildiği için diyabet, obezite ve obeziteyle ilişkili metabolik hastalıkların tedavisinde de yeni umut vaat edici bir tedavi yaklaşımı olabilirler. Bu konuda ileri in vivo ve ardından klinik çalışmalara gereksinim vardır.
Hepatoselüler karsinoma hücre hatlarının fenotipik farklılaşmasında hücre içi kalsiyumun işlevi
Hücre içi Ca+2 sinyal iletiminin yer ve zamana bağlı değişimleri vücutta fizyolojik işlevlerin yanı sıra karserleşme sürecinde de önemli işlev gördüğü bilinmektedir. SOCE (Depo kontrollü Ca+2 girişi) uyarılamayan hücrelerde HCC'yi (hepatocellular carcinoma) de kapsayan önemli Ca+2 giriş yolağı olup hücre içi Ca+2 homeostazını da düzenler. Günümüzde, yapılan çalışmalarda tedavi sonrası kanserin nüks etmesinin ana nedeninin heterojen tümör popülasyonunda bulunan tümör başlatıcı hücrelerin (Tumor-initiating cells, TIC) olduğunu gösterilmiştir. Bu nedenle, çalışmamızda, , EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule) ve CD133 yüzey antijeni ifade eden Huh7 HCC hücre hattının alt popülasyonu olan TIC'lerin (EpCAM+CD133+) fenotipik farklılaşmasında SOCE işlevinin aydınlatılması hedeflenmiştir. Bu amaçla, EpCAM+CD133+ popülasyonunda SOCE ilişkili Ca+2 homeostazı araştırılmış ve hedef validasyonu yapılmıştır. Bu amaçla, parental Huh7 hücrelerinden hücre yüzey antijeniyle etkileşen floresan özellikli spesifik antikorlar ile akış sitometrisinde TIC'ler ayrıştırılmıştır. Daha sonra, SOCE'nin iki önemli bileşeni, intraluminal Ca+2 içeriğinin algılanmasından sorumlu olan integral membran proteini STIM1 (stromal interaction molecule) ve hücre membranda bulunan bir Ca+2 geçiş proteini olan Orai1'i, bu hücrelerde aşırı düzeyde ifade edilmesi sağlanmıştır. Daha sonra, hücre içi Ca+2 dinamiklerindeki değişim, hücre proliferasyonu, ilaç direnci (MDR1 gen ifadesi, P-glikoprotein), EMT (epitelden mezenkimale geçiş) belirteçlerinin ifadesini ve karsinogenezdeki migrasyon-invazyon özelliklerini incelenmiştir. Bulgular, ER Ca+2 salıverilişi ve SOCE'nin TIC'lerde EpCAM-CD133- hücrelere göre daha yüksek olduğunu göstermiştir. Bu gözlem, TIC'lerin fazla Ca+2'yi ER'de tamponlayarak ve mitokondriyal Ca+2 alımını önleyerek apoptozdan kaçabileceklerini düşündürmüştür. TIC'lerin EpCAM-/CD133- hücrelere göre daha yavaş prolifere olmaları Ca+2 tamponlayıcı mekanizmaların bu hücreleri farklılaşmamış halde tutmasından kaynaklanabilir. SOCE bileşenleri STIM1 ve Orai1'in aşırı düzeyde ifade edilmesi (STIM1+Orai1 OE) TIC'lerde SOCE yanıtını artırmıştır. Bu durum, başka araştırmacılar tarafından da tanımlanan, STIM1 ve Orai1 arasında sitokiyometrik bir ilişkinin olduğunu düşündürmektedir. Çoklu ilaç direnci (MDR) çalışmalarında STIM1 OE, Orai1 OE ve STIM1+Orai1 OE grupları arasında en fazla MDR1 gen ekspresyonu STIM1+Orai1 OE'nin göstermesi TIC'lerdeki MDR gelişimi ve SOCE arasında etkileşim olabileceğini göstermektedir. Epitelden mezenkimale geçiş deneylerinde, EMT belirteçlerinin (epitelyal E-cadherin; mezenkimal: N-cadherin ve Vimentin) mRNA düzeyleri STIM1 OE ve STIM1+Orai1 OE TIC'lerde test edildi. Her iki epitelyal ve mezenkimal belirteçlerin ifadelerinin fazla olması bir ara faz olan kısmi (parsiyel) EMT olabileceğini göstermiştir. İşlevsel ve genomik analizlerimize dayanarak STIM1 ve Orai1'in ER'de Ca+2 tamponlama kapasitesi, SOCE giriş mekanizması ve hücresel sağkalım üst sinyalizasyon yolaklarında önemli olduğunu göstermektedir. TIC'lerde SOCE bileşenleri ile ilgili sinyal yolaklarının ve ilişkili miRNA'ların hedeflenmesi özgül antikanser tedavi stratejilerinin geliştirilmesinde yardımcı olacaktır.
Sinoviyal kökenli mezenkimal kök hücrelerin polarizasyonunda yer alan gen-protein expresyonu ve farmakolojik modülasyonu
Amaç: Juvenil İdiopatik Artrit(JIA) patogenez basamakları iyi anlaşılamamış kronik, inflamasyon sebebiyle dokusal erozyonun sonucunda oluşan bir hastalıktır. Hastalık tanısı konulmasında birçok klinik ve laboratuvar kriteri söz konusudur. JIA patogenezinde meydana gelen değişimler arasında immün hücrelerin gruplar halinde Sinoviyal sıvıya migrasyonu da vardır. Bu migrasyon dokunun kendini rejenere etme kabiliyetinde görev alan mekanizmalarda aksamalara yol açmaktadır. Hem sinoviyal hem de sinoviyal sıvıya göç eden immün hücrelerin polaritesindeki moleküler değişimler bu tip immün hasarlanmada önemli olduğu tartışılmaktadır. Hücre içi polarite WNT sinyal yolakları tarafından kontrol edilir. Non kanonik sinyal yolağında görev alan proteinler PARD3, DVL1, SCRIB ve Ca+2 yolağında rol alan DMP1 proteinleri hücrelerin şekillerini, birbirleriyle olan bağlantılarını, stabil durumda formasyonlarını ve ekstrasellüler alandan gelen sinyale bağlı olarak göç etme mekanizmasını kontrol ederler. Bu çalışmada, sinoviyal kök hücre hasar taklit modelinde hücre polaritesinde yer alan proteinlerin fonksiyonel değişimini değerlendirmek için gen ekspresyon düzeylerini saptayarak, JIA patogenezinde hücre polaritesinde yerini ve bu değişimin farmakolojik modülasyonunu araştırmak amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Bu amaçla JIA hasar taklidi Sinoviyal kökenli kök hücreleri kültür modelinde immün uyarılar ile polarite değişimi ve farmakolojik modülasyonunu ortaya koymak için bahsi geçen WNT yolağının önemli proteinlerinin ekspresyon seviyeleri ve invitro ilaç etkileri değerlendirilmiştir. Deneyde 6 kuyucuklu 3 plate'de Sinoviyal kökenli kök hücreler kültürlendi. Toplam 18 kuyucuğun 3 kuyusu normal kültür, sırasıyla 3'er kuyusu IL-1, TNF-a, IL-1+TNF-a, IL-1+Canakinumab, TNFa+Adalimumab olacak şekilde 48 saatte bir pasajlanarak 2 pasaj şeklinde manipüle edildi. Ardından kültür ortamından alınan örneklerden mRNA izolasyonu yapıldı ve izole mRNA'lardan Reverse-Transkriptaz PCR ile cDNA elde edildikten sonra cDNAların RealTime PCR ile daha önce sipariş verilen PARD3, DVL1, SCRIB, III DMP1 Taqman hazır probları kullanılarak ekspresyon seviyeleri Ct değeri olarak ABI7000 RT-PCR cihazında ölçüldü. Çıkan sonuçlar Ct hesabı ile değerlendirildi. Bulgular: Değerlendirmelere göre JIA hasar taklitleri ve farmakolojik modülasyonlarda hücre içi polarite yolaklarının değişime uğradığı gözlemlendi. IL-1 ve TNF-a hasar taklitlerinde polarite proteinlerinin ortamda azalmasına sebep olacak bir gen ekspresyonu azalması gözlemlendi. Bunun yanında stabil halde formasyonu koruyan hasar anında mineralizasyon başlangıcı olan DMP1 proteini hasar taklidi ile ekspresyon seviyesini artırmıştır. Farmakolojik modülasyonlarda elde edilen bulgularda ekspresyon seviyelerindeki değişimler daraltılmıştır ancak tamamen durdurulduğu sadece hücre içinde diğer yaşamsal yolaklara da yardım eden DVL1 proteini kodlayan Dvl1 geninde gözlemlenmiştir. Tartışma ve Yöntem: Bulgularımızda elde edilen verilere göre JIA çerçevesinde gerçekleşen hasarın hücre içi polariteye ve dolaylı olarak hücre-hücre bağlantılarına verdiği internal zarardan dolayı kök hücrelerinde dokularda tutunma yetisini kaybettiği ve bunun sonucunda erozyona maruz kaldığı, kök hücrelerin rejenerasyon yetilerinin bağlanma/polarite kaybı sonucunda azaldığı ancak mineralizasyon gibi acil önlemlerin daha iyi çalıştığı kanaatine varıldı.
Hepatoselüler karsinoma ve nöroblastoma hücre hatlarında insan telomerazı htert alt birimi olası glikozilasyon profilinin biyoinformatik ve deneysel yöntemlerle belirlenmesi
Ökaryotik bir ribonükleoprotein olan telomeraz, "hTERT" katalitik alt birimi, "hTR" kalıp RNA'sı ve "p23/hsp90", "SnoRNA", "TEP1", "hnRNAPS C1/2", "La", "L22" ve "hStau" şeklinde bağlı proteinlerden oluşan bir holoenzim komplekstir. Her hücre bölünmesinde, kromozomların uçları (telomerler) kısalmaktadır. Bu kısalma ile birlikte hücresel senesens ve hücre bölünmesinin durdurulması tetiklemektedir. Telomeraz, telomerlere yeni nükleotidlerin eklenmesini katalizleyen (insanda: TTAGGG) bir ters transkriptazdır ve tüm malignant tümörlerin yaklaşık %90'ında belirlenmiştir. İnsan tümör hücrelerinin, evrensel olarak hücresel senesens ve DNA hasar-sinyal yol izlerini baypas ettiği düşünüldüğünde; telomeraz, ilgili moleküler mekanizmalar açısından son derece kritik bir noktada durmaktadır. Bir post-translasyonel modifikasyon olan protein glikozilasyonu, hücre içi ve hücreler arası tanıma, tutunma, sinyal iletimi ve farklılaşma gibi bir çok moleküler ilişkide önemli rollere sahiptir. Özellikle biyolojik tanıma olaylarının büyük bir kısmında bağlanmanın kalite kontrolü ve protein katlanmasında son derece önemlidir. Glikobiyolojinin perspektifinden baktığımızda, çok alt birimli bir ribonükleoprotein olan telomerazın; alt birimlerinin telomeraz kompleksini oluşturmasına ve enzimin katalitik işlevine dair ilgili moleküler mekanizmaların gerekli tanıma ve tutunma reaksiyonlarında glikanların rol oynaması olası görülmektedir. Bu tez çalışmasında, öncelikle hTERT ve farklı türlere ait telomeraz katalitik alt birimi (TERT) amino asit dizilerinde olası glikozilasyon pozisyonlarının biyoinformatik yöntemlerle belirlenmesi; nöroblastoma (SH- SY5Y) ve hepatoselüler karsinoma (Hep G2) hücre hattı örneklerinde, western ve lektin blotlama yöntemleriyle, olası glikanların deneysel olarak incelenmesi ve karşılaştırılması amaçlanmıştır. Yapılan biyoinformatik çalışma sonucunda: TERT proteini amino asit dizisi bakımından farklı türlerde karşılaştırıldığında, bu dizilerin türler arasında yüksek oranda korunduğu ve protein sekonder modellerinde katlanma motifleri açısından farklılıklar olduğu görülmüştür. Homo sapiens hTERT amino asit dizisinde olasılıkla bir N-bağlı ve birden çok O-bağlı glikozilasyon pozisyonu tespit edilmiştir. Ek olarak, Canis familiaris, Bos taurus, Rattus norvegicus ve Mus musculus TERT amino asit dizilerinde de olası O-bağlı glikozilasyon pozisyonları tespit edilmiş olup Rattus norvegicus ve Mus musculus TERT aminoasit dizilerinde olası iki N-bağlı glikozilasyon pozisyonu olduğu görülmüştür. Biyoinformatik verileri destekler şekilde, SH-SY5Y ve Hep G2 hücreleri nukleus lokalizasyonunda, hTERT'e bağlı N-asetilglukozamin (GlcNAc) ve sialik asit (Sia) belirlenmiştir. Her iki hücre hattında da en yoğun şekilde hTERT'e bağlı GlcNAc bulunmuştur. Hep G2 hücrelerinde ek olarak hTERT'e bağlı mannoz tespit edilmiştir. Her iki hücre tipine ait hTERT'de uç şeker olarak belirlenmiş olan α2,6 bağlı Sia'ların, O- ve/veya N-bağlı glikozilasyonla ilişkili olabileceği; hTERT ve etkileştiği bir protein olan TEP-1'in bağlanmasıyla ilgili moleküler reaksiyonlarda, tanıma ve tutunmada rollerinin olabileceği tartışılmıştır. Anahtar kelimeler: Telomeraz; hTERT; Glikozilasyon; Nöroblastoma; Hepatoselüler karsinoma, Sialik asit, GlcNAc, Mannoz, Western/Lektin blotlama
Glioblastoma multiforme (gbm) hücre hattına glikojen sentaz kinaz 3 inhibisyonunun, apoptoz ve hücre sinyal yolakları özelinde etkisinin araştırılması
Giriş: Malign gliomaların grade IV/V olan tipleri glioblastoma multiformedir (GBM). GBM vakaları için geniş cerrahi rezeksiyon sonrası radyoterapi ve kemoterapi tedavi protokolünü oluşturan standart tedaviye rağmen tümörün nüks etmesi neredeyse bir kuraldır. Tedavideki bu başarısızlıklar doğrultusunda; GBM hücre hatlarında GSK3 inhibisyonu planlanmış ve bu inhibisyonun Epidermal Growth Faktör Reseptör (EGFR) ve Nükleer faktör Kappa Beta (NF-κB) yolakları ile apoptozis sürecine ne tür etki göstereceğinin araştırılması planlanmıştır. Materyal ve method: Çalışmamızda karşılaştırma amaçlı, Glioblastoma (U-87MG) ve normal beyin (SVGp12) hücre hatları kullanılmış ve adı geçen yolaklar immunfloresan analize ve hücre canlılığı testlerine tabi tutulmuştur. Sonuçlar: GBM hattında ilaç uygulanımı sonucunda NF-κB ifadesinin azaldığı görülmüştür. U-87MG SVGp12 hücre hattı ile kıyaslandığında EGF ekspresyonunun fazla olduğu görülmüştür. GSK-3 IX inhibitörü eklenmeyen kontrol grubu ile kıyaslandığında, GBM'de ilaç uygulanımının EGF ekspresyonunu azalttığı görülmüştür. GSK3 inhibitorü uygulanımı sonucunda hem normal beyin hücrelerinde hem de GBM hücre hattında apoptozun arttığı görülmüştür. Bu çalışma ile günümüzde sık görülen ve tedavi konusunda çok fazla yol alınamamış olan bir malign beyin tümörü cinsini, hücresel sinyal yolakları düzeyinde inaktive edebilecek olası terapötik modelin araştırılması için literatüre ışık tutacaktır.