Theses supervised by Doç. Dr. İrfan Turhan
11 theses · Akdeniz University
Mannanaz üretimi ve saflaştırılmasında yeni teknik ve stratejilerin denenmesi üzerine bir araştırma
Galaktomannanlardaki β-1,4 mannoz bağlarını parçalayan β-mannanaz enziminin ana üreticisi farklı Aspergillus türlerinden oluşan filamentli fungus grubunun üyeleridir. Enzim rahatlıkla katı kültür besiyerinde veya erlenmayerlerde üretilebilmektedir. Ancak bu tekniklerle üretim sınırlı kalmaktadır. Üstelik mikroorganizma katma değeri yüksek bu ürünleri üretirken havalandırmaya da ihtiyaç duymaktadır. Bu nedenle de biyoreaktörlerin Aspergillus fermentasyonlarında kullanılması gerekmektedir. Ancak küflerin aşırı hif gelişimine bağlı olarak biyoreaktörlerde kontrolü oldukça zordur. Bu çalışmada, magnezyum silikat ve alüminyum oksit mikropartikülleri kullanılarak rekombinant Aspergillus sojae'nin hücre gelişiminin keçiboynuzu ekstraktı besiyerinde kontrolünün sağlanması ve β-mannanaz enzimi üretiminin arttırılması amaçlanmıştır. Her iki mikropartikül de erlenmayer ve biyoreaktör fermentasyonlarında hücre gelişimini arttırmış ve kontrolünü sağlamıştır. Ayrıca β-mannanaz enziminin fermentasyon sıvısından kısmi saflaştırılması, liyofilizasyonu ve enzim karakterizasyonu (enzimin çalışma şartları, farklı substratlar varlığında Km ve Vmax değerleri, iyon inhibisyonu vs) da gerçekleştirilmiştir. Öncelikle farklı oranlarda alüminyum oksit ve magnezyum silikat içeren besiyerleri ile çalkalamalı inkübatör denemeleri gerçekleştirilmiştir. En yüksek β-mannanaz aktivitesi değeri 568,72 U/ml olarak 5 g/L magnezyum silikat ilave edilen erlenmayer denemesinde elde edilmiştir. Besiyerine ilave edilen mikropartikül konsantrasyonu arttıkça hücre pellet çapı değerleri düşmüştür. Ayrıca 10 g/L'den daha fazla magnezyum silikat ilavesi durumunda hücre gelişimi pellet yapı yerine pellet/miselyum karışık tipte gerçekleşmiştir. Biyoreaktör denemelerinde ise en yüksek β-mannanaz aktivitesi değeri 643,16 U/ml olarak 3 g/L magnezyum silikat ilave edilen besiyerinde hesaplanmıştır. Mikropartikülle gerçekleştirilen tüm biyoreaktör denemeleri ise kontrol fermentasyonundan daha yüksek sonuçlar vermiştir. Ayrıca kontrol fermentasyonu hariç tüm mikropartiküllü biyoreaktör denemelerinde fermentasyon sonlandırılıncaya kadar hif gelişimi kolaylıkla kontrol edilmiştir. Biyoreaktörde gerçekleştirilen denemelerde hiçbir mikropartikül konsantrasyonunda hücre gelişim tipi pellet yapıdan pellet/miselyum karışık tipine dönüşmemiştir. Kısmi saflaştırma işlemi ise ultrafiltrasyon ile gerçekleştirilmiş ve enzim solüsyonu başarıyla liyofilize edilmiştir. Enzim karakterizasyonu da başarıyla gerçekleştirilmiş ve optimum çalışma pH ve sıcaklık aralığı sırasıyla pH 5-6 ve 50-60°C olarak belirlenmiştir. Keçiboynuzu gamı da β-mannanaz enzimi için en iyi substrat olarak belirlenmiştir. Keçiboynuzu gamının substrat olarak kullanıldığı denemede Vmax ve Km değerleri sırasıyla 2719 U/mg ve 2,26 µmol/ml olarak hesaplanmıştır. Son olarak farklı reaktiflerin enzim çalışmasına etkisi belirlenmiştir. Bu çalışma sonucunda β-mannanaz enzimi üretiminde karıştırmalı tip tank biyoreaktör, kısmi saflaştırma işlemlerinde ise ultrafiltrasyon sisteminin kullanılabileceği açıkça gösterilmiştir. Dolayısıyla sonuçlar rekombinant Aspergillus sojae ile biyoreaktörde β-mannanaz enziminin üretiminde farklı mikropartikül ajanlarını içeren keçiboynuzu ekstraktının substrat olarak kullanılabileceğini göstermiştir. Bu tekniğin diğer filamentli küflerin büyük ölçekli biyoreaktör sistemlerinde gerçekleştirilecek fermentasyonlarda da kullanılabileceği ve katma değeri yüksek enzimlerin üretilebileceği düşünülmektedir.
Endüstriyel atıkların azot kaynağı olarak mannanaz üretiminde kullanımının araştırılması
Mikrobiyal mannanazlar bitki dokularındaki karmaşık polisakkaritlerin mannooligosakkaritler ve mannozlar gibi basit moleküllere hidrolizini sağladığından dolayı biyoteknolojik olarak önem taşımaktadır. Gıda ve yem teknolojisindeki meyve suyu berraklaştırması ve maserasyonu gibi pek çok uygulamaları vardır. Düşük maliyetli kaynakların kullanımıyla katma değeri yüksek olan ürünlerin üretimi giderek önem kazanmaktadır. Bir fermentasyon prosesi için karbon ve azot kaynaklarının en önemli besin maddeleri olduğu iyi bilinmektedir. Fermentasyon besiyerlerinde genellikle amonyum nitrat, amonyum nitrit, et ekstraktı, maya ekstraktı ve pepton gibi pahalı kaynaklar kullanılmaktadır. Bu çalışmada, karbon kaynağı olarak keçiboynuzu ve glukoz kullanılarak rekombinant Aspergillus sojae'den mannanaz enzimi üretiminde ekonomik olarak uygun bazı azot kaynaklarının potansiyelinin belirlenmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla üç tanesi hayvansal (et-kemik unu, balık unu ve tüy unu) dört tanesi de bitkisel kökenli (kırmızı mercimek, pamuk tohumu, mısır zeini ve soya proteini) olmak üzere yedi farklı materyal denenmiştir. Fermentasyon ortamına bu materyaller üç farklı oranlarda (%0.5, %0.75, %1.0) ilave edilmiştir. Gerçekleştirilen fermentasyon çalışmaları neticesinde söz konusu materyaller ile ulaşılan maksimum enzim aktiviteleri; Kırmızı Mercimek(%0,5): 247,11 U/ml, Pamuk Tohumu(%1.0): 315.75 U/ml, Mısır zeini(%1.0): 228.17 U/ml, Soya Proteini(%0.75): 525,93 U/ml, Et-Kemik Unu(%0,75): 597.31 U/ml, Tüy Unu(%1): 355.77 U/ml, Balık Unu(%1): 310.73 U/ml şeklinde olmuştur. Elde edilen veriler keçiboynuzu ekstraktı kullanılarak yapılan denemelerden üretilen mannanaz enzim aktivite değerlerinin glukoz substratında yapılan denemelere göre daha yüksek olduğunu göstermiştir. Çalışmadan elde edilen sonuçlar, bu tip azot ve karbon kaynaklarının birlikte kullanıldığında pahalı kaynaklara ekonomik bir alternatif olabileceğini göstermiştir.
Farklı besiyeri bileşimleri ve fermentasyon stratejileri kullanılarak mikrobiyal poligalakturonaz üretiminin optimizasyonu
Üretim maliyetlerini düşürmek amacıyla fermentasyon ortamında düşük maliyetli materyallerin kullanımı son yıllarda araştırmacılar tarafından benimsenen bir yaklaşım olmuştur. Bu çalışmada Aspergillus sojae ile poligalakturonaz enzimi üretiminde 11 farklı karbon kaynağı ve 9 farklı azot kaynağı denenmiş olup en verimli seçilenler ile biyoreaktör denemeleri gerçekleştirilmiştir. Fermentasyon ortamındaki aşırı fungal gelişimin kontrolü için mikropartikül tekniği kullanılmış ve tüm denemelerde tekrar edilebilir sonuçlar elde edilmiştir. Küçük ölçekli (5-L) biyoreaktörde substrat miktarı ile hava akış hızı Merkezi Kompozit Tasarımı kullanılarak en yüksek enzim aktivitesi için optimize edilmiştir. Bu amaçla, optimum koşullarda (54.14 g/L substrat miktarı, 0.25 vvm havalandırma hızı) gerçekleştirilen fermentasyonlar için en yüksek enzim aktivitesi ultrafiltrasyon sonrasında 126.91 U/ml olarak tespit edilmiştir. Belirlenen optimum koşullar kullanılarak küçük ve büyük ölçekli (30-L) biyoreaktörlerde gerçekleştirilen enzim üretimlerine ait deneysel sonuçların 10 farklı matematiksel model ile uyumu incelenmiştir. Küçük ölçekli biyoreaktör denemeleri için deneysel veriler ile en uyumlu modeller Modifiye Gompertz, Modifiye Richards, Modifiye Lojistik ve Huang modelleri olarak tespit edilmiştir. Büyük ölçekli üretim için ise deneysel verilere en yakın aktivite tahminleri Modifiye Richards ve Modifiye Lojistik modelleri ile sağlanmıştır. Fermentasyonlardan elde edilen fermente sıvı örnekleri enzimin kısmi saflaştırması için 10 ve 100 kDa'lık ayırma sınırlarında ultrafiltrasyon kullanılmıştır. Ultrafiltrasyon öncesi ve sonrasına ait örneklerde protein miktar tayini yapılmış ve böylece spesifik aktivite değerleri belirlenmiştir. Ayırma sınırının 100 kDa olduğu ultrafiltrasyonda spesifik enzim aktivitesinde 2.45 kat artış sağlanmış ve 278.90 U/mg olarak belirlenmiştir. Ultrafiltrasyon sonrasında elde edilen permeat ve retentat örnekleri, enzimin toz formda ticari bir preparat olarak üretilebilme potansiyelini belirlemek amacıyla liyofilizasyon (dondurarak kurutma) işlemine tabi tutulmuş ve saflaştırma katsayıları tespit edilmiştir. Üretilen poligalakturonazın pektin, karboksimetil selüloz ve poligalakturonik asite olan ilgisi incelenmiş ve Km değerleri sırasıyla 21.2, 10.8 ve 4.1 mg/ml olarak bulunmuştur. Bununla birlikte, enzimin pektin, karboksimetil selüloz ve poligalakturonik asit substratlarında Vmax değerleri sırasıyla 101.7, 33.7 ve 40.2 µmol dk−1 mg−1 olarak belirlenmiştir. Üretilen poligalakturonaz Ag+, K+ ve Na+ iyonları ile etkileşime geçtiğinde aktivitesi stabil kalırken EDTA ajanı, Ba2+, Fe3+, Mn2+, Co2+ ve Sr2+ iyonlarının enzim üzerinde inhibitör etki gösterdiği tespit edilmiştir. Son olarak, fermentasyon öncesi, fermentasyon süreci ve fermentasyon sonrası aşamalarda kullanılmış olan hammadde, sarf ve enerji giderlerinin güncel birim fiyatları esas alınarak temel bir maliyet analizi hazırlanmıştır. Tez sonucunda; fermentör ortamında aşırı küf gelişimi ile kontrolü zorlaşan çalışma koşulları mikropartikül kullanımı ile iyileştirilerek standart-tekrar edilebilir üretimler gerçekleştirilmiş, üretim verilerinin matematiksel modellerle uyumlulukları belirlenmiş, üretilen poligalakturonaz başarılı bir şekilde karakterize edilmiş, kısmi olarak saflaştırılmış ve liyofilizasyon ile toz formda elde edilmiştir. Ayrıca doğal karbon kaynaklarının kullanımı için temel bir maliyet analizi yapılarak poligalakturonazın düşük maliyet ile üretim potansiyeli ortaya konmuştur.
Kalsiyum aljinatta immobilize edilmiş Saccharomyces cerevisiae hücreleri ile etanol üretimi üzerine inhibitör maddelerin etkisinin belirlenmesi
Günümüzde, enerjinin büyük bir bölümü petrol, kömür ve doğal gaz gibi fosil yakıtlardan elde edilmektedir. Hızla tükenen enerji kaynakları göz önüne alındığında bu durum gelişmiş ülkeleri alternatif yollar bulmaya yönlendirmiştir. Bu nedenle doğal tarımsal kaynaklarla ya da ucuz ve içeriği uygun lignoselülozik hammaddeler ile etanol üretimi gerçekleştirilmektedir. Saf karbon kaynaklarından etanol üretimi fermentasyon ve distilasyon aşamalarından oluşurken lignoselülozik materyallerden etanol üretimi ön-işlem, hidroliz, fermentasyon ve distilasyon aşamalarından oluşmaktadır. Bu işlemler sırasında fermentasyon ortamında olumsuz etki gösterebilecek inhibitörler oluşmaktadır. Bu maddeler biyokütle gelişimi engelleyerek ürün verimini azaltmaktadırlar. Yapılan bu çalışmada etanol üretimi için immobilize edilmiş Saccharomyces cerevisiae hücreleri kullanılmıştır. İmmobilizasyon ile hücrelerin inhibitörlere olan tolerans aralıklarını arttırmak amaçlanmıştır. Çalışmada inhibitör olarak HMF, furfural, fenol, asetik ve formik asit tek tek ve miks olmak üzere farklı konsantrasyonlarda kullanılmıştır. İnhibitörlerin karışımının fermentasyon üzerindeki etkisini belirlemek amacıyla 10 farklı deneme Plackett-Burman Dizayn ile oluşturulmuştur. Yapılan fermentasyonlar sonucunda besiyerinde 8 g/L HMF inhibitör etki göstermiştir. Furfural ile yapılan fermentasyonlarda 8 g/L furfural inhibitör etki göstermiştir. Fenol ile yapılan fermentasyonlarda 5 g/L fenol inhibitör etki göstermiştir. Asetik asit ile yapılan fermentasyonlarda 7,5 g/L asetik asit inhibitör etki göstermiştir. Formik asit ile yapılan fermentasyonlarda 1,5 g/L formik asit inhibitör etki göstermiştir. Elde edilen istatistik sonuçlarında ise miks olarak yapılan fermentasyonlarda furfuralın etkisinin diğer inhibitörlere kıyasla daha etkili olduğu görülmüştür. Çalışmanın diğer kısmında ise en iyi etanol elde edilen fermentasyonlara 10 farklı matematiksel model uygulanmıştır. Kontrol fermentasyonunda etanol üretimi için MMF uygun model olarak seçilmiştir. HMF ve furfural ilavesi ile gerçekleştirilen fermentasyonlarda etanol üretimi için MGM uygun model olarak seçilmiştir. Fenol ilavesi ile gerçekleştirilen fermentasyonda etanol üretimi için Baranyi uygun model olarak seçilmiştir. Asetik asit ilavesi ile gerçekleştirilen fermentasyonda etanol üretimi için MGM uygun model olarak seçilmiştir. Formik asit ilavesi ile gerçekleştirilen fermentasyonuda etanol üretimi için MMF uygun model olarak seçilmiştir. Miks fermentasyonlarda ise etanol üretimi için Weibull uygun model olarak seçilmiştir. Etanol üretim proseslerinde hammaddelere ve yapılan ön işlemlere bağlı olarak inhibitör maddeler yan ürün olarak meydana gelmektedir. Bu çalışma ile de immobilize hücrelerin HMF, furfural, fenol, asetik ve formik asit gibi inhibitörlere karşı tolerans aralıkları belirlenmiştir. Ayrıca bu inhibitörlerin karışım olarak kullanıldığı miks fermentasyonlar ile hücrelerin tolerans aralığı farklı bir açıdan da gözlemlenmiştir. Yapılan çalışma literatür ile karşılaştırıldığında immobilizasyon işleminin tolerans aralığını genişlettiği ve hücreleri koruduğu görülmüştür. Aynı zamanda belirlenen tolerans aralıkları ile zaman, maliyet ve enerji açısından çalışmalar için olumlu bir kapı açmaktadır.
Keçiboynuzu ekstraktının hyaluronik asit üretiminde karbon kaynağı olarak değerlendirilmesi ve üretim şartlarının optimizasyonu
Hyaluronik asidin insan sağlığı açısından oldukça önemli bir biyopolimer olduğu ve hayvansal kaynaklardan izole edildiği ilk günden itibaren gerçekleştirilen çalışmalarla ortaya konmuştur. Düz zincirli doğal glukozaminoglikan polimeri olan bu polisakkarit doğal üretici olan Grup A ve Grup C Streptococcus türleri tarafından biyoteknolojik yöntemlerle de üretilebilmektedir. Sahip olduğu yüksek su tutma kapasitesi, viskoelastiklik, yüksek molekül ağırlıklarına ulaşabilme gibi özellikleri nedeniyle biyoyarayışlılığı yüksek olan bu biyopolimer ortopedik rahatsızlıkların tedavisinde, göz hastalıkları ve göz cerrahisinde, estetik cerrahisinde kullanılan dolgu materyallerinde, cilt yenilenmesi ve kırışıklık giderilmesinde, kanser hücrelerinin tespiti ve tedavisinde, ilaç taşıma sistemlerinde ve kozmetik sektöründe doğrudan veya yardımcı materyal şeklinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Oldukça yüksek kullanımı olan bu biyopolimerin fermentasyon şartlarının iyileştirilmesi ve üretim maliyetlerinin düşürülmesi biyoteknolojik yollarla gerçekleştirilen hyaluronik asit üretimi için büyük önem taşımaktadır. Bu tez çalışmasında, ülkemizde yüksek miktarda yetiştirilen keçiboynuzu meyvesinin karbon kaynağı olarak fermentasyon ortamında kullanılmasıyla yüksek katma değere sahip bir ürün olan hyaluronik asidin üretim potansiyeli araştırılmıştır. Tez çalışması kapsamında, öncelikle keçiboynuzu meyvesi ekstraktı kullanılarak Streptococcus equi subsp. zooepidemicus ATCC 39920 bakterisi ile hyaluronik asit üretim fermentasyonunun besiyeri içeriğinin optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla kazein, maya ekstraktı, et ekstraktı ve pepton olmak üzere 4 farklı azot kaynağı ve MgSO4.7H2O, KH2PO4, NaCl, K2HPO4 ve FeSO4 gibi 5 farklı mineral kaynağı ile keçiboynuzu meyvesi ekstraktı besiyeri bileşenleri olarak belirlenmiştir. Besiyeri optimizasyonunu gerçekleştirmek üzere bu bileşenlere ek olarak inokülasyon oranını da içeren Plackett-Burman tasarımı oluşturulmuştur. Tasarımın sunduğu 15 farklı deneme için çalkalamalı inkübatörde 37°C sıcaklıkta, 150 rpm çalkalama hızında başlangıç pH 7.0 değerinde fermentasyonlar gerçekleştirilmiştir. Fermentasyonlar sonrasında tespit edilen hyaluronik asit miktarları yanıt yüzeyi olarak kullanılmış ve Plackett-Burman tasarımı ile besiyeri optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. Optimum besiyeri ile çalkalamalı inkübatörde gerçekleştirilen fermentasyon sonunda hyaluronik asit miktarı 2.60 g/L olarak tespit edilmiştir. Varyans (ANOVA) analizi sonucunda; oluşturulan model, KH2PO4, NaCl ve FeSO4 istatistiksel olarak (P<0.05) olarak önemli bulunmuştur. Bu doğrultuda elde edilen optimum besiyeri bileşimi kullanılarak biyoreaktörde hyaluronik asit üretimleri gerçekleştirilmiştir. Fermentasyon parametrelerinin üretilen hyaluronik asidin molekül ağırlığı üzerine etkisi Box-Behnken cevap yüzey tasarımı kullanılarak incelenmiştir. Havalandırma miktarı, karıştırma hızı ve başlangıç biyokütle yoğunluğu olarak seçilen bağımsız değişkenler ile deneme deseni oluşturulmuş ve fermentasyonlar gerçekleştirilmiştir. Ayrıca preperatif HPLC kullanılarak moleküler ayırma (size exclusion, SEC) kromatografisi ile hyaluronik asitin moleküler ağırlık aralıkları belirlenmiştir. Biyoreaktör denemeleri sonucunda oluşturulan model ve havalandırma miktarı istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (P<0.05). Tez çalışması sonucunda alternatif bir karbon kaynağı olan keçiboynuzu meyvesinden optimum besiyerinde çalkalamalı inkübatörde 2.60 g/L hyaluronik asit üretilmiştir. Bununla birlikte biyoreaktörde üretilen hyaluronik asidin ortalama molekül ağırlığının 500 kDa ile 1750 kDa arasında değiştiği tespit edilmiştir. Böylece keçiboynuzu meyvesinin katma değeri yüksek bir ürün olan hyaluronik asit üretiminde kullanılabileceği kanıtlanmış, bu hammaddeyi içeren besiyerinin optimum bileşimi ve fermentasyon şartları tespit edilmiştir.
Rekombinant Aspergillus sojae AsT3 kullanılarak katı faz fermentasyonu ile mannanaz üretimi
Katı faz fermentasyonu (KFF), enzimler, organik asitler ve biyoyakıtlar gibi katma değeri yüksek endüstriyel ürünlerin üretiminde sıvı kültür fermentasyon yöntemine göre daha ucuz ve çevre dostu olmasından dolayı alternatif olarak tercih edilmektedir. KFF, nemli katılar üzerinde mikroorganizma gelişimi için uygun bir ortam oluşturduğundan dolayı katı atıkların değerlendirilmesinde kullanılmaktadır. Bu çalışmada ucuz ve bol bulunan farklı lignoselülozik biyokütlelerden (arpa kavuzu, buğday kepeği, çavdar kepeği, yulaf kavuzu) fermentasyonla Aspergillus sojae AsT3 kullanılarak mannanaz üretimi gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla beş farklı substrat (arpa kavuzu, buğday kepeği, çavdar kepeği, yulaf kavuzu ve karışım) üzerinde ve üç farklı inokülasyon oranında (%3, 5 ve 7) katı faz fermentasyonları yapılmıştır. Ayrıca katı faz fermentasyonu ile üretilen β-mannanaz enziminin kullanım alanlarından biri olan mannooligosakkaritlerin (MOS) üretimi de incelenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre en iyi karbon kaynağı seçilmiş ve bağımsız değişkenlerin etkisini incelemek için PlackettBurman Dizayn (PBD) ile belirlenen 10 farklı fermentasyon denemesi gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte MOS üretimini artırmak için PBD ile belirlenen fermentasyonlar gerçekleştirilirken en iyi karbon kaynağına mannan içerdiği bilinen kahve atıkları ilave edilmiştir. Fermentasyon denemeleri sonucunda her bir karbon kaynağı için farklı inokülasyon oranlarında en yüksek β-mannanaz aktivitesi sırasıyla; yulaf kavuzunda 413.50 U/mg (%5), arpa kavuzunda 582.59 U/mg (%7), çavdar kepeğinde 983.53 U/mg (%7), buğday kepeğinde 55.59 U/mg (%5) ve karışım fermentasyonlarında ise 262.75 U/mg (%7) olarak bulunmuştur. Bu sonuçlara göre en yüksek β-mannanaz aktivitesine (983.53 U/mg) %7 inokülasyon oranı kullanılan çavdar kepeğinde ulaşılmıştır. β-Mannanaz ve MOS üretiminde PBD ile belirlenen şartlarda bağımsız değişkenlerin etkisi incelemiş ve sonuç olarak 30°C'de 7 gün boyunca %7 inokülasyon oranı ve başlangıç pH 7.0 olan fermentasyon şartlarının en iyi olduğu tespit edilmiştir. Fermentasyon ortamına eklenen kahve atığı enzim üretimini inhibe etmiş ancak MOS üretimini artırmıştır. PBD ile belirlenen koşullarda gerçekleştirilen fermentasyonlarında en yüksek değerlerdeki MOS bileşenleri ve toplam MOS değerleri, mannobioz için 80.59 ppm (6. deneme), mannotrioz için 69.94 ppm (1. deneme), mannotetroz için 210.37 ppm (3. deneme), mannopentoz için 391.87 ppm (1. deneme), mannoheksoz için 533.40 ppm (9. deneme) ve toplam MOS değeri için 1086.45 ppm (9. deneme) olarak bulunmuştur. Ayrıca PBD ile gerçekleştirilen fermentasyonlar sonucunda, inkübasyon sıcaklığının βmannanaz üretiminde etkili olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmada, katı faz fermentasyon yöntemi ile rekombinant Aspergillus sojae AsT3 (ATCC 11906) kullanılarak mannanaz üretimi ve aynı zamanda MOS üretimi amaçlanmıştır. Sonuçlar incelendiğinde, atıkların değerlendirilmesi, düşük enerji gereksinimi ve mikroorganizma gelişimi için uygun bir ortam olması sebebiyle KFF'nin β-mannanaz ve MOS üretimi için uygun olduğu belirlenmiştir. ANAHTAR KELİMELER: Katı faz fermentasyon, lignoselüloz, rekombinant Aspergillus sojae, mannooligosakkarit
İnülinaz enziminin üretimi, kısmi saflaştırılması, karakterizasyonu ve fermentasyonlarının matematiksel modellenmesi üzerine bir araştırma
Bu çalışmanın amacı, enzim üretimi için en iyi karbon kaynağını belirlemek, enzim üretiminde kullanılan besiyeri formülasyonunu otimize etmek, üretilen enzimi kısmi saflaştırmak, enzimin özelliklerini belirlemek ve fermentasyonları ve substrat spesifikliğini matematiksel modellemektir. Elde edilen sonuçlara göre, Aspergillus niger A42 (ATCC 204447) ile inülinaz (Iase) enziminin üretiminde kullanılan on farklı karbon kaynağı arasından en iyisi melas olmuştur (383.73 U/mL). Üretilen enzimin optimum çalışma koşulları pH 4.8, 60ºC sıcaklık ve 10 dk inkübasyon süresi olarak belirlenmiştir. Plackett-Burman Dizayn (PBD) ile besiyeri kompozisyonunun optimizasyonunda, optimum besiyeri %1 maya ekstraktı ve %1 peptondan oluşmuştur (Iase=1011.02 U/mL, sukraz (Sase)=834.28 U/mL ve I/S oranı=1.22). Besiyerinde kullanılan maya ekstraktı ve peptonun konsantrasyonu, Merkezi Kompozit Dizayn (MKD) ile optimize edilmiş ve optimum besiyeri kompozisyonu %4.2 maya ekstraktından oluşmuştur (Iase=1294.50 U/mL, Sase=1076.85 U/mL, I/S oranı=1.20). Kinetik modelleme neticesinde, PBD ile optimize edilen besiyerinde enzim üretimi fungal gelişimden bağımsızdır (α≤0 ve β≠0). MKD ile optimize edilen besiyerinde ise enzim üretimi karışık gelişimle ilgilidir (a≠0 and β≠0). Küçük ölçekli biyoreakördeki (5-L) fermentasyonlar, pH kontrolsüz ve havalandırmalı ortamda gerçekleştirilmelidir (Iase=1810.76 U/mL, Sase=1537.88 U/mL ve I/S oranı=1.18). Büyük ölçekli biyoreaktörde (30-L) gerçekleştirilen fermentasyonun sonucunda Iase, Sase ve I/S oranı sırasıyla 791.35 U/mL, 616.90 U/mL ve 1.28 olarak belirlenmiştir. Elde edilen enzim solüsyonu, santrifüj-süre kombinasyonu (16873 g-5 dakika, Iase=1181.18 U/mL, saflaştırma katsayısı (SK)=1.39) ve UF membranı (10 kDa, Iase=12065.20 U/mL, SK=5.33) ile kısmi olarak saflaştırılmıştır. Diğer yandan, enzimin substrat spesifikliğinde, aktivitesi düşük olan enzimin inüline olan afinitesinin sukrozdan daha yüksek olduğu belirlenmiştir (Km inülin=17.79 g/L < Km sukroz=49.43 g/L). Tam tersine, aktivitesi yüksek olan enzimin sukroza olan ilgisinin inülinden daha yüksek olduğu tespit edilmiştir (Km inülin=28.77 g/L > Km sukroz=25.95 g/L). Substrat üzerine eklenen enzim miktarının artması ile birlikte aktivitenin arttığı belirlenmiştir. Mn2+, enzimin aktivatörü, Cu2+ ve Ag+ ise enzimin inhibitörü olmuştur. Üretilen enzimin 30ºC, 40ºC ve 50ºC sıcaklıklarda termostabil olduğu belirlenmiştir. Ek olarak, enzimatik reaksiyonun termal inaktivasyon ve termodinamik parametreleri de hesaplanmıştır. Buna göre Ea, Eia ve Z değerleri sırasıyla 37.3 kJ/mol.K, 112.86 kJ/mol ve 12.80ºC olarak hesaplanmıştır. Sıcaklık 60ºC'den 80ºC'ye artırıldığında, enzimin inaktivasyon hız sabiti ve entropisi artarken yarılanma ömrü, D-değeri, entalpi ve serbest enerjisi azalmıştır. Bunun yanısıra, enzimin moleküler ağırlığının 60-70 kDa arasında olduğu belirlenmiştir. PBD ve MKD ile optimize edilen besiyeri kompozisyonunda gerçekleştirilen fermentasyonların deneysel verileri matematiksel modeller kullanılarak tahmin edilmiştir. Öte yandan, deneysel kinetik parametre değerleri de modellerden tahmin edilen değerler kullanılarak hesaplanmış ve karşılaştırılmıştır. Son olarak, enzimin substrat spesifikliğinin deneysel verileri de matematiksel modeller kullanılarak tahmin edilmiştir. Deneysel Vmax ve Km değerleri, modellerden tahmin edilen Vmax ve Km değerleri ile karşılaştırılmıştır. En iyi model(ler), model kıyaslama verilerine (ortalama karesel hata (RMSE), ortalama mutlak hata (MAE), ortalama standart sapma (MSD), belirleme katsayısı (R2), eğim (m), Akaike bilgi ölçütü (AIC), ön yargı faktörü (BF) ve kesinlik faktörüne (AF)) göre tespit edilmiştir. Sonuç olarak, inülinaz enziminin üretimi, fermentasyonların kinetik modellemesi, üretilen enzimin kısmi saflaştırılması ve karakterizasyonu ve fermentasyonlar ve substrat spesifikliğinin modellenmesi başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Çalışma, hem fermentasyon öncesi (upstream processing) hem de fermentasyon sonrası (downstream processing) prosesleri içermektedir.
İnülinaz enziminin fermentasyonla üretiminde inhibitör bileşiklerin etkisi
Biyoteknolojik yöntemlerle inülinaz gibi katma değeri yüksek ürünlerin üretiminde son zamanlarda saf karbon kaynaklarının kullanımına alternatif olarak lignoselülozik kaynakların kullanımına ilgi artmıştır. Ancak söz konusu kaynakların karbon kaynağı olarak kullanılabilmesi için uygulanan çeşitli ön işlemler sonucunda fermentasyon ortamını etkileyecek inhibitörler oluşmaktadır. Bu aşamada son ürün üretiminde kullanılacak mikroorganizmanın inhibitör bileşiklere karşı hassasiyetinin bilinmesi oldukça önem taşımaktadır. Bu çalışmada inhibitör olarak farklı konsantrasyonlarda HMF (1.0-6.0 g/L), furfural (0.1-2.0 g/L), fenol (0.1-5.0 g/L), asetik asit (2.5-12.5 g/L) ve formik asit (1.5-7.0 g/L) kullanılarak Aspergillus niger A42 (ATCC® 204407) ile inülinaz fermentasyonları gerçekleştirilmiştir. Her bir inhibitör için en iyi Iase aktivitesinin elde edildiği fermentasyonlara 10 farklı matematiksel model (MGM, MLM, MRM, Stannard, Weibull, MMF, Asimetrik, Baranyi, Huang, Fitzhugh) uygulanmıştur. Ayrıca tüm denemelerin sonuçları incelendikten sonra lignoselülozik materyalden gelmesi muhtemel tüm inhibitörleri içeren karışım fermentasyonunun sinerjist etkisini incelemek için Placket-Burman Dizayn kullanılmıştır. Çalışmanın son aşamasında ise arpa kavuzu, yulaf kavuzu, buğday kepeği ve çavdar kepeği hidrolizatları sülfürik asit ile hidroliz edilmiş ve hidrolizatlarda inhibitör bileşen tayini yapılmıştır. Hidrolizatlar detoksifiye edilmeden fermentasyon sıvısı olarak kullanılmış olup inülinaz fermentasyonları gerçekleştirilmiştir. Fermentasyon denemeleri sonucunda her inhibitör bileşik için en yüksek ve en düşük Iase aktivitesi HMF için 268.74 U/mL (1 g/L HMF), 62.76 U/mL (6 g/L HMF) furfural için 197.35 U/mL (0.1 g/L furfural), 5.14 U/mL (1.0 g/L furfural), fenol için 117.39 U/mL (0.1 g/L fenol), 12.57 U/mL (5 g/L fenol), asetik asit için 340.32 U/mL (2.5 g/L), 3.24 U/mL (12.5 g/L) ve formik asit için 136.83 U/ml (1.5 g/L formik asit), 312.69 U/mL (7 g/L formik asit) olarak bulunmuştur. Iase aktivitesinin en yüksek olduğu fermentasyonlara 10 farklı model uygulanmıştır. Modeller, model parametreleri (RMSE, MAE, AF, BF, R2) yardımıyla kıyaslanmış olup HMF ilavesiyle gerçekleştirilen fermentasyon için Stannard, furfural için Weibull, fenol için MGM, asetik asit için Huang ve formik asit için Weibull inülinaz üretimi açısından en uyumlu modeller olarak belirlenmiştir. İnhibitörlerin sinerjist etkisinin incelenmesi amacıyla Plackett-Burman Dizayn (PBD) ile inhibitörlerin karışım fermentasyonlarının optimizasyonunda tüm inhibitörlerin minimum (3.0 g/L HMF, 0.1 g/L furfural, 0.1 g/L fenol, 2.5 g/L asetik asit ve 3.0 g/L) konsantrasyonda olduğu fermentasyonda (3 numaralı deneme) 215.77 U/mL Iase aktivitesi tespit edilmiştir. Optimum karışım fermentasyonuna ait Iase aktivitesinin kontrol fermentasyonundan istatistiksel olarak da farklı olmadığı görülmüştür (P>0.05). Çalışmanın son aşamasında ise arpa kavuzu, yulaf kavuzu, buğday kepeği ve çavdar kepeğinin seyreltik asit ile hidrolizi ile inülinaz fermentasyonları gerçekleştirilmiş olup Iase aktivitesi sırasıyla 202.29, 42.03, 244.13 ve 254.60 U/mL olarak bulunmuştur. Bu çalışma sonucunda Aspergillus niger A42 (ATCC® 20447)'nin farklı inhibitör (HMF, furfural, fenol, asetik asit ve formik asit) konsantrasyonlarına karşı tolerans aralıkları belirlenmiştir. Böylece mikroorganizmanın, lignoselülozik materyallerin işlenmesiyle açığa çıkması muhtemel inhibitör konsantrasyonlarına karşı tepkisi ortaya konmuştur. Ayrıca PBD ile gerçekleştirilen karışım fermentasyonları ile mikroorganizmanın tolere edebileceği inhibitör karışımı optimize edilmiştir (3.0 g/L HMF, 0.1 g/L furfural, 0.1 g/L fenol, 2.5 g/L asetik asit ve 3.0 g/L). Arpa kavuzu, çavdar kepeği ve buğday kepeği hidrolizatlarındaki inhibitör bileşik konsantrasyonlarını mikroorganizmanın tolere edebildiği ve detoksifikasyon işleminin gerek olmadığı ortaya konmuştur. Bu tez çalışması kapsamındaki gerçekleştirilen tüm fermentasyonların lignoselülozik maddeler ile gerçekleştirilecek fermentasyonlarda detoksifikasyon gibi proseslerin gerekliliğine karar verme aşamasında önemli olacağı düşünülmektedir. ANAHTAR KELİMELER: İnülinaz, inhibitör, Aspergillus niger, asetik asit, fenol, fermentasyon, formik asit, furfural, HMF.
Kombucha çayı üretiminde farklı substrat kaynaklarının kullanımı
Kombucha çayı, hafif ekşimsi-tatlı lezzete sahip fermente bir içecek olarak tanımlanmaktadır. Çeşitli bakteri ve mayaların simbiyotik birlikteliğinden oluşan Kombucha mantarı ile elde edilmektedir. Kombucha çayı ülkemizde ne yazık ki çok fazla bilinmemektedir. Ayrıca bu konu ile ilgili bilimsel çalışmaların literatürde yok denecek kadar az olduğu dikkat çekmektedir. Bu çalışma kapsamında; farklı bitki- meyve çayları ve kahvede Kombucha mantarının gelişiminin incelenmesi ve çeşitli şeker kaynakları ile gelişimdeki farklılıkların belirlenmesi hedeflenmiştir. Çalışmada 6 farklı çay olarak siyah çay, yeşil çay, adaçayı, nar (hibiskus) çayı, yaban mersini çayı, kuşburnu çayı ve kahve; şeker kaynakları olarak da glukoz, fruktoz, ksiloz, laktoz, sakkaroz (70 g/L) kullanılmıştır. Araştırma sonucu verilerine göre; tüm örneklerin pH değeri fermentasyon boyunca azalmıştır. Meyve çayları kullanılarak elde edilen fermentasyon örneklerinin asitlik değeri, bitki çayları ve kahve Kombucha çaylarına oranla daha yüksektir. Fermentasyon sonunda elde edilen Kombucha çayının fenolik madde miktarı ve antioksidan aktivitesi, önemsenecek düzeyde ürün olabilme potansiyelini ortaya koymuştur. Biyokütle gelişimi çay örneklerinde genel olarak en fazla glukoz ve sakkaroz şekerinde, en az ise fruktoz şekerinde belirlenmiştir. Kahve örneğinde ise laktoz şekerinde biyokütle miktarı en fazla iken fruktoz şekerine ait örneklerde biyokütle miktarı en azdır. Siyah çayda en aktif kullanılan şeker glukoz iken, diğer tüm kaynaklarda en çok fruktoz şekeri tüketilmiştir. Tüm çaylarda ksiloz ve laktoz şekerlerinin kullanım miktarları en az bulunmuştur. Nar çayına ait örneklerin fermentasyonu sonucu renk değerlerinde değişim gözlemlenmemiştir. Yaban mersini ve kuşburnu Kombucha çaylarında, ksiloz şekeri kullanılarak elde edilen fermentasyon örneklerinin L, a, b değerlerinin fermentasyon ile değiştiği belirlenmiştir. Bitki çaylarında ise glukoz, ksiloz ve fruktoz şekerlerinde L, a, b değerlerinin fermentasyon ile değiştiği ve bu değişimlerin istatistiksel olarak önemli olduğu tespit edilmiştir. Kombucha çay örneklerinin organik asit profilinde; okzalik asit varlığı glukoz ve sakkaroz şekerinde artarken, diğer karbon kaynaklarında fermentasyon ile azalma göstermiştir. Tartarik asit değerlerinin fermentasyon ile arttığı belirlenmiştir. Kombucha örneklerinde genellikle fermentasyon öncesi malik asit varlığı gözlemlenmezken fermentasyon ile malik asit oluşumu saptanmıştır. Meyve çayları, adaçayı ve kahve örneklerinde başlangıçta laktik asit bulunmadığı, fermentasyon ile laktik asit oluşumunun gerçekleştiği belirlenmiştir. Siyah çay ve yeşil çay örneklerinde ise glukoz şekerinde gerçekleştirilen fermentasyon sonucunda mevcut laktik asit miktarının arttığı, diğer karbon kaynaklarında ise azaldığı gözlemlenmiştir. Sitrik asit varlığı ise nar çayı haricinde tüm karbon kaynaklarında fermentasyon sonrası tespit edilmiştir. Suksinik asit, meyve çaylarında gerçekleştirilen fermentasyon sonucu elde edilmiş ve miktarı artmıştır. Yeşilçay ve kahve örneklerinde ise glukoz şekerinde azalma belirlenmiştir. Siyah çay örneklerinde fumarik asit varlığına rastlanmamıştır. Yaban mersini, kuşburnu, yeşilçay ve kahve örneklerinin fruktoz şekerinde fermentasyon sonucu fumarik asit oluşumu tespit edilmiştir. Nar çayında glukoz, ksiloz ve fruktoz, adaçayında ise sakkaroz, ksiloz, laktoz, fruktoz şekerlerinde fumarik asit oluşumu gözlemlenmiştir. Fermentasyon sonucunda örneklerin hiçbirinde etanol varlığına rastlanmamıştır. Duyusal analiz sonucuna göre en beğenilen ürün nar (hibiskus) Kombucha çayı iken, en az tercih edilen fermente çayın ise adaçayı ile elde edilen Kombucha çayı olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışma sonucunda farklı meyve, bitki çayları ve kahve ekstraktı kullanılarak farklı substratlarda Kombucha çaylarının üretimi gerçekleştirilmiştir. Böylelikle farklı tüketim olanakları oluşturulmuş ve elde edilen ürünlerin kimyasal kompozisyonları incelenmiştir.
Keçiboynuzu ekstraktının inülinaz enzimi üretiminde karbon kaynağı olarak kullanımı
İnülin, yapısında glukoz ve fruktoz içeren bitki kaynaklı polisakkaritten biridir. Enzimler canlı hücreler tarafından oluşturulan ve kimyasal reaksiyonları spesifik olarak katalizleme yeteneğine sahip protein yapıdaki maddelerdir. İnülinazlar ise inüline spesifik olan ve onu hidrolize eden enzimlerdir. Bazı mikroorganizmalarda bulunan inülinazlar, inülin üzerindeki etki şekline göre endo-inülinaz ve ekzo-inülinaz olarak ayrılmaktadır. Aspergillus niger tarafından üretilen inülinazlar, inülini ekzo tipi hidrolize etmektedir. İnülinazlar gıda endüstrisi ve diğer alanlarda kullanımı ile önemli bir paya sahiptir. Keçiboynuzu meyvesi ülkemizde genellikle Akdeniz kıyı şeridinde doğal alanlarda yetişmektedir. Pek çok endüstri alanında yaygın olarak kullanılmakta olan şeker içeriği yüksek bu meyve biyoteknolojik açıdan substrat olarak kullanıma da oldukça uygundur. Bu projede, inülinaz enzimi üretiminde alternatif bir karbon kaynağı olarak keçiboynuzu meyvesi ekstraktının kullanım potansiyeli araştırılmıştır. Bu çalışmada daha önce inülinaz enzimi üretiminde hiç kullanılmamış olan keçiboynuzu meyvesi ekstraktı karbon kaynağı olarak kullanılmıştır. Keçiboynuzu ekstraktının içerisine ayrı ayrı ve farklı oranlarda eklenen 7 farklı besiyeri bileşeni ile 12 farklı besiyerinin Plackett-Burman ile formülasyonu yapılmış, fermentasyonları gerçekleştirilmiş ve maksimum inülinaz aktivitesi için optimum besiyeri bileşiminin 5°Bx keçiboynuzu ektraktı ve buna %1 maya ekstraktı ilavesi olduğu saptanmıştır. Sonrasında Cevap Yüzey Metodu (CYM) ile optimum fermentasyon çalışma koşulları 250 rpm çalkalama hızı, %2.3 inokülasyon miktarı ve 135 mL medya hacmi olarak belirlenmiştir. CYM ile önerilen fermentasyonlar sonucu maksimum aktivite 1646.05 U/mL olmuştur. Design Expert ile optimize edilen fermentasyon koşullarında gerçekleştirilen doğrulama denemeleri sonucunda maksimum enzim aktivitesi olan 1560.17 U/mL değerine ulaşılmıştır. Fermentasyonla elde edilen enzim preperatı ultrafiltrasyon ile 10, 30, 50 kDa ayırma sınırındaki filtrelerden geçirilerek kısmi saflaştırma işlemi gerçekleştirilmiştir. UF işlemi sonucunda 50 kDa retentat kısmında 6133.72 U/mL inülinaz saptanırken, 30 kDa'da 6278.69 U/mL, 10 kDa'da ise 6343.26 U/mL inülinaz aktivitesi elde edilmiştir. Böylece UF işlemi ile yaklaşık 4.5 kat enzim aktivitesi artışı sağlanmıştır. Sonuçlar keçiboynuzu ekstraktının inülinaz enzimi üretiminde iyi bir karbon kaynağı olarak kullanılabileceğini göstermiştir. Ayrıca bu tez çalışması ile hammaddeden ürüne kadar bütünlük içeren bir enzim üretim modeli oluşturulmuştur.
Pirinç kavuzu hidrolizatının biyofilm reaktörde kesikli ve sürekli sistemlerle etanol fermentasyonu ve üretimin matematiksel modellerle tanımlanması
Günümüzde nüfus ve sanayileşmede hızlı bir büyüme gerçekleştiğinden yakıt ve özellikle de yüksek verimlilik ve düşük çevre etkisi olan biyo-enerji kaynakları arasında sayılan etanole, dünya çapındaki talep sürekli artmaktadır. Lignoselüloz biyokütle, birçok endüstriyel prosesin ve tarımsal materyalin yan ürünü olarak ortaya çıkan en bol ve yenilenebilir karbon kaynaklarıdır ve basitçe bazı enerji bitkilerinden üretilebilir. Lignoselülozik materyaller biyoetanol üretimi için dünya çapında artan bir ilgi görmektedir. Bu çalışmada Pichia stipitis ATCC 58784 ve ATCC 58785 mayaları kullanılarak pirinç kavuzu hidrolizatından biyofilm reaktörde etanol üretimleri gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla öncelikle biyofilm reaktör seçiminde kullanılacak destek materyalinin seçimi yapılmıştır. Her iki mikroorganizma için de farklı oranlarda denemeler gerçekleştirilerek en iyi karbon kaynağı bileşiği belirlenmiştir. Bunun sonucunda 1.numaralı besiyeri olarak "%50 pirinç kavuzu hidrolizatı + % 50 glukoz", 2.numaralı besiyeri olarak ise "%75 pirinç kavuzu hidrolizatı + % 25 ksiloz" seçilmiştir. Fermentasyon sonunda tüm kinetik parametreler ve sonuçlar incelendikten sonra pirinç kavuzu hidrolizatının fermentasyon ortamında kullanılmasında P.stipitis ATCC 58785 suşunun daha etkili olduğu görülmüştür. Ayrıca azot kaynağının etkisi incelenerek en iyi azot kaynağı ikilisinin maya ekstraktı ve pepton olduğu belirlenmiştir. Fermentasyon ortamında en uygun karbon kaynağı içeriği ve azot kaynağı çeşidinin belirlenmesinden sonra sürekli sistemde fermentasyonlar gerçekleştirilmiştir. Buradan elde edilen ürün ve biyokütle verimlilik değerlerinin kesikli fermentasyona göre daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Tüm bunların yanında zenginleştirme ve sterilizasyon işleminin biyofilm reaktörde önemli olduğu görülmüştür. Fermentasyon işlemleri sonucunda elde edilen sonuçlar ve hesaplanan kinetik parametreler kullanılarak (deneysel veriler) 11 farklı matematiksel model ile etanol üretimi, biyokütle gelişim ve substrat tüketimi modellenmiştir. Bu amaçla MGM, MLM, MRM, Stannard, Weibull, MMF, Asimetrik, Baranyi, Huang, Fitzhugh ve Cone modelleri kullanılmıştır. 1 numaralı besiyeri için, biyokütle gelişiminin ve etanol üretiminin deneysel verilerinin modellenmesinde en iyi model Fitzhugh model olurken, şeker tüketiminde en iyi modeller Baranyi ve Huang modelleri olmuştur. 2 numaralı besiyeri için hem hücre gelişiminin hem de şeker tüketiminin deneysel verilerinin modellenmesinde en iyi modeller MMF ve Cone modelleri olurken, etanol üretimi için en başarılı modellerin MGM ve MRM olduğu tespit edilmiştir. Elde edilen sonuçlar pirinç kavuzu hidrolizatının fermentasyon ortamında potansiyel bir karbon kaynağı olabileceğini göstermiştir.