Theses supervised by Prof. Dr. Aynur Gürel
12 theses · Ege University, Manisa Celal Bayar University
Pamuk (Gossypium hirsutum L.)'da Verticilliumsolgunluğu (Verticillium dahliae Kleb.)'na karşıdayanıklı hatların In Vitro seleksıyon ile eldeedilmesine yönelik araştırmalar
Pamuk, ülkemiz ekonomisinin önemli sektörlerinden olan tekstil başta olmak üzere birçok farklı sanayi kolunun hammaddesidir. Pamuk tarımının ve pamuğa dayalı sanayinin sağladığı iş istihdamı göz önünde bulundurulduğunda, pamuk; hem Dünya, hem de ülkemiz genelinde sosyo-ekonomik yapı içerisinde önemli etkilere sahip bulunmaktadır. Pamuk bitkisindeki mevcut en önemli hastalık, vejetasyonun her aşamasında sorun olabilen toprak patojeni Verticillium dahliae Kleb. fungal etmeninin neden olduğu solgunluk hastalığıdır. Geniş bir konukçu dizisine sahip olan hastalık etmeni, Dünya'da ve ülkemizde önemli ekonomik kayıplara yol açmaktadır. Hastalık sebebiyle üreticiler birim alandan yeterli verimi alamamakta ve lif kalite değerleri olumsuz şekilde etkilenmektedir. Mevcut sistemde hastalıkla mücadelede istenilen başarı henüz sağlanmış değildir. Kimyasal mücadelesi olmayan bu hastalığa karşı dayanıklı çeşitlerin kullanılması gerekmektedir. Verticillium solgunluğuna karşı dayanıklılık genleri bilinmekle birlikte, bunların klasik ıslah çalışmalarında kullanılması oldukça zor ve pahalı olduğu gibi uzun zaman da almaktadır. Bitki ıslahında, biyoteknolojik yöntemlerin kullanımı ise; ıslah çalışmalarında zaman kazanımı ve seleksiyon aşamasında da doğru bireylerin seçimi açısından büyük önem taşımaktadır. Bu projede in vitro seleksiyon çalışmalarında somaklonal varyasyonun ortaya çıkmasında öneme sahip olan mutasyon kullanımı ve etkili mutasyon dozunun belirlenmesi, ayrıca pamuk (Gossypium hirsutum L.) kalluslarında Verticillium Solgunluk Etmeni (Verticillium dahliae Kleb.)'ne ait kültür filtratı uygulamalarının kallusların fizyolojik gelişim ve biyokimyasal içerik üzerine olan etkilerinin ortaya çıkarılması amaçlanmıştır. Bu amaçla Verticillium solgunluğuna karşı duyarlı (NP Özbek 100) ve tolerant (Carmen) pamuk çeşitleri kullanılarak, kültür filtratı ve mutajen uygulamalarının hastalığa karşı dayanıklı bitki elde edilmesindeki potansiyelleri incelenmiştir. Dört farklı gama ışını radyasyon dozunun (100, 200, 300 ve 400 Gy) tohum çimlenme oranı, fide boyu ve kök uzunluğu üzerindeki etkileri incelenmiştir. Çimlenme denemesinin 7. gününde, çimlenme oranı, fide boyu ve kök uzunluğunun kontrol grubuna göre en çok sınırlandığı doz olan 300 Gy doz etkili mutasyon dozu olarak belirlenmiştir. Verticillium dahliae'nın yaprak döken (PYDV 6) ve yaprak dökmeyen (NPAE Vd11) patotiplerinden elde edilen kültür filtratlarının üç farklı dozu (% 25, % 50, % 75) kallus ortamlarına ilave edilmiştir. Kallusların hastalık etmenine karşı duyarlılıkları belirlenmiştir. Kültür filtratı uygulamalarının kallus üzerindeki etkisi incelendiğinde, denemenin 28. gününde kontrol gruplarına göre patotipler arasında en fazla antosiyanin ve kahverengi kallus oluşumuna sebep olan fungal kültür filtratı ve dozunun PYDV6 %75 olduğu ve aynı dozda kallus ağırlığının azaldığı görülmüştür. PYDV6 patotipine ait %75 dozda kültür filtratı uygulamasının her iki pamuk çeşidinde protein, klorofil, hidrojen peroksit, katalaz ve peroksidaz miktarları üzerindeki etkisi incelenmiştir. Mutasyon uygulaması olan ve olmayan gruplarda klorofil a, klorofil b, total klorofil, total karotenoid miktarlarının kültür filtratı uygulaması ile birlikte azaldığı ve çeşitler arasında en çok Carmen çeşidinin etkilendiği belirlenmiştir. Mutasyon uygulaması olmayan gruplarda kültür filtratı uygulaması ile birlikte Carmen çeşidinde katalaz miktarı %138, mutasyon uygulamasında ise % 165 artış göstermiştir. NP Özbek 100 çeşidinde ise aynı gruplarda katalaz miktarı sırası ile % 34 ve % 48 azalmıştır. Mutasyon uygulaması olmayan gruplarda kültür filtratı uygulaması ile birlikte Carmen çeşidinde peroksidaz miktarı 8 kat, NP Özbek-100 çeşidinde ise 4 kat daha fazla artış göstermiştir. Mutasyon uygulanan gruplarda ise aynı çeşitler için bu oran sırası ile 2.5 ve 2 kat olarak gözlenmiştir.
Vigna caracalla L. Verdc. bitkisinin in vitro klonal mikroçoğaltımı
Bu çalışmanın amacı, Vigna caracalla L. Verdc. bitkisinde tohum kökenli in vitro klonal mikroçoğaltım için gerekli tüm basamakları gerçekleştirmek ve etkili bir protokol oluşturmaktır. Ticari bir firmadan temin edilen tohumlar, farklı sterilizasyon yöntemlerine maruz bırakıldıktan sonra çatlatılarak MS besin ortamlarında kültüre alınmışlardır. En yüksek sterilizasyon başarı yüzdesi (%93.33) ve en yüksek çimlenme yüzdesi (%93.33); 1 dk %70 etil alkol, 4dk %0.1 HgCl2 uygulamasının ardından 7 saat suda bekletilen tohumlarda elde edilmiştir. Farklı besin ortamları ve kültür kaplarında kültüre alınan tohumlardan, en yüksek çimlenme yüzdesi (%95.24), N6 besin ortamı ve 250 mL'lik Erlenmeyer şişe kombinasyonunda belirlenmiştir. Gelrite ile katılaştırılmış MS besin ortamı içeren cam tüplerde kültüre alınan tohumlarda agara gore daha yüksek çimlenme yüzdesi (%85.71) saptanmıştır. Işık şiddetinin çimlenmeye etkisinin belirlenmesi amacıyla farklı ışık şiddetlerinde WPM besin ortamında kültüre alınan tohumlarda, 3500 lüks ışık şiddetinde daha yüksek çimlenme yüzdesi (%80.00) tespit edilmiştir. In vitro fideciklere ait sürgün ucu ve nod eksplantları, gelrite içeren MS, WPM ve N6 temelli besin ortamlarında sürgün rejenerasyonu için kültüre alındıklarında, en yüksek çoğaltım katsayısı (1.62), WPM besin ortamında kültüre alınan sürgün ucu eksplantlarından elde edilmiştir. Bitki büyüme düzenleyicilerinin ve eksplant tipinin sürgün rejenerasyonuna etkisinin belirlenmesi amacıyla yapılan denemelerde, en yüksek çoğaltım katsayısı (1,48) 1IBA+0,5BAP ile desteklenen MS besin ortamında (HS4) kültüre alınan sürgün ucu eksplantlarından elde edilmiştir. Jelleştirici ajan, ışık şiddeti ve eksplant tipinin sürgün rejenerasyonuna etkisinin belirlenmesi için yapılan denemelerde ise en yüksek çoğaltım katsayısı (1.71), Duchefa agar ile katılaştırılmış N6 (N-21) besin ortamında 4200 lüks ışık şiddetine maruz bırakılan nod eksplantlarından elde edilmiştir. Bu çalışma kapsamında, fazla hiperhidrisite göstermeyen ve çoğaltım oranı daha yüksek olan 16 adet klonun mikroçoğaltım denemelerinde uygun reaksiyon verdiği belirlenmiştir. En yüksek kök rejenerasyonu (%85.71), Fluka agar ile katılaştırılmış N6 besin ortamındaki (N-26) 4200 lüks ışık şiddetine maruz bırakılan sürgün eksplantlarında saptanmıştır. Köklü sürgünler, %70 başarı yüzdesi ile aklimatize edilmişlerdir.
In vitro production and flowering of some orchid species for commercial-scale realization
In this study, commercial production protocols were established for Cattleya sp. moreover, in vivo plantlet surface sterilization and in vitro regeneration protocols were also established for Vanda sp. Valuable data about in vitro flower-triggering of Cattleya sp. shoots were obtained. Surface sterilization rate of in vivo shoots of Cattleya sp. were found 100% and 83,33% in root and stem explants, respectively. Regeneration rate was 10,05 in thin layers excised from the Cattleya sp. shoots by the technique of TCL. In the study of multiplacation of PLB from PLB, the highest proliferation rate were found as 7,50, 1,56 and 111,85 in semi-solid cultures, flask liquid cultures and RITA® bioreactors, respectively. In the study of shoot regeneration from PLB, shoot regeneration rate was determined as 13,00 in semi-solid cultures, regeneration formation rate were found 0,67 and 199,90 in flask liquid cultures and RITA® bioreactors, respectively. In Cattleya sp., shoot proliferation rate was 3,5 and root formation number per shoot was 7,34. In adaptation of in vitro rooted Cattleya shoots to ex vitro conditions, acclimatization was succeeded at 92,89%. In order to trigger in vitro flowering of Cattleya sp., shoots were cultivated in different media compositions, photoperiods, day/night temperatures and pseudobulb arose at 6,67% ratio. Surface sterilization rate of roots, leaves, stems and flower parts in Vanda orchids were succeeded at 95.83%, 80%, 71,67% and 70%, respectively. Moreover, 61,90% callus formation has been observed on anthers taken from the flowery parts of the plant and 1,11 regeneration ratio has been obtained on stem explants.
Vanilya (Vanilla planifolia L.) bitkisinde in vitro rejenerasyonların sağlanması ve hücre süspansiyonlarında metil jasmonat elisitörünün biyokütle üretimine etkileri
Vanilya, dünya piyasalarında yüksek fiyatla satılan ve çok talep gören bir üründür. Doğal vanilya yüksek ekonomik değere sahiptir ve safranın ardından dünyanın ikinci en pahalı baharatlarından biridir. Ekonomik değerine rağmen, diğer orkide türleri arasında vanilya bitkisi, üzerinde, en az çalışılanlardan biri olmuştur (Arenas and Dressler, 2010). Vanilyanın sentetik formu (vanilin), başlangıç maddeleri (koniferin, guaiakol, öjenol ve lignin) kullanılarak çeşitli kimyasal yöntemler ile fabrikalarda elde edilebilmektedir, ancak vanilya aroması doğal olarak sadece vanilya meyvesinden sağlanabilmektedir (Rao and Ravishankar, 2000). Türkiye'nin bazı bölgeleri vanilya bitkisini yetiştirmek için uygun iklime sahip olmasına rağmen, bu bitki Türkiye'de yetiştirilmemektedir. Bu nedenle tez çalışmasında vanilya bitkisinin in vitro koşullarda rejenerasyonuna yönelik araştırmalar gerçekleştirilmiştir. Tez çalışmasında, olgunlaşmış Vanilla planifolia'nın tohumları, genç yaprakları, nod ve havai kök eksplantları başlangıç materyali olarak kullanılmıştır. Çalışmada nod eksplantlarından en yüksek kallus rejenerasyonu (%80) VK4 besin ortamında (MS+1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L BAP) elde edilirken, VK3 (MS+1 mg/L 2,4-D + 0,5 mg/L BAP) ve VK6 (MS+1 mg/L BAP + 0,5 mg/L NAA) besin ortamlarında ise %100 oranında doğrudan sürgün rejenerasyonları sağlanmıştır. Ayrıca VK6 ortamında %50 oranında köklenme yüzdesi elde edilmiştir. VK2 (MS+1 mg/L 2,4-D + 0,5 mg/L KIN) ortamında dolaylı sürgün rejenerasyon oranı %33,3 olarak belirlenirken, VK4 ortamında ise %71,4 oranında dolaylı embriyo oluşumları saptanmıştır. Araştırmada tüm embriyolar globuler aşamada kalmıştır. Tohum ve diğer eksplantlardan elde edilen 0,5 g yaş ağırlıktaki kalluslar, en başarılı kallus rejenerasyonunun sağlandığı sıvı besin ortamı içerisinde kültüre alınmıştır (karıştırma hızı: 100 rpm; inkübasyon sıcaklığı:24±2°C). Kültürler karanlıkta tutulmuştur. Kurulan hücre süspansiyon kültürlerinde büyüme parametreleri belirlenmiştir. 0, 7, 14, 21 ve 42. günlerde gerçekleştirilen analizler sonucunda MeJa uygulamalarında en yüksek yaş ve kuru ağırlık değerleri (0,0519 g/ml; 0,0104 g/ml) 100 µM MeJa uygulamasıyla 21. günde elde edilmiştir. Kültürün 6. haftasında hücre süspansiyon kültürlerinde globuler embriyo oluşumları görülmüş ve en yüksek kuru biyokütle oranına (%30,8) 100 µM MeJa uygulamasında ulaşılmıştır. Anahtar sözcükler: Vanilya, Vanilla planifolia L., In Vitro, Hücre Süspansiyon Kültürü, Metil Jasmonat
Bacopa australis'in in vitro koşullarda mikroçoğaltımı
Bu tez kapsamında; Bacopa australis bitkisinde farklı büyüme düzenleyicileri (BBD) içeren besin ortamlarının, kültür tiplerinin, farklı substratlar içeren çeşitli hacimlere sahip kültür kaplarının in vitro koşullarda kitlesel çoğaltımdaki rollerinin değerlendirilmesi amacıyla, hızlı ve ekonomik bir mikroçoğaltım prosedürünün belirlenmesi üzerine çalışmalar yapılmıştır. Araştırmamızda; B. australis bitkisine ait nod parçaları mikroçoğaltım için eksplant kaynağı olarak kullanılmıştır. Çalışmanın ilk aşaması; BAP, IBA ve NAA bitki büyüme düzenleyicilerini (BBD) içeren yarı katı MS besin ortamlarında yapılmıştır. Uygulanan besin ortamlarına göre en başarılı sonuçlar; 3 mg/l BAP ve 1 mg/l IBA bitki büyüme düzenleyicilerini içeren agarla katılaştırılmış yarı katı MS besin ortamında, ortalama sürgün sayısı 17.71 adet/eksplant ve sürgün uzunluğu 5.53 cm/eksplant olarak tespit edilmiştir. İkinci aşamada ise, eksplantların dört farklı substrata karşı verdiği tepkiler araştırılmış ve agar ile katılaştırılmış besin ortamındaki eksplantların diğer substratlara göre sürgün sayısı ile sürgün uzunluğu açısından daha iyi olduğu saptanmıştır. Üçüncü aşama ise, eksplantların kültür tiplerine verdiği cevapları incelemek olmuş ve çift fazlı kültür sistemi, çoklu sürgünlerin oluşumundan tam bitkinin eldesine kadar geçen süreyi yarı yarıya kısaltması ve daha ekonomik bir seçenek olmasıyla bir adım öne çıkmıştır. Bu sistemde elde edilen en yüksek sürgün sayısı 13.63 adet/eksplant ve kök sayısı 18.52 adet/eksplant olarak tespit edilmiştir. Dördüncü aşamada eksplantların farklı kültür kaplarına tepkileri araştırılmış ve sürgün kültürleri için en yüksek değerlerin elde edildiği kültür kabı tipinin Vitrovent olduğu belirlenmiştir. Son aşamada ise, in vitro kültürlerden elde edilen bitkicikler dere kumu içeren akvaryuma aktarılmışlardır. Aklimatizasyonun 30. gününde bitkiciklerin canlılık oranlarının %100 olduğu tespit edilmiştir.
Rubia tinctorum L. bitkisinde Agrobacterium rhizogenes aracılığıyla transforme saçaklı kök kütürlerinin oluşturulması ve sekonder metabolit üretimi
Bitkisel sekonder metabolitler tıp, gıda, ziraat gibi çeşitli alanlarda kullanılmaktadır. Bunedenle, son yıllarda özellikle doku kültürü teknikleri ile sekonder metabolitlerin elde edilmesiüzerine yapılan çalışmalar hız kazanmıştır.Bitki büyüme hormonları içermeyen ortamlarda biyokimyasal ve genetik açıdanstabiliteye ve hızlı büyüme yeteneklerine sahip olan saçaklı kök kültürleri, tercih edilebilir enuygun doku kültürü teknikleridir. Agrobacterium rhizogenes, birçok dikotiledon bitkide gentransferi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu bakterinin enfeksiyonu sonucunda, kök teşvikedici plazmidin (Ri plazmid) T-DNA'sı, bitki hücresine aktarılır ve genomik (nükleer) DNA'sınaentegre edilir. Enfeksiyon bölgesinde hızlı çoğalabilen ve çok dallı saçaklı kökler oluşur. Bukökler, bazı sekonder metabolitlerin üretimi için önemli bir potansiyele sahiplerdir.Rubia tinctorum L. ?Kök Boya?, halk arasında boyama özelliğinden dolayı çok eskizamanlardan beri halıcılıkta kullanılan, ayrıca diüretik, antispazmodik, antiskorbütik veantibakteriyel özellikleri nedeniyle tıbbi öneme sahip bir bitkidir. Bu tez çalışmasında Rubiatinctorum L. bitkisinin saçaklı kök kültürleri ve sekonder metabolit içerikleri incelenmiştir.Tohumların yüzeysel sterilizasyonlarından sonra, bitkiciklerin mikroçoğaltımları 0.5 mg/lIBA içeren MS (Murashige ve Skoog, 1962) ortamlarında başarılmıştır. Transformasyonçalışmalarında, bitkiciklerin yaprak ve nod eksplantları Agrobacterium rhizogenes' in 4 farklı ırkı(15834, A4, 8196, R1000 ) ile inokule edilmiştir. En yüksek saçaklı kök oluşumu %61.2oranında 15834 ırkı ile inokule edilen nod eksplantlarında belirlenmiştir. Elde edilen saçaklıkökler MS, B5, SH ortamlarında kültüre alınmışlardır. Özellikle MS ortamından elde edilenkökler altın sarısı renginde iken B5 ortamında üretilen köklerin ise kırmızı renkte oldukları veortam renginin de kırmızıya dönüştüğü gözlenmiştir. SH ortamına ait köklerin ise sarımsı ve inceyapıda oldukları saptanmıştır.Farklı ırklar (A4, 8196, R1000) ile oluşturulan saçaklı kök kültürlerindeki sekondermetabolit miktarları HPLC ile belirlenmiştir. En yüksek antrakinon miktarları R1000 ırkı ile eldeedilen saçaklı köklerde lusidin primeverozit 1.13 mg/g; ruberitrik asit 8.4 mg/g; alizarin 0.072mg/g olarak saptanmıştır.Sekonder metabolit miktarını arttırmak için B5 ortamına elisitör olarak metil jasmonat(0.1µM) ve yüksek sukroz (%12) ilaveleri ile çalışmalar yapılmıştır. Metil jasmonat (MeJA)içermeyen, sukroz ilaveli B5 (B5S) ortamında kuru saçaklı kökte lusidin primeverozit, ruberitrikasit ve alizarin miktarları sırasıyla 13.45 mg/g; 93.2 mg/g; 0.78 mg/g olarak tespit edilmiştir.Metil jasmonat ve 120 gr sukroz içeren B5 (B5SMeJA) ortamında da lusidin primeverozit,ruberitrik asit ve alizarin miktarları sırasıyla 12.31 mg/g, 86.8 mg/g, 0.11 mg/g olarakbelirlenmiştir. Doğadan toplanan kökte ise alizarin dışındaki lusidin primeverozit ve ruberitrik asitmetabolitleri, saçaklı köklere göre daha yüksek miktarlarda bulunmuşlardır.Anahtar Sözcükler:Rubia tinctorum, Agrobacterium rhizogenes, saçaklı kök, sekonder metabolit, alizarin
Pamuk (Gossypium hirsutum L.) anterlerinden in vitro koşullarda kallus ve embriyo rejenerasyonlarının sağlanması
Bu tezde Gossypium hirsutum L. türüne ait 2 farklı çeşitte (Özbek-100 ve Nazilli-143) haploit bitki elde etmek üzere gerçekleştirilen anter kültürlerinde 3 gün süreyle soğuk ön uygulamanın (+4oC'de) ve kültür koşullarının (fotoperiyot ve karanlık) kallus rejenerasyonu ve embriyogenez üzerindeki etkileri incelenmiştir. Çalışma kapsamında Özbek-100 ve Nazilli-143 pamuk çeşitlerine ait uygun dönemde mikrosporları bulunduran anterlerin farklı besin ortamlarında ve kültür koşullarında gelişimleri incelenmiş, 1 mg/L BA ve 1 mg/L NAA içeren MS besin ortamında en yüksek kallus ve embriyo rejenerasyonları belirlenmiştir. Özbek-100 çeşidinde karanlık kültür koşulunda (%95) fotoperiyot kültür koşuluna (%75) göre daha yüksek oranda kallus rejenerasyonu gözlenirken, ön uygulamanın %100 oranında kallus rejenerasyonu sağladığı belirlenmiştir. Nazilli-143 çeşidinde ise ön uygulamanın kallus rejenerasyonu üzerinde etkisi bulunmazken, karanlık koşulda %100 kallus rejenerasyonu gerçekleşmiştir. Embriyo rejenerasyonları açısından ise Özbek-100 çeşidinde ön uygulamanın gerçekleştirilmesi rejenerasyon oranını %24'ten %48'e yükseltirken, kültür koşullarının rejenerasyon üzerinde olumsuz etkisinin olduğu belirlenmiştir. Karanlık kültür koşulunda %31,67 oranında embriyo rejenerasyonu gerçekleşirken, fotoperiyot koşullarında embriyo gözlenmemiştir. Nazilli-143 çeşidinde ise ön uygulama embriyo rejenerasyonu üzerinde hiçbir etki göstermezken, sadece fotoperiyot koşulunda %25,33 oranında embriyo rejenerasyonu elde edilmiştir. Elde edilen bu bilgiler ile pamuk bitkisinde in vitro koşullarda anter kültürü ile ilgili şimdiye kadar gerçekleştirilen çalışmalara göre daha hızlı ve daha başarılı olarak kallus ve embriyo rejenerasyonunu sağlayan yeni bir protokol geliştirilmiştir.
Myrobolan b erik kök anacının (Prunus cerasifera L.) sıvı kültürlerde büyük ölçekte mikroçoğaltımı
Bu çalışma kapsamında kök boğazı çürüklüğüne dayanıklı, kuvvetli bir erik kök anacı olan ve geleneksel yöntemlerle köklendirilmesinde problem olan, ekonomik olarak önemli Myrobolan B (Prunus cerasifera L.) çeşidinin sıvı kültürlerde büyük ölçekte mikroçoğaltımları amaçlanmıştır. Yarı katı besin ortamında kültüre alınan Myrobolan B, erik kök anaçlarına ait nodal eksplantlardan elde edilen sürgünler, içinde 30 g/l şeker, 0.7 mg/l BAP ve 0.01 mg/l NAA içeren MS besin ortamı bulunan RITA biyoreaktörlerde üretim parametrelerinin optimizasyonu çalışmalarında kullanılmıştır. RITA biyoreaktörlerde yapılan çalışmalarda optimum inokulasyon yoğunluğu 6 adet eksplant, daldırma süresi 1 sa: 20 sn; altkültür süresi 40 gün, besin ortamı miktarı 250 ml, ışık şiddeti 3000 lüks olarak belirlenmiş olup optimum koşullarda çoğaltma katsayısı 7.33, eksplant başına ortalama sürgün sayısı 14.68 ve vitrifikasyon oranı %8.33 bulunmuştur. RITA biyoreaktörlerde üretilen çoklu mikrosürgünlerden elde edilen tek sürgünlerde %91.67 oranında köklenme başarısı elde edilmiştir. Ardından serada torf:perlit (4:1) ortamına alınan köklü bitkiciklerin %91.11'i dış koşullara adapte edilmiştir. RITA biyoreaktörlerde küçük ölçekte yapılan sıvı kültürlerde üretim modelinin büyük ölçek uygulamalarının gerçekleştirilmesi amacıyla 5 l'lik balon tip geçici daldırma biyoreaktör tasarımı gerçekleştirilmiştir. RITA biyoreaktörler için optimum koşullarda biyoreaktörde kültüre alınan 2-3 sürgünlü Myrobolan B eksplantlarında çoğaltma katsayısı (5.83), ortalama sürgün sayısı (11.7) ve vitrifikasyon yüzdesi (%25) gibi önemli üretim parametreleri belirlenmiştir. Balon tip geçici daldırma biyoreaktörde çoğaltılan mikrosürgünlerin in vitro köklendirme oranları (%98.33) ve aklimatizasyon oranları (%91.11) RITA biyoreaktörlerden elde edilen sonuçlar ile benzer bulunmuştur. Mikroçoğaltım parametreleri açısından değerlendirildiğinde çoğaltma katsayısı, ortalama sürgün sayısı ve düşük vitrifikasyon oranları bakımından RITA biyoreaktörlerin daha avantajlı oldukları saptanmıştır.
Ters lale (Fritillaria imperialis L.) bitkisinde ın vitro koşullarda organ rejenerasyonlarının sağlanması
Liliaceae familyasından Fritillaria cinsine bağlı olan ters lale (Fritillaria imperialis L.), ülkemizde yarı endemik olarak yetişen bir türdür. F. imperialis, çok uzun zamandır bahçe süs bitkisi olarak kullanıldığından başta Hollanda olmak üzere Avrupa'ya ihraç edilmektedir ve doğadan sökümü yasaktır. Bu tez çalışmasında, vejetatif ve generatif çoğaltım işlemlerinde pek çok kısıt barındıran F. imperialis türünün, çeşitli in vitro besin ortamlarında ve farklı kültür koşullarında doku kültürü teknikleri ile çoğaltımı hedeflenmiştir. Bu amaçla, F. imperialis L. bitkisinden alınan çeşitli eksplantlardan (soğan, yaprak, gövde, kök), in vitro koşullarda organ rejenerasyonlarının gerçekleştirilmesine çalışılmıştır. Sürgünler üzerindeki yeşil yaprak ekplantları için en yüksek kallus gelişim oranı (%59.26) 1.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l NAA + 0.4 mg/l IAA ile 60 g/l sükroz içeren B5 besin ortamında, petal yaprak eksplantlarında ise (%33.33) aynı içeriğe sahip MS besin ortamında tespit edilmiştir. Yeşil yaprak eksplantları ile yapılan çalışmalarda; MS temelli besin ortamlarında rejenere olan kallusların, B5 temelli besin ortamında rejenere olanlara göre hem somatik embriyo (sırasıyla en yüksek embriyogenik kallus oranları %92.31 ve %56.25), hem de sürgün rejenerasyonuna yönelme bakımından (sırasıyla en yüksek sürgün oluşturan kallus oranları %88.89 ve 37.50) daha uygun oldukları kaydedilmiştir. Bu ortamlar arasında ise oksinlerin 0.5 mg/l NAA + 0.4 mg/l IAA), yüksek dozda BAP (1.0 mg/l) ile kombine edildikleri MS ve B5 besin ortamlarında sürgün oluşturan kallus oranları (sırasıyla %88.89 ve %37.50), daha düşük BAP (0.1 mg/l) konsantrasyonunda gelişenlere (sırasıyla %53.85 ve %16.67) göre daha başarılı bulunmuşlardır. Başlangıç materyali olarak yeşil yaprak eksplantlarının kullanıldığı çalışmalarda, dolaylı organogenez bakımından oksinlerle birlikte besin ortamına eklenen BAP sitokinini sürgün rejenerasyonunda, Kin veya TDZ sitokininleri ise genellikle kallus uyarımında daha etkili bulunmuşlardır. F. imperialis türünde, depolama süresince soğanlar üzerinde kendiliğinden gelişen köklerin ilk defa başlangıç materyali olarak kullanıldığı ve 1.0 mg/l NAA + 2.0 mg/l 2,4-D içeren MS besin ortamının ele alındığı denemelerde ise kallus rejenerasyonu bakımından 16 saat aydınlık/8 saat karanlık fotoperiyot koşullarının (%33.33), karanlık koşullara göre daha elverişli olduğu ortaya konulmuştur. Yeşil yaprak eksplantları altkültüre alındıktan 6 hafta sonra toplamda 146 adet olmak üzere yeşil yaprak eksplantı başına 1.35 adet sürgün rejenere olmuştur. Kültürde 36 hafta boyunca altkültüre alınmadan inkübe edilen yeşil yaprak eksplantlarından gelişen kalluslar üzerinde toplamda 62 adet soğancık rejenerasyonu gerçekleşirken, petal yapraklarının eksplant kaynağı olduğu denemeler sonucunda ise soğancık gelişimi gözlenmemiştir. 36 haftalık kültür periyodu sonunda yeşil yaprak eksplantı başına 1.89 adet soğancık (FS7: B5 + 1.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l NAA + 0.4 mg/l IAA besin ortamında) elde edilmiştir.
Maxma 14 Delbard® Brokforest (Prunus mahaleb x Prunus avium) kiraz meyve anacının klonal çoğaltımı ve iki yeni biyoreaktör sisteminde geniş ölçekli üretimi
Yeni biyoreaktör sistemlerinin tasarımı yoluyla mikroçoğaltımın otomasyonu, ticarileşme ve üretim maliyetlerinin düşürülmesi açısından çok önemlidir. Bu çalışmada, Maxma 14 Delbard® Brokforest (Prunus mahaleb x Prunus avium) kiraz meyve anacının klonal çoğaltımı için iki farklı biyoreaktör tasarlanmıştır. Bu reaktörlerden biri geçici daldırma prensibi ile çalışan raflı biyoreaktör, diğeri ise geçici yağmurlama prensibine dayanan biyoreaktördür. Bu amaçla Maxma 14 Delbard® Brokforest kiraz anaçlarını kültüre almak için öncelikle farklı konsantrasyonlarda BAP (6-Benzylaminopurin), IBA (Indole-3-butyric acid) ve NAA (1-Naphthaleneacetic acid) içeren MS (Murashige and Skoog, 1962) ve WPM (Lloyd & McCown, 1980) yarı katı ortamları Algen Tarım ve Gıda San. Tic. Ltd. Şti. firmasında kullanılan yarı katı ticari ortamla kıyaslanmışlardır. Ticari ortam en yüksek sağlıklı çoklu sürgün oluşum oranını (%100) gösterdiği için biyoreaktör çalışmalarında sıvı besin ortamı olarak agarsız ticari ortam kullanılmıştır. Biyoreaktörlerde sürgün çoğaltım işlemi gerçekleştirildikten sonra elde edilen sürgünler ex vitro ortamlarda köklendirilmişlerdir. Geçici daldırma prensibi ile çalışan raflı biyoreaktörde sürgün çoğaltımında 5,03 çoğaltım katsayısı sağlanmıştır ve elde edilen sürgünler %73,12 oranında köklendirilerek aklimatize edilmiştir. Geçici yağmurlama prensibi ile çalışan biyoreaktörde ise 7,29 çoğaltım katsayısı sağlanırken elde edilen sürgünlerin %93,22'si köklendirilerek aklimatize edilmişlerdir.
Afrika menekşesi (Saintpaulia ionantha) bitkisinde protoplast izolasyonu, füzyonu ve rejenerasyonların sağlanması
Bu çalışmada in vivo ve in vitro koşullarda yetiştirilmiş mor ve beyaz çiçekli Afrika menekşelerin yapraklarından protoplast izolasyonu ve füzyonu gerçekleştirilmiştir. Aynı zamanda in vitro koşullarda mikroçoğaltım protokolü de elde edilmiştir. Yüzey sterilizasyon denemeleri sonucunda, yaprak eksplantlarında STK2 sterilizasyon yöntemiyle, %94.7 oranında sterilizasyon başarısı sağlanmıştır. Bu sterilize edilen yaprak eksplantlarından direkt sürgün rejenerasyonu %100'lük bir başarı ile 2mg/L BAP ve 1mg/L NAA içerikli MS (Murashige ve Skoog, 1962) besin ortamında elde edilmiştir. Sürgünler, 8 haftalık kültür süresinin ardından MS ortamında %100 olarak başarılı şekilde köklendirilmişlerdir. Köklendirilen bu bitkiler torf/perlit (1:2) karışımına aktarılarak başarılı olarak aklimatize edilmişlerdir. In vivo ve in vitro koşullardaki mor ve beyaz çiçekli Afrika menekşelerinin yapraklarından gerçekleştirilen protoplast izolasyon denemelerinde en iyi sonuç, in vivo koşullardan alınan yapraklardan, ön uygulamasız 16 saat boyunca karanlık koşullarda, %1 Pektinaz, %2 Selülaz ve %2 Hemiselülaz içerikli enzim karışımı içerisindeki inkübasyon sonucunda mor çiçekli menekşeden 130x103 olarak elde edilmiştir. İzole edilen protoplastlardan, en yüksek mikrokallus rejenerasyonu, in vivo kökenli protoplastlardan (50 adet mikrokallus/10mL) mikrokallus oluşumu gerçekleşmiştir. In vivo ve in vitro koşullardaki mor ve beyaz çiçekli Afrika menekşelerinin yapraklarından izole edilen protoplastlar, PEG füzyonu öncesinde Höechst 333422 floresan boyasıyla boyanmışlardır. Bu füzyon sonucunda, PEG 8000'de 397 çoklu füzyon sayısı ve PEG 6000'de 69 ikili füzyon sayısı in vivo kökenli protoplastlarda gözlenmiştir.
Bazı kivi (Actinidia deliciosa) çeşitlerinde karbondioksit beslemesinin ex vitro köklendirme üzerine etkileri
Bu projede, yüksek ticari değere sahip kivi (Actinidia deliciosa) çeşitlerinde, karbondioksit beslemesinin ex vitro köklendirme üzerine etkileri incelenmiştir. Çalışmada, yüksek ticari öneme sahip dişi kivi çeşidi olan "Hayward" ile bu çeşidin tozlayıcısı olan erkek "Matua" kivi çeşitlerinden henüz uyanmamış olan gözler içeren çeliklerden izole edilen birkaç yaprak taslaklı meristemlerin, yarı katı besin ortamlarında rejenerasyonu ve elde edilen sürgünlerin in vitro çoğaltımı gerçekleştirilmiştir. İzolasyon için denenen farklı besin ortamları arasında en iyi sonuç; 1.5 mg/L BAP, 0.3 mg/L askorbik asit ve 30 g/L sükroz içeren MS ortamında elde edilmiştir. Sürgün gelişimi için denenen farklı besin ortamları arasından ise en iyi bulgu, 0.5 mg/L zeatin içeren MS besin ortamından sağlanmıştır. İzolasyon, sürgün oluşumu ve sürgün gelişimi çalışmaları sürecinde, rejenerasyon yüzdesi, sürgün sayısı, sürgün boyu, yaprak sayısı, çoğaltım katsayısı, vitrifikasyon yüzdesi, morfofizyolojik bozukluk durumu parametreleri incelenmiştir. Elde edilen sürgünlerin in vitro köklendirilmesi ve aklimatizasyonu aşamasındaki kısıtların aşılması/azaltılması amacıyla, karbondioksit beslemeli ortamda fotoototrofik ex vitro köklendirilmesinin küçük ölçek (kültür kabı) ve büyük ölçek (sera) çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Ex vitro köklendirme aşamasında yaşama yüzdesi, köklenme süresi, köklenme yüzdesi, sürgün uzunluğu, yaprak sayısı, gövde kalınlığı ve internod aralığı incelenmiştir. Projede in vitro köklenme yapılmadığı için 15 gün ve ex vitro köklendirmenin de sera koşullarında 800 ppm karbondioksit beslemesi ile teşvik edilmesi ile de 10 gün olmak üzere, in vitro köklendirme ve aklimatizasyon prosedür toplam süresinin yaklaşık 25 gün kısaltılması sağlanmıştır.