Theses supervised by Prof. Dr. Mehmet İnan
12 theses · Akdeniz University
Pichia pastoris mayası ile rekombinant ksilanaz enzim üretiminin optimizasyonu
Son yıllarda, ksilanazların çok farklı endüstüriyel alanlarda kullanılmasının yanında, hayvan yemlerinin formülasyonuna giren önemli bir bileşim unsuru olduğu görülmektedir. Günümüzde endüstriyel kullanımı olan enzim preparatları için en önemli konu enzim üretim maliyetinin ve buna bağlı olarak da prosese girdi maliyetinin düşürülmesidir. Ksilanazın da aralarında bulunduğu alfa amilaz, selülaz, pektinaz, proteazlar, lipazlar gibi enzimlerin üretimi üzerine sürdürülen araştırmalar, uygun bir üretici mikroorganizmanın bulunması ve aynı zamanda ucuz ve bol bulunabilen kaynaklardan oluşan bir üretim ortamı kompozisyonun oluşturulması yönünde devam etmektedir. Enzim üretim prosesine ilişkin diğer problemler önemli ölçüde aşılmıştır. Ksilanaz enzimi bakteri, maya ve fungus grubunda yer alan çeşitli mikroorganizmalar tarafından üretilebilmektedir. Bu çalışma üç bölümden oluşmaktadır. İlk bölümde ksilanaz enziminin rekombinant ve ekstraselüler olarak dört farklı sinyal protein, HSA(İnsan serum albumin), PIR(Protein with Internal Repeats), PHO(Asit fosfotaz) ve α-mating faktör, kullanılarak P. pastoris te üretimi yapılmıştır. Bu bölüm sonucunda hepsinde üretim görülmüştür. İkinci bölümde üretim verimler karşılaştırılmış ve verimin en yüksek olduğu sinyal protein belirlenmiştir. Bu bölüm sonucunda, HSA 4147 U/ml, PIR 5366 U/ml, PHO 4252 U/ml ve α-mating faktör 4247 U/ml enzim ürettiği belirlenmiştir. En yüksek üretimin PIR sinyal proteininde olduğu görülmüştür. Üçüncü bölümde ise üretilen enzim saflaştırılmış ve enzimin optimum çalışma sıcaklığı ve pH sı belirlenmiştir. Sonuç olarak, Pichia pastoris mayası ile ksilanaz üretimi gerçekleştirilmiş ve en uygun sekresyon sinyalinin PIR olduğu belirlenmiştir. Ksilanaz enziminin sonundaki polihistidin kuyruğu uzaklaştırıldığında fırıncılık ürünlerinde ve hayvan yemlerinde kullanılma imkanı bulunmaktadır. ANAHTAR KELİMELER: Pichia pastoris, ksilanaz, HSA(İnsan serum albumin), PIR(Protein with Internal Repeats), PHO(Asit fosfotaz), α-mating faktör
Pichia pastoris mayasında rekombinant tibet öküzü kimozini ekspresyonu ve karakterizasyonu
Kimozin peynir endüstrisinde kullanılan ve sütün pıhtılaşmasını sağlayan proteolitik bir enzimdir. Kimozin yeni doğmuş geviş getiren memeli hayvanların midesinin dördüncü bölgesi olan şirdenden (abomasum) elde edilir. Ancak bu şekilde elde edilen kimozin, endüstrinin talebini karşılayacak nicelikte ve nitelikte değildir. Bu sebeple rekombinant DNA tekonolojisi kullanılarak üretilen kimozin, süt ürünleri endüstrisi için alternatif bir yöntem olmuştur. Günümüzde, rekombinant olarak daha yüksek miktarlarda kimozin üretilebilmektedir. Rekombinant kimozin üretiminde gen kaynağı olarak sığır, deve, keçi, manda gibi hayvanlar kullanılmıştır. Bu projede gen kaynağı olarak ilk kez Tibet öküzü (Bos grunniens) kullanılarak Pichia pastoris mayasında rekombinant kimozin üretimi gerçekleştirilmiştir. α–MF (Saccharomyces cerevisiae α-eşleşmesi faktörü), HSA (İnsan serum albümini), PIR1 (P. pastoris Protein with Internal Repeats) ve PHO1 (P. pastoris asit fosfataz) sekresyon sinyallerini taşıyan ekspresyon kasetleri oluşturulmuş ve farklı sekresyon sinyallerinin üretim üzerindeki etkilerine bakılmıştır. Engelli erlende yapılan ön çalışmalar sonrasında, α-MF sekresyon sinyali taşıyan ekspresyon kaseti ile fermentör koşullarında AOX1 kullanılarak rekombinant kimozin üretilmiştir. Tibet öküzü kimozinin kısmi karakterizasyonu yapılmıştır. Böylece literatüre, ilk kez Tibet öküzünün gen kaynağı olarak kullanıldığı rekombinant kimozin enzimi ile ilgili katkıda bulunulmuştur.
Rekombinant kimozin üretiminde glikozilasyonun etkisinin araştırılması
Kimozin enzimi peynir üretim endüstrisinde en kompleks işlem olan sütün pıhtılaştırması amacıyla kullanılan bir aspartik proteazdır. Rennet ya da rennin olarak bilinen kimozin geviş getiren hayvanların dördüncü bölümünden (şirden) elde edilir. Kimozin, sütün yaklaşık %80'ini oluşturan kazein proteininin Phe105 ve Met106 arasında bulunan peptit bağını kırarak, stabil olmayan kazein misellerini oluşturur ve sütün pıhtı oluşturmasını sağlar. Bu kimozin enzimi çeşitli bitkisel, hayvansal ve mikrobiyal kaynaklardan elde edilmektedir. Ancak bu enzimlerin pıhtılaştırma etkileri birbirinden farklı olduğu için ve hayvan kaynaklı kimozin üretiminin düşük olmasından dolayı son yıllarda rekombinant kimozin üretimi artmıştır. Rekombinant DNA teknolojisi ile gerçekleştirilen kimozin üretiminde genel olarak sığır, bufalo, keçi, manda ve deve gibi gen kaynakları kullanılmaktadır. Hayvan, bitki ve mikrobiyal kaynaklı enzimlere göre avantajlarından dolayı bu çalışmada rekombinant tibet öküzü kimozin üretimi yapılmıştır. Çalışmada Tibet öküzü (Bos grunniens) kimozin enzimi (glikozile ve glikozile olmayan formları) metilotrofik bir maya olan Pichia pastoris'te alkol oksidaz I (AOX1) promotoru kontrolü altında üretilmiştir. Kimozin enziminin glikozile (N-glikozilasyon) ve glikozile olmayan formları üretilerek glikozilasyonun rekombinant kimozin üretimine, enzimin aktivitesine ve stabilitesine etkisi araştırılmıştır. Küçük ölçekli erlenlerde yapılan 120 saatlik metanol beslemesi sonucunda glikozile ve glikozile olmayan kimozin üretiminde önemli farklılık gözlenmemiştir. Glikozile kimozin ve glikozile olmayan kimozin için enzim aktiviteleri sırasıyla 55 IMCU/ml ve 61 IMCU/ml olarak hesaplanmıştır. Fermentör ölçekli üretim (5L) gerçekleştirildiğinde ise glikozile ve glikozile olmayan kimozin için enzim aktiviteleri sırasıyla 214.3 IMCU/ml ve 257.14 IMCU/ml olarak hesaplanmıştır.Enzimin optimum çalışma şartları da pH 6 ve 40C olarak tespit edilmiştir. Ticari maya ile rekombinant kimozin enzimleri verimi arasında önemli bir farklılık olmadığı gözlenmiştir. Bu çalışma sonunda peynir endüstrisinde artan kimozin enzimi ihtiyacının karşılanması için enzimin rekombinant olarak üretimine P. pastoris ekspresyon sisteminin oldukça uygun olduğu sonucuna varılmıştır.
Pichia pastoris'te rekombinant laktaz enzimi üretimi
Laktaz enzimi süt şekeri olarak bilinen laktozu katabolik reaksiyonlar ile parçalayarak glikoz ve galaktoz alt monomerlerine dönüştüren bir enzimdir. Diğer adıyla β-galaktosidaz olarak da bilinen laktaz enzimi özellikle gıda sanayisinde laktozsuz süt ve süt ürünleri üretmek amacıyla kullanılmaktadır. Toplumun geniş bir kesiminde bulunan laktoz intoleransı, laktozsuz ürünlere olan talebi artırmaktadır. Dünya nüfusunun yaklaşık %70' ini etkileyen bu hassasiyet, bebeklik döneminden başlayarak yetişkin insanlarda şişkinlik, bağırsak ağrısı, kusma ve ishal gibi gastrointestinal sorunlara neden olmaktadır. Hassasiyeti bulunan kişilerde yaşam konforunu önemli ölçüde etkilediği için günlük diyette gıda takviyesi olarak kullanımı mevcuttur. Günümüzde laktaz enzimi (β- galaktosidaz), endüstriyel ölçekte ağırlıklı olarak mikrobiyal fermantasyon ve rekombinant DNA teknikleri kullanılarak üretilmektedir. Bu üretim yöntemleri, yüksek verim, düşük maliyet ve sürdürülebilirlik gibi avantajlar sunmakta olup, literatür bilgisi veremezsin burada bu çalışma kapsamında enzimin Pichia pastoris (P. pastoris) mayasında etanol ile indüklenebilen mutant ADH2 promotoru kontrolünde rekombinant üretimi yapılmıştır. Çalışma kapsamında, sentetik kodon optimize olarak temin edilen Aspergillus oryzae (A. oryzae) laktaz geni sentetik SNT5 promotoru altına klonlanmış ve oluşturulan pSNT5α-Lac ekspresyon vektörünün P. pastoris MK115(PDI)suşuna transforme edilmiştir. Transformasyon sonrasında elde edilen P. pastoris MK115(PDI)#1 ve #2 klonları ile engelli erlenmayerde üretim ile sıcaklık (20-24-28℃) ve pH (3.0-7.0) optimizasyonu yapılmıştır. Laktaz enzim üretimi için optimum pH ve sıcaklık değeri pH 6 ve 28 ℃ olarak belirlenmiştir. Erlenmayer ölçekli üretimler sonucunda seçilen P. pastoris MK115(PDI) #1 klonu kullanılarak pH 6.0 ve 28℃ koşullarında hücre dışına sekresyon şeklinde yapılan üretimlerde en yüksek enzim aktivitesi 6,800,000 U/mL, en yüksek toplam protein miktarı 512 mg/L olarak tespit edilmiştir. Erlenmayer koşullarında belirlenen optimum sıcaklık ve pH değerlerinde, FM22 besiyeri kullanılarak biyoreaktör ölçeğinde enzim üretimi geçekleştirilmiştir. Yaklaşık 95 saat süren fermantasyon sonucunda süpernatant örneklerinde enzim aktivite değerleri ve toplam protein miktarı sırasıyla 18,400,000 U/mL ve 3177 mg/L şeklinde tespit edilmiştir. Çalışma sonucunda A. oryzae laktaz enziminin etanol ile indüklenebilen SNT5 promotoru altında P. pastoris MK115(PDI) suşunda üretimi yapılmış ve endüstriyel boyutta laktaz üretimi için biyoproses verileri elde edilmiştir
Pichia pastoris'te rekombinant kimozin üretiminin araştırılması
Bu tez çalışması, peynir endüstrisinde sütün pıhtılaştırılması amacıyla kullanılan kimozin enzimini yüksek verimlilikte üreten bir maya klonunun geliştirilmesi ve bazı temel üretim parametrelerinin belirlenmesi amacıyla yapılmıştır. Çalışma kapsamında sığır gen kaynaklı kimozin enziminin Pichia pastoris'te farklı promotorlar kontrolünde, farklı konak hücrelerde rekombinant olarak üretimi gerçekleştirilmiştir. Üretim miktarının arttırılabilmesi amacıyla diploid hücre formlarında, yüksek gen kopyası içeren haploid klonlarda ve şaperon protein overekspresyonu ile enzim üretimi gibi yöntemler denenmiştir. Bu amaçla çalışmanın ilk bölümünde yabanıl tip P. pastoris X33 hücrelerinde yapısal GAP promotoru altında enzim üretimi gerçekleştirilmiştir. Kimozin genini 1 kopya içeren haploid formdaki klon ile erlenmayer ölçeğinde 5.3 IMCU/mL, fermentör ölçeğinde ise 18 IMCU/mL değerlerinde enzim aktivitesi elde edilmiştir. Ancak bu klon ile enzim üretim seviyesi yetersiz kaldığı için verimi arttırabilmek amacıyla diploid formdaki hücreler ile enzim üretimi denenmiştir. Bu amaçla kimozin genini 1 kopya içeren okzotrof GS115(his4) ve JC220(ade1) konakçılarının eşleşme ile diploid formu oluşturulmuş ve bu formunda erlenmayer ölçekli üretimde 3 IMCU/mL enzim aktivitesi tespit edilmiş, fermentör üretimi denenmemiştir. Diploid formdaki bu hücrede haploid X33 hücrelerine göre daha düşük seviyede enzim üretimi görülmüştür. Sanayi boyutlu üretimlerde besleme prosesi açısından (ucuz besin kaynağı olan glukoz ile besleme) kolaylık sağlaması amacıyla çalışmanın bu kısmında yapısal GAP promotoru tercih edilmiş ancak düşük verimlilikten dolayı çalışmanın devamında promotor değişikliği yapılmıştır. Çalışmanın ikinci bölümünde yapısal GAP promotoruna göre daha güçlü olduğu bilinen, etanol ile indüklenen sentetik ADH2SNT5 promotoru kullanılmış, P. pastoris KM71 hücrelerinde enzim üretimi yapılmıştır. Erlenmayer ölçeğinde gerçekleştirilen üretimler sonucu 18 IMCU/mL civarında enzim aktivitesi elde edilmiş, fermentör ölçeğinde ise bu değer 45 IMCU/mL seviyesine ulaşmıştır. Ancak elde edilen bu değerin arttırılabilmesi amacıyla çalışmanın bir sonraki bölümünde kimozin genini yüksek kopya sayıda içeren çoklu kopyalı kimozin klonları oluşturulmuştur. Çoklu kopyalı kimozin klonlarının elde edilmesi amacıyla çalışmanın üçüncü bölümünde in vitro koşullarda sentetik ADH2SNT5 promotoru kontrolünde 4 kopyaya kadar sığır kimozini içeren P. pastoris KM71 klonları oluşturulmuştur. Oluşturulan bu klonlarda erlenmayer ölçeğinde gerçekleşen üretimlerde en yüksek enzim aktivitesi 6.3 IMCU/mL değeri ile 2 kopya kimozin geni içeren klonda tespit edilmiştir. Beklenenin aksine kimozin genini 2 kopya içeren klonda 1 kopyaya göre artış gözlemlenmişken daha yüksek kopyalarda ise azalma görülmüştür. Oluşturulan klonlarda kimozin gen kopya sayısının artması ile üretilen enzim miktarı artsa da enzimin hücre dışına sekresyonunun tam olarak sağlanamadığı düşünülmektedir. Bu amaçla çalışmanın dördüncü bölümünde enzim üretim miktarının arttırılabilmesi amacıyla yüksek kopyalı kimozin klonlarında, PDI şaperon proteininin ekstra 2 gen kopya sayısına kadar overekspresyonu sağlanmış ve protein üretim miktarlarına etkisi incelenmiştir. PDI overekspresyonu ile oluşturulan klonlar arasında erlenmayer ölçeğinde gerçekleştirilen üretimlerde en yüksek enzim aktivitesinin 8.2 IMCU/mL değeri ile 2 kopya kimozin ve 2 kopya PDI içeren klonda tespit edildiği görülmüştür. Bu klonlar ile fermentör ölçekli gerçekleştirilen üretimlerde ise elde edilen enzim aktivite değerleri 2 kopya kimozin içeren klonda 20 IMCU/mL seviyesinde iken 2 kopya kimozin+2 kopya PDI geni içeren klonda 39 IMCU/mL seviyesine ulaşmıştır. PDI overekspresyonu ile aynı klonun enzim aktivite değeri yaklaşık 2 kat arttırılmış olmasına rağmen hedeflenen üretim yakalanamamıştır. Çalışma kapsamında oluşturulan tüm klonlar arasında fermentör ölçeğinde 28°C ve pH 3 şartlarında gerçekleştirilen üretimlerde en yüksek enzim aktivitesi, 45 IMCU/mL değeri ile ikinci bölümde oluşturulan pADH2SNT5HIS4-BtCHY-C#12 (KM71) klonunda tespit edilmiştir. Bu klonda enzim aktivite değerinin arttırılması amacıyla farklı sıcaklık ve pH değerlerinde üretimler yapılmıştır. Denenen farklı sıcaklık ve pH'lar arasında en yüksek enzim aktivitesinin 75 IMCU/mL ile 24°C ve pH 4'te elde edildiği görülmüştür. Bu sebeple en yüksek enzim aktivitesini gösteren bu aday klon ile sanayi boyutlu üretim için fermentör ölçeğinde sıcaklık ve pH gibi bazı parametreleri belirlenmiş olan bir üretim prosesi geliştirilmiştir.
Pichia pastoris'te rekombinant insan dornaz alfa üretimi
Dornaz alfa (rhDNAseI), hücre dışı DNA'nın hidrolizini katalize eden doğada bulunan sayısız nükleazlardan birisidir. Birincil rolü nükleik asitleri parçalamak olan Dornaz alfa pankreas ve tükürük bezleri tarafından salgılanmaktadır. Dornaz alfa ilk olarak 1980'lerin sonunda insan pankreasından klonlanmıştır. DNA'yı seçici bir şekilde parçalayan rekombinant Dornaz alfa, kistik fibrozis (KF) hastalığı tedavisinde kullanılmakta olup viskoz mukusta bulunan DNA'yı hidrolize ederek akciğerlerdeki vizkozitenin azaltılması şeklinde etki mekanizmasını göstermektedir. Bu çalışmada, insan kaynaklı Dornaz alfa enzimi Pichia pastoris mayasında etanol ile indüklenebilen ve güçlü bir ekspresyon seviyesine sahip olan ADH2SNT5 promotoru kontrolü altında rekombinant olarak üreten bir suş geliştirilmiştir. Oluşturulan suşun Dornaz alfa üretim potansiyelinin laboratuvar ölçeğinde araştırılması ve endüstriyel üretime uyarlanabilmesi için ölçek büyütme çalışmaları yapılmıştır. Ayrıca, P. pastoris ekspresyon sistemi kullanılarak Dornaz alfa enziminin ekspresyonu ilk kez bu çalışma kapsamında gerçekleştirilmiştir. Çalışma kapsamında öncelikle, Dornaz alfa enzimini kodlayan gen bölgesi, sentetik ADH2SNT5 promotorunu içeren vektöre klonlanarak pADH2SNT5αDornaz alfa ekspresyon vektörü elde edilmiştir. Hücre dışına sekresyon şeklinde gerçekleştirilen enzim üretiminde konak hücre olarak, PDI şaperon proteinini 4 kopya içeren P. pastoris MK115(PDI) kullanılmıştır. Farklı plazmid kopyası içeren klonlar farklı zeosin (100-1000 µg/mL) içeren plakalardan elde edilmiştir. Seçilen farklı kopya sayısında Dornaz alfa geni içeren klonlar ile üretim koşulları (28 ˚C sıcaklıkta ve pH 6.0, 225 rpm) BMEY besiyerinde erlenmayer ölçeğinde Dornaz alfa ekspresyonu yapılmıştır. Ekspresyon sonunda, üretim suşu olarak protein üretiminin en yüksek olduğu klon tek kopya gen içeren pADH2SNT5αDornaz alfa (MK115 PDI) #10 seçilmiştir. Daha sonrasında üretim miktarının arttırılabilmesi amacıyla erlenmayer koşullarında farklı sıcaklık ve pH (20-28 ˚C ve 3-7 pH aralığı) denemeleri yapılmıştır. Erlenmayer ölçeğinde gerçekleştirilen 96 saatlik üretim sonunda, tüm üretim şartlarından elde edilen süpernatant örnekleri ile Dornaz alfa enzim aktivite testi yapılmış ve en yüksek verim pH 7.0 ve üretim sıcaklığı 24 ˚C olarak elde edilmiştir. Çalışmanın son aşamasında ise oluşturulan klon ile, erlenmayer ölçeğinde belirlenen bazı parametreler (sıcaklık 24 ˚C ve pH 7.0) kullanılarak minimal (FM22) ve zengin (BMGY) besiyerinde fermentör ölçeğinde üretimler gerçekleştirilerek hızlı performans sıvı kromotografi (FPLC) yöntemi ile histidin etiketli enzimin saflaştırması yapılmıştır. Saflaştırma sonrası enzim aktivite değerleri, FM22 besiyerinde yapılan biyoreaktör üretimi sonucunda, 3525.42 U/ml (13559.32 U/mg) şeklinde bulunmuşken BMGY besiyerinde yapılan üretimde 3325.42 U/ml (15254.23 U/mg) olarak tespit edilmiştir. Çalışmanın ana hedefi, ticari olarak satılan Dornaz alfa enzimine muadil bir ürün geliştirilebilme potansiyelinin araştırılmasıdır. Bu bağlamda, yapılan bu çalışma ve ileride yapılacak olan karakterizasyon çalışmaları ile, memeli ekspresyon sistemi yerine maya hücre platformu kullanılarak ticari ürüne eşdeğer veya daha yüksek verimde bir ürün elde edilme potansiyeli mevcuttur. ANAHTAR KELİMELER: Dornaz alfa, fermantasyon, kistik fibrozis (KF), Pichia pastoris, rekombinant Dornaz alfa üretimi, rhDNAseI, ADH2SNT5 promotoru
Pichia pastoris'te rekombinant bakteriyel alfa amilaz üretimi
Endüstriyel amilazların en önemli ve sık kullanılan formlarından biri olan α-amilazlar; gıda, ilaç, tekstil, deterjan, biyoyakıt üretimi ve kirli suların arıtılması gibi birçok alanda tercih edilen bir biyokatalizördür. α-amilazlar (α-1,4-glukan-glukanohidrolaz, EC 3.2.1.1), nişasta molekülündeki α-(1,4)-glikozidik bağlarının iç kısımlarına etki ederek nişastanın hidrolizini katalizler. Bunun sonucunda α-amilazlar; glikoz, maltoz, maltotrioz ve α-limit dekstrin gibi; α-konformasyonuna sahip monomerleri ve farklı uzunluktaki polimerleri oluştururlar. α-amilazlar birçok bitki, hayvan, bakteri ve mantarda yaygın olarak bulunmaktadır. Ancak kullanım alanlarında duyulan ihtiyaca bağlı olarak; yüksek verimlilikte enzim üretimi ve endüstriyel koşullarda arzu edilen özelliklere sahip α-amilazların eldesi için rekombinant suşlar tercih edilmektedir. Pichia pastoris (Komagataella phaffii) rekombinant protein üretiminde sıklıkla kullanılan metilotrofik bir mayadır. P. pastoris birçok promotora sahip olmasına rağmen, etanol metabolizmasında sorumlu olan ADH2 (alkol dehidrogenaz) promotoru, yüksek ekspresyon seviyesi nedeniyle dikkat çekmektedir. Bu çalışmada, Bacillus subtilis PY22 α-amilaz geni (AmyE); tam uzunluktaki ve olgun formunu kodlayan dizinin, sentetik ADH2 (ADH2SNT5) promotorunu içeren ekspresyon vektörüne ligasyonu gerçekleştirilmiş ve P. pastoris GS115 suşuna klonlanmıştır. Elde edilen klonlardan, gerçek zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonları (GT-PZR) analizi ile tek kopya olduğu belirlenen; P. pastoris GS115-pADH2SNT5α-α-Amilaz-Full Lenght (FL) ve P. pastoris GS115-pADH2SNT5α-α-Amilaz-Mature (MF) üretim klonları olarak seçilmiştir. FL ve MF klonları, engelli erlende, 96 saat boyunca etanol ile indüklenerek rekombinant protein üretimi gerçekleştirilmiştir. FL ve MF klonunun en yüksek α-amilaz aktiviteleri sırasıyla 74.2±0.94 U/ml ve 215±3.18 U/ml olarak hesaplanmıştır. FL ve MF klonlarının üretimi arasında yaklaşık 3 kat fark olması nedeni ile büyük ölçekli üretim için uygun olan klon MF klonu olarak seçilmiştir. MF klonu, 5 L hacimli biyoreaktörde, 28°C, pH 6.0 ve normoksik koşullarda (çözünür oksijen oranı %20), sabit µ (µ: 0.028 sa-1) stratejisine uygun şekilde etanol ile indüklenerek 90 saat süresince α-amilaz üretimi gerçekleştirilmiştir. MF klonunun büyük ölçekli üretimi sonucunda α-amilaz enzimi zamana bağlı olarak artış göstermiş ve en yüksek α-amilaz aktivitesi 90. saatte 2219±52.18 U/ml (1403 U/mg) olarak hesaplanmıştır. Engelli erlen ile biyoreaktör üretimi karşılaştırıldığında α-amilaz enziminin yaklaşık 10 kat arttığı gözlenmiştir. Rekombinant α-amilaz enziminin karakterizasyonu gerçekleştirilmiş ve SDS-PAGE analizi sonucu proteinin moleküler ağırlığının yaklaşık 80 kDa boyutlarında olduğu saptanmıştır. Enzimin optimum çalışma koşulları 60°C sıcaklık ve pH 7.0 olarak belirlenmiştir. α-amilazın, 1 saat süresince farklı sıcaklıklarda inkübe edilmesi sonucunda, 50°C'de %81 ve 60°C'de %65 aktivitenin korunduğu tespit edilmiştir. Enzim aktivitesi 1 saat sonunda pH 6.0-7.5 değerleri arasında %80'nin üzerinde stabil kalmıştır. 10 mM konsantrasyonundaki Ca2+ ve Mg2+ iyonları enzim aktivitesini artırırken, aynı konsantrasyondaki Fe2+, Zn2+ ve Cu2+ iyonları aktiviteyi düşürmüştür. Bu çalışma sonucunda, rekombinant bakteriyel kaynaklı α-amilaz enziminin, P. pastoris ekspresyon sisteminde güçlü ve alternatif olarak kullanılabilecek ADH2 promotorunun kontrolünde, büyük ölçekli üretimde, başarıyla ifade edildiği saptanmıştır.
Pichia pastoris mayasına sığır laktat dehidrogenaz geninin aktarımı ve laktik asit üretimi
Laktik asit gıdadan kozmetiğe, tıptan kimya endüstrisine çok geniş bir alanda kullanım imkanına sahiptir. Laktik asidin, L (+)-laktik asit ve D (-)-laktik asit olmak üzere iki optik izomeri vardır. İzomerlerin saf olarak üretimi sadece fermentasyon yolu ile mümkündür. D (-)-laktik asit insan metabolizmasında asidoz ve kemik erimesine neden olabilmektedir. Ancak L (+)-laktik asit, biyolojik olarak tüketilebilmesi ve ilaç amaçlı kullanılabilmesi bakımından önemlidir. Pichia pastoris, biyoteknoloji ve ilaç endüstrisinde rekombinant protein üretimi için ihtiyaç duyulan bir ekspresyon sistemi olmasıyla birlikte araştırmacılar tarafından da sıklıkla kullanılmaktadır. P. pastoris, bakteriler gibi, tek karbon kaynağı olarak metanol, glukoz, gliserol veya etanol içeren ucuz besiyerlerinde hızla gelişim gösterebilmektedir. Bu tez çalışması kapsamında P. pastoris mayasında L (+)-laktik asit üretimi hedeflenmiştir. Bunun sebebi, bu mayanın şimdiye kadar laktik asit üretiminde kullanılan mikroorganizmalardan çok daha düşük pH'larda gelişme gösterebilmesidir. Ayrıca, L(+)-laktik asidin D(-)-laktik aside göre kullanımı daha yaygındır. Laktik asit üretimi için gen kaynağı olarak sığır (Bos taurus) genomuna ait L-laktat dehidrogenaz geni kullanılmıştır. Çalışmanın ilk aşamasında P. pastoris ΔPDC (pirüvat dekarboksilaz) geni inaktif hale getirilmiştir. Pirüvatı L-laktik aside yükseltgeyecek olan L-laktat dehidrogenaz geni mayaya gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz (GAP) ve pirüvat dekarboksilaz (PDC) promotorlarına bağlı olarak aktarılmıştır. Üretim ön çalışmaları çalkalamalı inkübatörde erlenler ölçeğinde yapılmıştır. Daha sonra, P. pastoris suşlarının L-laktik asit üretim kapasiteleri, kesikli fermentör koşullarında yapılan çalışmada en yüksek X33 pGAP-LDH ve FA115 pPDC-LDH tek kopya suşları tarafından yaklaşık 9,5 g/L (0,19 g/g) olarak gerçekleştirildiği belirlenmiştir. Kesikli beslemeli fermentör çalışmasında ise, L-laktik asit üretimini en yüksek FA115 pPDC-LDH iki kopya suşu 38,0 g/L (0,27 g/g) ile sağlamıştır. Bununla birlikte, ileride yapılabilecek; promotorların yeniden tasarımı, yeni promotorların kullanımı, gen kopya sayısının arttırılması, fermentasyon koşulları optimize edilmesi gibi modifikasyonlarla çok daha yüksek L-laktik asit üretim verimleri elde edilebileceği düşünülmektedir. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, yapılacak olan benzer çalışmalara ışık tutacak niteliktedir.
İşlenmiş sığır eti ürünlerinde çoklu gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (GZ-PZR) yöntemi ile tek tırnaklı hayvan etinin belirlenmesi için metot geliştirilmesi
Et, özellikle esansiyel aminoasitler, zengin vitamin, mineral ve yağ içeriği ile birlikte insan beslenmesindeki en önemli temel gıda maddelerinden birisidir. Dünya nüfusunun giderek artması ile birlikte, gıda maddelerine ve dolayısıyla et ve et ürünlerine olan talep giderek artmaktadır. Dünyada nüfus artışının en hızlı olduğu ülkelerden biri olan Türkiye'de de sağlıklı ve dengeli beslenmenin sağlanabilmesi için kırmızı et tüketimi büyük önem taşımaktadır. Günümüzde et ürünlerinde en sık karşılaşılan problem tağşiş ve orijinalliktir. 2000-2015 yılları arasında Türkiye, İrlanda ve Meksika'yı da kapsayan dünyanın çeşitli bölgelerinde et ürünlerinde yüksek oranda yanlış etiketleme vakaları rapor edilmiştir. Farklı hayvan türlerine ait etler sucuk, salam, sosis ve köfte gibi ürünlere katıldıklarında tüketiciler tarafından algılanması zordur. Etlerin başka etlerle karıştırılıp tüketime sunulması gıda güvenilirliği konusunda halkı endişelendiren konuların başında gelmektedir. Et ürünlerinde kullanılan et türlerinin tanımlaması ve etiketin doğrulanması, ekonomik sebepler, din ve sağlıkla ilgili faktörler ve haksız rekabetin önlenmesi açısından önemlidir. Yapılan bu çalışmada at ve eşek mitochondri sitokrom b (cytb) genine spesifik primerler kullanılarak Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (GZ-PZR) yöntemi ile hem tür tayini hem de miktar analizine olanak sağlayan bir metot geliştirilmiştir. Referans olarak sığır eti içinde bilinen miktarlarda at ve eşek eti bulunan üçlü et karışımları hazırlanmış ve DNA izolasyonları yapılmıştır. DNA dilüsyon serilerinin kalıp olarak kullanıldığı at ve eşek primerleri ile tekli, ikili ve üçlü reaksiyonlar hazırlanmış ve %0,05 ile %50 aralığında yüksek lineer korelasyon değerine ve reaksiyon verimliliğine sahip kalibrasyon eğrileri elde edilmiştir. Ayrıca, at ve eşek eti için önceden doğrulanmış bir metotla analiz edilen 40 adet işlenmiş et örneği, geliştirilen kantifikasyon yöntemi ile yeniden analiz edilmiştir. Örneklerin 15'i at ve eşek eti için pozitif sonuç veren örneklerdir. Nicel yöntem, işlenmiş et ürünlerinde at ve eşek etini % 1-50 seviyesinde belirleyebilmiştir. Sonuçlar, ülkemizde teftişlerin ve güvenilir analiz yöntemlerinin önemini bir kez daha göstermiştir.Elde edilen sonuçlar, ülkemizde denetimlerin ve güvenilir analiz yöntemlerinin ne kadar önemli olduğunu bir kez daha göstermiştir. Sonuç olarak, işlenmiş sığır etine karıştırılması muhtemel at ve eşek etlerinin tespiti için, kolay, hızlı, güvenilir ve kantitatif bir GZ-PZR yöntemi geliştirilmiştir. Ayrıca, yüzde % 0,3 oranında tespit, %1 oranında miktar tayini yapılabildiğinden gerçek bir tağşiş mi yoksa metottan kaynaklı yanlış pozitif sonuç mu olduğu konusunda bu yöntem ile doğru sonuç elde edilebilmektedir.
Pichia pastoris GAP promotoru altında hücre dışı üretilen rekombinant proteinler için yarı-kesikli proses geliştirilmesi
Mikroorganizma kaynaklı biyoteknolojik ürünler için en temel operasyon basamağı üretimin gerçekleştirildiği fermantasyon sürecidir. Fermantasyon, kapalı bir alanda (biyoreaktör) kontrollü bir şekilde gerçekleştirilen hücre gelişimi olarak tanımlanabilir. Biyoreaktör, hücrelerin, çözünmüş oksijen konsantrasyonu (ÇO), pH, redox potansiyeli ve besleme hızı gibi önemli parametrelerin ayarlanabildiği tanımlı bir gelişim ortamında (medya) aseptik olarak çoğalmasını sağlar. Birçok değişkenin rol oynadığı böyle bir proseste değişkenlerin hepsi ayrı bir şekilde optimizasyonun hedefi olabilir. Protein üretiminin gerçekleştirildiği biyoproseslerde genellikle pahalı hammaddeler kullanılır, enerji tüketimi fazladır ve yüksek sermaye yatırımı gerektirir. Bu nedenle üretim sürecinde kaydedilecek en ufak bir gelişme bile toplam üretim maliyetini pozitif yönde etkileyecektir. Pichia pastoris ekspresyon sisteminin kullanıldığı üretimlerde yüksek hücre yoğunluğu ile çalışıldığından çeşitli teknik kısıtlamar ile karşılaşılmaktadır. Bu kısıtlamaların en önemlisi oksijen transferidir. Rekombinant P. pastoris mayasının oksijen kısıtlamasına verdiği tepkilerin sürekli sistemde sistematik analizleri sırasında hipoksik koşulların, spesifik ürün oluşum hızını (qp) 2,5 kat arttırdığı tespit edilmiştir. Bu tespite dayanarak geliştirilen yarı-kesikli hipoksik besleme protokolünde substrat beslemesi, oksijen kısıtlamasında hücrenin oksidatif metabolizmadan oksidofermentatif metabolizmaya geçerek glukozdan ürettiği etanol konsantrasyonuna göre ayarlanır. Bu tez kapsamında, P. pastoris mayasında spesifik gelişim hızının (μ) ve oksijen kısıtlamasının (hipoksia) hücre dışı protein üretimini ve hücrenin gelişim parametrelerini nasıl etkilediği araştırılmıştır. Bu amaçla, ksilanaz enzimini hücre dışı üreten P. pastoris üretim suşu ile aerobik koşullar altında 4 farklı spesifik gelişme hızında (μmax, 0,8μmax, 0,4μmax ve 0,2μmax) ve hipoksik koşullar altında 4 farklı etanol konsantrasyonunda (%1, %0,75, %0,5, %0,25 ethanol) glukoz beslemeli yarı-kesikli fermantasyonlar gerçekleştirilmiştir. Aerobik koşullarda yapılan üretimlerde kontrol parametresi olarak spesifik gelişme hızı (μ), hipoksik koşullarda yapılan üretimlerde ise etanol miktarı (%etOH) seçilmiştir. Üretim boyunca spesifik gelişme hızının belli bir değerde sabit kalması (sabit-μ stratejisi), substratın ortama hücrelerin belirlenen hızda gelişmesini (üstel gelişim) sağlayacak miktarlarda eklenmesi (üstel besleme stratejisi) ile sağlanmıştır. Hipoksik koşullarda gerçekleştirilen üretimlerde ise besleme hızı besiyeri ortamındaki etanol konsantrasyonunu çevrimiçi ölçen bir sensör tarafından otomatik olarak ayarlanarak etanol konsantrasyonunun sabit kalması sağlanmıştır. Gerçekleştirilen fermantasyonlarda hücrelerin gelişim, enzim üretim ve substrat tüketimleri ile ilgili spesifik hızları, verimleri ve katsayıları hesaplanmış, karşılaştırmalı analizleri yapılmıştır.
Pichia pastoris mayasında GAP promotoru altında deve kimozini ekspresyonu
Kimozin rennin olarak adlandırılan bir aspartik proteazdır. Kimozin süt endüstrisinde peynir yapımında kullanılan başlıca enzimdir. Bu enzim memelilerin şirdeninden salgılanır ve sütü pıhtılaştırma özelliği bulunmaktadır. Günümüzde ticari kimozin dört farklı kaynaktan elde edilmektedir. Bunlar hayvansal, bitkisel, mikrobiyal ve rekombinant üretimle elde edilmektedir. Hayvansal kimozini geleneksel olarak sütten kesilmemiş buzağıların abomasumundan elde edilmektedir. Küçük yaşta buzağıların kesilmesi ve dünyada gittikçe artan talep karşısında bu endüstrinin yetersiz kalmasından dolayı, alternatif bitkisel, mikrobiyel ve rekombinant kaynağa yönelim artmıştır. Pichia pastoris rekombinant protein üretiminde çoğunlukla tercih edilen bir eskpresyon sistemidir. Heterolog protein üretiminde P. pastoris mayası yüksek verim elde edilebilmektedir. P. pastoris birçok promotora sahip olmasına rağmen en sık kullanılan AOX1 ve GAP promotorlarıdır. GAP promotoru; P. pastoris gliseraldehit -3 fosfat dehidrojenaz geninin ekspresyonundan sorumlu bölgedir ve yapısal bir promotordur Bu araştırmada deve kimozin geni metilotrofik bir maya olan P. pastoris mayasında GAP promotoru kontrolünde pGAPZαA üretim vektörü kullanılarak üretilmiştir. Elektroporasyon ile gen aktarımı yapılan P. pastoris X33 suşlarında bulunan vektör kopya sayısı Southern Blott analizi ile belirlenmiştir. Seçilen tek kopya suşu ile çalkalamalı erlen koşullarında uygun pH (3-7) ve sıcaklık (20-28 oC) aralıkları faktöriyel deneme deseni ile 3 paralel ve 2 tekerrür ile belirlenmiştir. İstatik analizleri sonucunda optimum sıcaklığın 24 ve pH 'ın 3 olduğu belirlenmiştir. Büyük ölçekli (5-L) kimozin üretimi pH 3.0 ve 24 oC ' de gerçekleştirilmiştir. Fermantasyonun üretim aşaması GAP promotorunun verimli olduğu hipoksik şartlarda 103 saat boyunca sürdürülmüştür. En yüksek enzim aktivitesine 56. saatte ulaşılmış ilerleyen saatlerde enzim aktivitesinde azalma olduğu gözlenmiştir. Rekombinant kimozin aktivitesi yaklaşık olarak 20 IMCU/mL diğer bir ifade ile 2000 Soxhelet Unıt/mL bulunmuştur. Fermantasyon ortamında toplam 214.7 mg/L rekombinant protein olduğu tespit edilmiştir. SDS-PAGE analizi sonucunda yaklaşık 42kDa büyüklüğünde bir bant olarak gözlenmiştir. Enzimin optimum çalışma sıcaklığı 50 oC, optimum pH'sı 3.0-4.0 arası olduğu belirlenmiştir. Enzim pH 3.0-6.5 arası ve 20-65 oC arası stabilitesini 2 saat koruyabilmektedir. Fakat pH' nın 4 ve sıcaklığın ise 50 oC üzerine çıkması ile enzim i aktivitesinin azalmasına neden olmaktadır. Ayrıca enzim 10 Mm Mg+2 ve Fe+2 varlığında aktivitesi sırası ile %129.58 ve % 72.5 artarken; Cu+2, Zn +2 varlığında inhibe olmaktadır. Deve kimozini en yüksek aktiviteyi 20-40 Mm CaCl2 arasında ulaşmışken, bu konsantrasyonun artması ile aktivitesi düşmektedir. Üretilen rekombinat deve kimozini ile beyaz peynir üretimi gerçekleştirilmiş, üretim sonucunda ticari rekombinant sığır ile rekombinant deve kimozini verimleri kıyaslanmıştır. Ticari kimozin ile üretilen beyaz peynir verimi %14.8 iken; rekombinant kimozin verimi %15.45 bulunmuştur. Bu sonuçlara göre rekombinant deve kimozinin ticari rennet kadar etkili bir enzim olduğu saptanmıştır. Rekombinant deve kimozin enziminin üretim şartlarının optimizasyonu ile verimin arttırılması ve ölçek büyütme çalışmaları gerçekleştirildiği takdirde ticari olarak üretim potansiyeli bulunmaktadır.
Pichia pastoris mayasında alkol dehidrogenaz (ADH3) promotoru ile rekombinant fitaz enzimi üretimi
Fitaz enzimi kağıt endüstrisinde, gıda sanayide, myo-inositol fosfatların hazırlanmasında ve özellikle yem sanayide kullanılan önemli bir enzimdir. Fitazlar genellikle hayvan beslenmesinde kullanılır. Fitazlar, fitattan fosfatı ayırarak fosforun yeme takviye ihtiyacını azaltır, yemin besleyici değerini arttırır ve atılan fosfor seviyesini düşürürür. Böylece biyoyararlılık artar ve çevresel kontaminasyon azalır. Gıda ve yem endüstrisinde kullanılan fitazlar genellikle bakteriler ve funguslardan elde edilmektedir. Mikrobiyal fitazlar geniş pH aralıklarında termostabil olarak bilinir. Son zamanlarda doğal kaynaklı enzimlerin yetersiz olmasından dolayı rekombinant üretimlerine olan ilgi artmıştır. Pichia pastoris rekombinant protein üretiminde sıklıkla kullanılan bir mayadır. Metanol, glikoz, sorbitol, gliserol, mannitol gibi karbon kaynaklarının yanı sıra etanolü de karbon kaynağı olarak kullanabilmektedir. Bu çalışmada Escherichia coli fitaz geni metilotrofik bir maya olan P. pastoris'te alkol dehidrogenaz (ADH3) promotoru kontrolü altında üretilmiştir. Sentetik SNT5 ve doğal ADH3 promotoru (900 bç) kullanılarak rekombinant fitaz üretilmiş ve iki promotor ile üretilen fitaz verimleri karşılaştırılmıştır. Elde edilen üretim suşlarının kopya numaraları Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (GT-PZR) analizi ile belirlenerek tek kopya klonlar seçilmiş ve erlenmayerde 96 saat boyunca etanol ile beslenerek üretimi gerçekleştirilmiştir. Sentetik ADH3 promotoru ve doğal ADH3 promotoru için enzim aktiviteleri sırasıyla 12203 U/ml ve 7613 U/ml olarak hesaplanmıştır. Sentetik promotorun doğal promotora göre 96. saat sonunda yaklaşık % 60 daha fazla aktivite gösterdiği belirlenmiştir. SDS-PAGE analizi sonucu fitazın moleküler ağırlığının yaklaşık 55 kDa olduğu saptanmıştır. Enzimin optimum çalışma şartları pH 4.0 ve 60°C olarak tespit edilmiştir. Enzim 2 saatte pH 2.5-6.0 arası %90'ın üzerinde stabilitesini korumuştur. Fitaz 30 dakikada 60°C ve 75°C'de sırasıyla %87 ve %49 aktivitesini korumuştur. Fitaz aktivitesi Ca+2 ve Mg+2 iyonları tarafından artırılırken Cu+2, Zn+2 ve Fe+2 iyonları tarafından azaltılmıştır. Bu çalışma sonunda ADH3 promotoru altında rekombinant olarak yüksek miktarda fitaz enzimi üretiminde P. pastoris ekspresyon sisteminin uygun olduğu sonucuna varılmıştır. Çalışmada kullanılan yöntem, farklı promotor çalışmaları için örnek niteliğinde olmuştur.