Theses supervised by Yrd. Doç. Dr. Zeynep Akdeste
11 theses · Yıldız Technical University
Alzheimer amiloid beta peptidine ait farklı amino asid dizilerinin polielektrolitler ile konjugasyon reaksiyonlarının incelenmesi
Amiloid terimi, özellikle son yıllarda bilim dünyasında önemli bir araştırma konusu haline gelmiştir. Bunun en önemli sebebi, Alzheimer hastalığına neden olan en önemli etkenlerden birinin amiloid beta birikimlerinin meydana gelmesidir. Alzheimer hastalığı, yanlış katlanmış olan Amiloid Beta peptidlerinin beyinde plaklar şeklinde birikim oluşturması sonucu meydana gelmektedir. Bu plaklar genellikle 39-43 amino asitten oluşan ve amiloid beta (Aβ) denen küçük peptid dizilerinden oluşmaktadır. Aβ çok daha büyük bir protein olan ve amiloid öncül protein (APP) olarak bilinen daha büyük bir proteinin çeşitli enzimlerle parçalanması sonucu meydana gelir. Sonuç olarak oluşan Aβ peptid fragmentleri sinir hücrelerinin dışında birikerek senil plaklar denilen yapıları oluştururlar. Bu tez çalışmasında, çağımızın en önemli hastalıklarından biri olarak görülen Alzheimer hastalığına ait peptid bazlı aşı modeli, tanı kiti geliştirilmesi gibi alanlarda kullanılabilecek biyolojik aktiviteye sahip peptid- makromolekül biyokonjugatları ve fiziksel kompleksleri geliştirilmesi amaçlanmıştır. Amiloid beta (Aβ) peptidinin antijenik özellikteki 2 farklı amino asid dizisi ticari olarak satın alınmıştır. Her iki peptid dizisi ayrı ayrı 4 farklı taşıyıcı makromoleküle farklı mekanizmalar ve bağlanma dereceleri ile hem kovalent olarak bağlanmış, hem de bu taşıyıcılar ile fiziksel kompleksleri elde edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan taşıyıcı makromoleküller şunlardır: Poliakrilik asid (PAA), [Poli(N-vinil-2-pirolidon-ko-akrilikasid) veya VPAA], Dekstran aldehit (DA) ve Bovin Serum Albumin (BSA)'dir. Bu taşıyıcı moleküllerden PAA ve BSA ticari olarak alınmış olup, VPAA ve DA ise bölümümüzde sentezlenmiş ve karakterizasyonları yapılmıştır. Her iki peptid dizisinin de amino ucuna Triptofan amino asidi eklenerek bu peptidlere floresans özellik kazandırılmıştır. Böylelikle peptidlerin ve daha sonra sentezlenen biyokonjugatların florosans spektrofotometre cihazı ile incelenmesine olanak sağlanmıştır. Sentezlenen bütün biyokonjugat ve komplekslerin fizikokimyasal yapıları incelenmiş ve karakterizasyonları yapılmıştır. Biyokonjugat ve komplekslerin oluşumu, farklı spektroskopik ve kromatografik yöntemlerle aydınlatılmıştır. Elde edilen sonuçlar kıyaslandığında, sulu çözeltide karbodiimid varlığında kovalent bağlar ile oluşan biyokonjugatların daha verimli ve güçlü bağlandığı görülmüştür. Konjugasyon reaksiyonunun oluşumu sırasında floresans boya kullanılarak Floresans Rezonans Enerji Transferi (FRET) yöntemi yardımı ile; intermoleküler mesafe hesabı yapılıp, biyokonjugattaki donör ve akseptör arasındaki mesafe hesabı ile elde edilen bilgiler, saf peptidin konformasyonu ve biyokonjugat oluşumu durumunda peptidin konformasyonundaki değişimler hesaplanmış ve sayısal değerlerle de ifade edilmiştir. Ayrıca literatürde ilk kez Trp içeren Amiloid beta (1-21) peptid dizisi modellenmiş, moleküler mekanik yöntem ile minimum enerjiye sahip olduğu optimize geometrisi belirlenmiştir. FRET yöntemi ile deneysel verilere dayalı elde edilen sayısal değerlerin, teorik olarak hesaplanan değerler ile örtüştüğü ispatlanmıştır. Sentetik aşı modeli olarak tasarladığımız Amiloid beta (Aβ) peptidinin-taşıyıcı makromolekül biyokonjugatları için; in vivo uygulamalarda kullanılan düşük konsantrasyonlarda MCF-7 hücreleri üzerinde yapılan çalışmalarda elde edilen biyokonjugatların özellikle düşük dozlarında önemli derecede toksik bir etki göstermediği ortaya konulmuştur. Ayrıca bu biyokonjugatlarla yapılan MTT deneyleri ile hücre canlılık oranları da kontrol edilerek, IC50 değerleri hesaplanmıştır. Tez kapsamında hücre kültürü ile ilgili yapılan bir diğer çalışmada ise, her iki peptid dizisine ait farklı konsantrasyonlarında sentezlenmiş olan fiziksel kompleksler ve biyokonjugatlar, tek başına taşıyıcı makromoleküller ve tek başına peptid dizileri, işaretleme gerektirmeden, 72 saat boyunca gerçek zamanlı (real-time) ölçüm alan yeni bir yöntem olan XCELLienge Sistemi ile İnsan Umbilikal Ven Edotel Hücreleri (HUVEC) hücrelerine uygulanmış ve bu maddelerin hücrelerin çoğalma hızına etkileri ve toksik etkileri incelenmiştir. Biyokonjugat ve fiziksel kompleksin HUVEC üzerindeki etkileri kıyaslandığında ise, özellikle kovalent bağla bağlanmış olan biyokonjugatların hücre çoğalması üzerinde önemli bir negatif etkisinin olmadığı görülmüş ve hem MCF-7 ile hemde HUVEC ile yapılan hücre çalışmaları sonucunda elde edilen veriler ile de biyokonjugatların deney hayvanları üzerinde kullanabilirliği ortaya konulmuştur. Böylece bu tez kapsamında sentezlenen konugatların Aβ'nın Alzheimer hastalığına karşı spesifik antikorlarının elde edilmesi, nanobiyosensörlerinin oluşturulması, tanı kitlerinin ve biyoteknolojik aşılarının geliştirilmesine ışık tutacak bir çalışmadır. Anahtar Kelimeler: Amiloid beta peptidi, Alzheimer, biyoteknolojik aşılar, biyokonjugat, kovalent konjugasyon, adjuvant, karbodiimid, toksisite.
Proteinlerin poliakrilik asit ile suda çözünmyen kompleksleri
Bugüne kadar yapılmış çalışmalarda polielektrolit ve proteinler arasında suda çözünen veçözünmeyen kompleks oluşumu prosesi, yapısı ve morfolojisi ile bu sistemlerde fazlar arasıgeçişlerin varlığı, mevcut fiziksel kimya yöntemleri ile incelenmiştir.Bu tez çalışmamızda PAA'in BSA ile etkileşimini türbidimetrik titrasyon yöntemi ileincelenmiştir. Türbidimetrik titrasyon yönteminin, suda çözünmeyen interpolimerkompleksinin oluşumu ve bu tür komplekslerin suda çözünür hale geçişini belirlemek için eniyi yöntemlerden biri olduğu bilinmektedir. Bu tez çalışmasında gerek PAA gerekse de BSApH değerlerine bağlı olarak farklı elektrik yükleri taşıdığından, sistem pH'a bağlı olarak;etkileşim mekanizmasının bileşenlerine de bağlı olduğu bilindiğinden dolayı orana bağlıetkileşimi incelenmiştir. Nötral pH ortamlarında tümüyle suda çözünen polimer-proteinkarışımı, pH değeri azaldıkça suda çözünmeyen hale geçmekte ve pH'ın değerinin izoelektriknoktasına yakın değerlerinden başlayarak düşük değerlerinde suda çözünmeyen bir karışımoluşmakta olduğu belirlenmiştir.İlk kez tarafımızca BSA/PAA oranının sabit değerinde pH değerinin artırılması ya daazaltılmasıyla elde edilen titrasyon eğrilerinin çakışmadığı görülmüş ve sistemde bu ikieğrinin histeriziz gösterdiği belirlenmiştir.Anahtar kelimeler: polielektrolit, poliakrilik asit, bovin serum albumin, türbidimetri
Poli(1-azobisiklo[4.2.0]oktan) ve türevlerinin sentezi ve karakterizasyonu
Son yıllarda fonksiyonel biyopolimer sistemlerin gelistirilmesine yönelik çok fazla sayıda çalısmalar yapılmıstır. Bugüne kadar yapılmıs çalısmalarda biyolojik özellikli polielektrolitlerin sentezi, karakterizasyonu ve kullanım çesitliliği üzerinde durulmustur. Bu tez çalısmasında yapısında heteroatom bulunduran biyobozunur bir polielektrolit olan poli(1-azobisiklo[4.2.0]oktan) (polikonidin) sentezi ve karakterizasyonu anlatılmaktadır. Poli(1-azobisiklo[4.2.0]oktan) eldesi için öncelikle bu polimerin monomeri olan 1- azobisiklo[4.2.0]oktan (konidin) monomerinin sentezi organik yöntemlerle gerçeklestirilmistir. Daha sonra değisik molekül ağırlıklarına sahip polimerler sentezlenmis ve bu polimerlerin karakterizasyonu farklı yöntemlerle (UV, FT-IR, SEC, Ultrasantrifüj) yapılmıstır. Elde edilen polimerlerin bir kısmı bromoasetik asit ile modifiye edilerek polimere uygun fizikokimyasal özellikler kazandırılmaya çalısılmıstır. Konidin sentezinin her asamasında olusan maddelerin FT-IR ve UV spektrumları alınmıs ve sentezin izlediği yol sürekli kontrol edilmistir. Sentezlenen konidin, monomer olarak kullanılmıs ve farklı baslatıcılar varlığında (metil iyodür, etil bromür, heksadesil bromür, tbutil bromür, benzoil klorür ve trimetilsilan bromür) katyonik halka açılması polimerizasyonu ile poli(1-azobisiklo[4.2.0]oktan) elde edilmistir. Baslatıcı/monomer oranı değistirilerek bunun polimerlerin karakteristiğine olan etkisi incelenmistir. Poli(1-azobisiklo[4.2.0]oktan)'ın kimyasal modifikasyonu için bromoasetik asit kullanılmıs ve polimerin kuarternlesmesi ile poliamfolit sentezi gerçeklestirilmistir. Polielektrolitlerin fizikokimyasal özelliklerinin yapı ile doğrudan iliskili olduğu bilinmektedir. Bu nedenle sentezlenen polimerin karakterizasyonunun yapılması amaçlanmıstır. Poli(1- azobisiklo[4.2.0]oktan)'in FT-IR spektrumları alınmıs ve dört dedektörlü (ısık saçılması, refraktif indeks, viskozite ve UV) moleküler eleme kromatografisi ile polimerlerin molekül ağırlıkları, polidispersite değerleri (Mw/Mn), Mark-Houwink sabitleri ve partikül yarıçapları ölçülmüstür. Zeta Sizer ile polimer zincirlerinin boyut analizi yapılmıs ve zeta potansiyelleri ölçülmüstür. Sentezlenen polimerlerin sedimentasyon katsayıları Ultrasantrifüj ile belirlenmistir. Polimerlerin molekül ağırlıklarının baslatıcı miktarı ve türündeki değisimler ile polimerizasyon ortamından etkilendiği belirlenmistir. Polimerin bromoasetik asit türevinin hücre canlılığına etkisi meme kanseri hücreleri (MCF 7) üzerinde in vitro ortamda incelenmis ve polimer konsantrasyonu değisikliğinin hücre canlılığına etkisi arastırılmıstır. Anahtar kelimeler: polielektrolit, polikonidin, katyonik halka açılması polimerizasyonu
Hepatit B yüzey antijeni 95-109 peptid dizisinin sentezi ve polielektrolitler ile suda çözünebilen biyokonjugatlarının geliştirilmesi
Tez çalısmamızda, Hepatit B virüsüne ait yüzey antijeni peptidi (HBsAg) epitoplarından 95- 109 amino asid dizisinin sentezi yapılmıstır. Bu peptidin sentetik polianyonlar ile farklı yöntemler (Sulu ortamda ve organik ortamda mikrodalga destekli) kullanılarak sentezlenen biyokonjugatlarının fizikokimyasal özellikleri incelenmistir. Hepatit B virüsünün yüzey antijen epitopuna ait 95-109 amino asid dizisi: WLVLLDYQGMLPVCPL seklindedir. Bu peptidin sentezi, Merrifield tarafından gelistirilen Katı Faz Peptid Sentezi (SPPS) yöntemi ile Liberty Mikrodalga Peptid Sentezi Cihazında (CEM), Fmoc kimyası kullanılarak yapılmıstır. Literatürde bulunmayan yeni bir yaklasımla, ilk kez Hepatit B yüzey antijen epitoplarından 95-109 amino asid dizisinin amino ucuna Triptofan amino asidi eklenmistir. Böylelikle sentezlenen peptide floresans özellik kazandırılarak, sentezlenen peptidin florosans spektrofotometre cihazı ile incelenmesine olanak saglanmıstır. Tez çalısmamızda, yüksek immünejeniklige sahip peptid konjugatlarını elde etmek için yeni bir yaklasım olarak; antijenik peptid moleküllerinin konjugasyonunda tasıyıcı olarak kendiliginden adjuvant etkisine sahip olan sentetik polianyonlar kullanılmıstır. Peptid antijeni olarak HBsAg'nin hidrofobik özellikli ve tek bir amin grubu içeren 95-109 dizisinin seçilmesi, gerek temel fizikokimyasal arastırmalar gerekse de daha immunojenik biyokonjugatların gelistirilebilmesi için varsayılmıstır. HBsAg'nin 95-109 amino asit dizisinin biyopolimerlerle sulu ortamda yapılan biyokonjugasyonlarında, farklı baslangıç mol oranları (nPeptid/nPolimer= 1, 3, 5, 7, 9 ) ve farklı aktivasyon mekanizmaları kullanılarak, biyokonjugatların fizikokimyasal davranısları incelenmistir. Ayrıca susuz organik ortamda, mikrodalga destekli yöntemle sentezlenen polimer-peptid konjugatı da, yeni bir yöntem olarak incelenmistir. Sentezlenen biyokonjugatların yapı ve karakterizasyonunu HPLC, VISCOTEK [Dört Detektörlü-UV, Refraktif Indeks, Viskozite ve Isık Saçılması, kromatografik Sistem] ve FTIR gibi spektroskopik ve flourimetrik (Floresans Spektrofotometre cihazı ile) yöntemlerle incelenmistir. Aktivasyon ve konjugasyonun mekanizması ve olusan konjugatların yapı modelleri tartısılmaktadır. Anahtar kelimeler: Katı faz peptid sentezi, sentetik peptidler, biyokonjugasyon, polielektrolit
Polianyonların human serum albumin ile etkileşim mekanizmasının araştırılması
Yağ asidi, amino asit, biliburin gibi metaboliklere ve Cu2+- Zn2+ gibi metal içeren birçok etkin maddeye karşı yüksek ilgi gösteren HSA, araştırmacılar tarafından ilaç salınım sistemlerinde spesifik hedeflere taşıyıcı olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada HSA'nın polianyonlar ile etkileşim mekanizması araştırılarak tıp, eczacılık ve temel bilim çalışmaları için mühendislik yaklaşımı geliştirilmiş ve etkileşimin fiziko-kimyasal yapısı HPLC, dört detektörlü GPC, dinamik ve elektroforetik ışık saçılması ve flüoresans yöntemleri kullanılarak açığa çıkarılmıştır. Protein-polianyon etkileşimlerinde baskın kuvvet elektrostatik etkileşim olup, hidrofobik etkilerin ve hidrojen bağlarının katkısının da olduğu düşünülmektedir. Sulu çözeltilerde polianyon ile protein arasındaki etkileşimler; pH, iyonik şiddet ve nHSA/nPAA miktarına bağlıdır. Kompleks oluşumunun ve sistemdeki faz geçişlerinin, çözeltilerin pH'ına ve bileşenlerin oranına bağlı olduğu, poliakrilik asit (PAA) ve human serum albumin (HSA), CPAA=1mg/mL için farklı pH değerlerine (pH=4,0-7,0) ve nprotein/npolimer oranlarına (nHSA/nPAA=0,1-10) bağlı olarak, suda çözünebilen ve çözünemeyen polimer-protein kompleksleri oluşturduğu gösterilmiştir. pH (7,0-6,0) > pIHSA (4,9) koşulunda, HSA-PAA komplekslerinin kararlılığı ihmal edilebilecek kadar zayıf olup, polielektrolit komplekslerinin oluşumu ve serbest bileşenlerin varlığı ilk kez pH 5,0 değerinde gözlenmeye başlanmıştır. pH5,0'da polikompleks parçacıklarının sulu çözeltilerinin molekül ağırlığı(Mw, Mn), molekül ağırlığı dağılımı, Mark-Houwink (a), bağlanma (k) ve doyma (?m?) sabitleri gibi moleküler özelliklerinin ve yapısal değişikliklerin nHSA/nPAA oranına bağlılığı araştırtmıştır. pH < pI durumunda kararlı polikompleks oluşumları artmış ve suda çözünemeyen HSA-PAA komplekslerinin varlığı pH 4,0 değerinde gözlenmiştir. Ayrıca, CPAA=0,1mg/mL için pH4,0 ve pH4,5'de türbidimetrik titrasyon yöntemi kullanılarak, suda çözünmeyen interpolimer kompleksinin oluşumunun ve suda çözünür hale geçişin pH değişiminden etkilenme mekanizması aydınlatılmıştır. Anahtar kelimeler: HPLC, dört detektörlü GPC, dinamik ışık saçılması, elektroforetik ışık saçılması, poliakrilik asit, human serum albumin, protein-polielektrolit kompleksi.
BSA-dekstran sülfat komplekslerinin oluşumu ve karakterizasyonu
Bu çalısmamızda bir polielektrolit-protein kompleksi olan Bovin Serum Albumin (BSA)- Dekstran Sülfat (DS) kompleksleri olusturulmus ve DS'nin BSA ile etkilesimi incelenmistir. BSA proteini, DS ile ortamın pH'ına baglı olarak suda çözünen kompleksler olusturur. Deneysel çalısmamızda, kompleksler degisik oranlarda (nBSA/nDS, nDS/nBSA) hazırlanarak, çesitli pH degerlerinde (pH=7 ve pH=5) incelendi. Sistem, DS ve BSA pH degerlerine baglı olarak farklı elektrik yükleri tasıdıklarından dolayı pH'a baglı olarak ve etkilesim mekanizması bilesenlere baglı oldugundan dolayı da orana baglı olarak incelenmistir. Komplekslerin; GPC-VISCOTEK (Moleküler Eleme Kromatografisi; UV, Refraktif ndeks, Vizkozite ve Isık Saçılması Detektörlerine Sahip Kromatografik Sistem), Floresans Spektrofotometre, Zeta-Sizer (Partikül boyutu ve Zeta Potansiyel ölçümü için) ve HPLC cihazları kullanılarak yapı-islev analizleri yapılmıs ve fizikokimyasal karakterizasyonları gerçeklestirilmistir. Anahtar kelimeler: Polielektrolit, bovin serum albumin, BSA-Dekstran sülfat kompleksleri, GPC, HPLC.
Kışlık ekmeklik buğday (Triticum aestium L.)'da sarı pas (Puccinia striiformis f. sp tritici) dayanıklılık geninin moleküler belirteçler (marker) ile araştırılması
Bu çalışmada, 7 farklı kışlık ekmeklik buğday çeşidi kullanılarak sarı pas hastalığına dayanıklılığı incelemek amacıyla 4 farklı dayanıklı x hassas melez kombinasyonları [Altay (dayanıklı) x Harmankaya99 (hassas); İzgi2001 (dayanıklı) x ES14 (hassas); Sönmez2001 (dayanıklı) x Aytın98 (hassas); PI178383 (dayanıklı) x Harmankaya99 (hassas)] yapılmış ve bu bireylerde Yr5 geni açısından polimorfizm gösteren moleküler belirteçlerin elde edilmesi amacıyla rezistant gen analog polimorfizmi (RGAP), dizisi etiketlenmiş alanlar (STS) ve mikrosatellit analizleri yapılmıştır. Bitkinin fide döneminde sarı pas hastalığına dayanıklılık sağlayan genlerden biri olan Yr5 geni buğday B genomu 2. kromozomunun uzun kolunda (2BL) bulunmaktadır. Kromozom 2BL yer alan ve bu gene belli uzaklıklarda bulunan değişik tipteki belirteçleri çoğaltan toplam 46 adet primer çifti (12 çift RGAP, 18 çift STS, 16 çift mikrosatelit) kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonları (PCR) yapılmıştır. Kombinasyonları oluşturan ebeveynler arasında polimorfizm gösteren moleküler belirteçler, sarı pas ırkları ile inokülasyondan sonra dayanıklı ve hassas olarak belirlenecek olan F2 bireylerinde analiz edilecektir. Elde edilmesi hedeflenen Yr5 belirteçleri, fide dönemi dayanıklılık genlerine ve ergin dönem dayanıklılık genlerine bağlantı gösteren belirteçler ile beraber bitki ıslah çalışmalarında kararlı ve etkin bir biçimde kullanılarak dayanıklı buğday genotiplerinin seçimini sağlayacaktır. Anahtar kelimeler: Triticum aestivum L., sarı pas, Yr5, PCR, DNA, RGAP, STS
Şap hastalığı virüsünün VP1 kapsid proteininin antijenik özellikli 40-60 amino asid dizili peptidinin polianyonlarla konjugasyonu
Biyolojik uyumlu bir sentetik polimer ve fonksiyonunun nizamlanması amaçlanan biyomolekül içeren makromolekül kompleksleri-Biyopolimer sistemler, korunmuş ilaçlar, yapay aşılar, tanı kitleri vb. biyoteknolojik ürünler gibi geniş bir ölçüde uygulama alanı bulmaktadırlar.Bu tez çalışmamızda Şap hastalığı Virüsünün VP1 kapsid proteininin antijenik özellikli 40-60 amino asid dizili sentetik peptid antijeni kendiliğinden adjuvant etkisi olan Polielektrolit taşıyıcısına bağlanarak biyopolimer sistem, yani biyokonjugat geliştirilmiş ve yapı özellikleri incelenmiştir.Biyokonjugatın sentezi, polimerin (PAA) karbodiimid varlığında aktifleştirilerek peptide bağlanması ile gerçekleştirilmiş, yapı ve karekterizasyonu çeşitli fizikokimyasal yöntemler (HPLC, FTIR, 4 Dedektörlü Viskotek Sistemi-Ultra-viole Visible, Işık Saçılması ve Viskozite- Flouresans Spektroskopisi) uygulanarak polimerin sentetik peptidle bağlanma mekanizması, biyokonjugat partiküllerin yapısı ve reaksiyon şartlarına bağlı olarak yapı çevrilmeleri incelenmiştir.Sentezlenmiş biyokonjugat Biyo-Rad kolonundan geçirilerek saflaştırılmıştır. Ürünün saflığı FTIR analizleri ile takip edilmiştir.Bu konjugatın immünojenik özellikleri ELISA yöntemi ile incelenmiştir.Anahtar kelimeler: Polielektrolit, Biyopolimer sistemler, İmmünojen, Polimer-Peptid konjugatı, Şap hastalığı virüsü (Foot-and-mouth Disease)
Sentetik viral peptidler kullanılarak polielektrolit esaslı biyokonjugatların geliştirilmesi
Sentetik peptidlerin suda çözünebilen polielektrolitlerle konjugasyonu sonucunda oluşan biyokonjugatlar biyolojik açıdan önem taşımakta ve sentetik aşıların geliştirilmesi gibi biyomedikal uygulamalar için büyük potansiyel vaat etmektedirler. Son yıllarda fonksiyonel biyopolimer sistemlerin geliştirilmesine yönelik çok sayıda çalışma yapılmaktadır. Bugüne kadar yapılmış çalışmalarda biyolojik özellikli polielektrolitlerin sentezi, karakterizasyonu ve kullanım çeşitliliği üzerinde daha çok durulmuştur.Bu çalışmada sentetik peptidlerle polielektrolitlerin mikrodalga destekli biyokonjugasyonu amaçlanmıştır. Çalışmada kullanılan viral peptidlerin tamamı tez kapsamında araştırma laboratuvarında mikrodalga destekli katı fazda peptid sentezi yöntemi (SPPS) ile sentezlenmiş ve LC-ESI-MS ile karakterize edilmiştir. Sentezlenen peptidlerden birinin aminoasit analizi yine bu çalışma kapsamında gerçekleştirilmiştir. Çalışmada kullanılan polielektrolitlerden polikonidinin, bu tez kapsamında önce monomeri sentezlenmiş sonrasında çeşitli başlatıcılar ile homopolimerizasyonu gerçekleştirilmiştir. Polikonidin biyobozunur yapısı ile biyokonjugat sentezi için ideal bir polimerdir. Çalışmada kullanılan bir diğer polielektrolit olan vinil pirolidon / akrilik asit kopolimeri (VP/AA)'de biyobozunur yapıda bir polimerdir.Peptid polielektrolit biyokonjugatlarının mikrodalga desteği ile organik ortamda HBTU/HOBt aktivatörleri varlığında sentezlenmesi, biyokonjugat sentezi alanına getirilmiş bir yeniliktir. Bu yeni yöntem, karbodiimid varlığında su ortamında yapılan klasik biyokonjugasyon sentezi yöntemine göre peptidlerin bağlanması yönünden daha etkilidir. Bu yeni yöntemle reaksiyon kısa sürede tamamlanmakta ve biyokonjugat çöktürme ile ortamdan ayrılabilmektedir. Her biri özel bir amaçla belirlenmiş olan farklı hastalıkların (Şap, Grip, Melanoma) antijenik özellikli viral kapsid peptidlerin polielektrolitlerle biyokonjugasyonu sayesinde sentetik aşı prototipi geliştirmek mümkün olacaktır. Bu tez kapsamında sentezlenen biyokonjugatların bir kısmının immünolojik analizleri çalışma grubumuz tarafından yapılmış bir kısmı ise yapılmaktadır. İmmünolojik analiz sonuçları umut vaat edicidir.Anahtar kelimeler: biyokonjugasyon, katı fazda peptid sentezi, LC-ESI-MS, mikrodalga, polielektrolit, polikonidin.
Alzheimer amiloid beta peptidine ait farklı amino asid dizilerinin polielektrolitler ile konjugasyon reaksiyonlarının incelenmesi
Amiloid terimi, özellikle son yıllarda bilim dünyasında önemli bir araştırma konusu haline gelmiştir. Bunun en önemli sebebi, Alzheimer hastalığına neden olan en önemli etkenlerden birinin amiloid beta birikimlerinin meydana gelmesidir. Alzheimer hastalığı, yanlış katlanmış olan Amiloid Beta peptidlerinin beyinde plaklar şeklinde birikim oluşturması sonucu meydana gelmektedir. Bu plaklar genellikle 39-43 amino asitten oluşan ve amiloid beta (Aβ) denen küçük peptid dizilerinden oluşmaktadır. Aβ çok daha büyük bir protein olan ve amiloid öncül protein (APP) olarak bilinen daha büyük bir proteinin çeşitli enzimlerle parçalanması sonucu meydana gelir. Sonuç olarak oluşan Aβ peptid fragmentleri sinir hücrelerinin dışında birikerek senil plaklar denilen yapıları oluştururlar. Bu tez çalışmasında, çağımızın en önemli hastalıklarından biri olarak görülen Alzheimer hastalığına ait peptid bazlı aşı modeli, tanı kiti geliştirilmesi gibi alanlarda kullanılabilecek biyolojik aktiviteye sahip peptid- makromolekül biyokonjugatları ve fiziksel kompleksleri geliştirilmesi amaçlanmıştır. Amiloid beta (Aβ) peptidinin antijenik özellikteki 2 farklı amino asid dizisi ticari olarak satın alınmıştır. Her iki peptid dizisi ayrı ayrı 4 farklı taşıyıcı makromoleküle farklı mekanizmalar ve bağlanma dereceleri ile hem kovalent olarak bağlanmış, hem de bu taşıyıcılar ile fiziksel kompleksleri elde edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan taşıyıcı makromoleküller şunlardır: Poliakrilik asid (PAA), [Poli(N-vinil-2-pirolidon-ko-akrilikasid) veya VPAA], Dekstran aldehit (DA) ve Bovin Serum Albumin (BSA)'dir. Bu taşıyıcı moleküllerden PAA ve BSA ticari olarak alınmış olup, VPAA ve DA ise bölümümüzde sentezlenmiş ve karakterizasyonları yapılmıştır. Her iki peptid dizisinin de amino ucuna Triptofan amino asidi eklenerek bu peptidlere floresans özellik kazandırılmıştır. Böylelikle peptidlerin ve daha sonra sentezlenen biyokonjugatların florosans spektrofotometre cihazı ile incelenmesine olanak sağlanmıştır. Sentezlenen bütün biyokonjugat ve komplekslerin fizikokimyasal yapıları incelenmiş ve karakterizasyonları yapılmıştır. Biyokonjugat ve komplekslerin oluşumu, farklı spektroskopik ve kromatografik yöntemlerle aydınlatılmıştır. Elde edilen sonuçlar kıyaslandığında, sulu çözeltide karbodiimid varlığında kovalent bağlar ile oluşan biyokonjugatların daha verimli ve güçlü bağlandığı görülmüştür. Konjugasyon reaksiyonunun oluşumu sırasında floresans boya kullanılarak Floresans Rezonans Enerji Transferi (FRET) yöntemi yardımı ile; intermoleküler mesafe hesabı yapılıp, biyokonjugattaki donör ve akseptör arasındaki mesafe hesabı ile elde edilen bilgiler, saf peptidin konformasyonu ve biyokonjugat oluşumu durumunda peptidin konformasyonundaki değişimler hesaplanmış ve sayısal değerlerle de ifade edilmiştir. Ayrıca literatürde ilk kez Trp içeren Amiloid beta (1-21) peptid dizisi modellenmiş, moleküler mekanik yöntem ile minimum enerjiye sahip olduğu optimize geometrisi belirlenmiştir. FRET yöntemi ile deneysel verilere dayalı elde edilen sayısal değerlerin, teorik olarak hesaplanan değerler ile örtüştüğü ispatlanmıştır. Sentetik aşı modeli olarak tasarladığımız Amiloid beta (Aβ) peptidinin-taşıyıcı makromolekül biyokonjugatları için; in vivo uygulamalarda kullanılan düşük konsantrasyonlarda MCF-7 hücreleri üzerinde yapılan çalışmalarda elde edilen biyokonjugatların özellikle düşük dozlarında önemli derecede toksik bir etki göstermediği ortaya konulmuştur. Ayrıca bu biyokonjugatlarla yapılan MTT deneyleri ile hücre canlılık oranları da kontrol edilerek, IC50 değerleri hesaplanmıştır. Tez kapsamında hücre kültürü ile ilgili yapılan bir diğer çalışmada ise, her iki peptid dizisine ait farklı konsantrasyonlarında sentezlenmiş olan fiziksel kompleksler ve biyokonjugatlar, tek başına taşıyıcı makromoleküller ve tek başına peptid dizileri, işaretleme gerektirmeden, 72 saat boyunca gerçek zamanlı (real-time) ölçüm alan yeni bir yöntem olan XCELLienge Sistemi ile İnsan Umbilikal Ven Edotel Hücreleri (HUVEC) hücrelerine uygulanmış ve bu maddelerin hücrelerin çoğalma hızına etkileri ve toksik etkileri incelenmiştir. Biyokonjugat ve fiziksel kompleksin HUVEC üzerindeki etkileri kıyaslandığında ise, özellikle kovalent bağla bağlanmış olan biyokonjugatların hücre çoğalması üzerinde önemli bir negatif etkisinin olmadığı görülmüş ve hem MCF-7 ile hemde HUVEC ile yapılan hücre çalışmaları sonucunda elde edilen veriler ile de biyokonjugatların deney hayvanları üzerinde kullanabilirliği ortaya konulmuştur. Böylece bu tez kapsamında sentezlenen konugatların Aβ'nın Alzheimer hastalığına karşı spesifik antikorlarının elde edilmesi, nanobiyosensörlerinin oluşturulması, tanı kitlerinin ve biyoteknolojik aşılarının geliştirilmesine ışık tutacak bir çalışmadır. Anahtar Kelimeler: Amiloid beta peptidi, Alzheimer, biyoteknolojik aşılar, biyokonjugat, kovalent konjugasyon, adjuvant, karbodiimid, toksisite.
Biyomolekül içeren polielektrolit konjugatları
Polielektrolit özellikteki farklı sentetik polimerlerin biyomoleküller ile etkileşimleri biyolojik açıdan önemli mekanizmaların varlığını ortaya koymakta ve biyomedikal uygulamalar için büyük önem taşımaktadır. Polielektrolit - biyomolekül konjugatları yeni tip sentetik polimerik aşı sistemlerinin geliştirilmesinde, biyomolekülün kararlılığının arttırılmasında, organ, doku, hücre ve reseptör hedeflemelerinin gerçekleştirilmesinde, biyopolimre ait çözünürlük gibi kimi sorunlarının giderilmesi ve canlıda uzun sürede salınımının sağlanmasında, biyouyumluluğunun arttırılmasında, tanı teşhis kitlerinin hazırlanmasında, biyosensör sistemlerinin geliştirilmesinde önemli ve öncü sistematik yapıları teşkil etmektedirler.Bu yönde yapılan çalışmlarımızda sentetik polielektrolitlerin (poliakrilikasid, polioksidonyum gibi polimerler ve polimetilvinileter-ko-maleikanhidrid, poli(vinilpirolidon-ko-akrilikasid), poli(asetikasid-ko-N-izopropilakrilamid) gibi kopolimerler) özellikle antikanser özelliği bilinen betulin , steroid yapıdaki hormonlardan estradiol ve progestron, melanoma kanser peptidlerinden MAGE-3(121-134) peptid dizesi ve BSA gibi biyomoleküller ile farklı yöntemler ve çapraz bağlayıcılar (EDC, CDI, vb.) kullanılarak gerçekleştirilen konjugasyon reaksiyonları ile sentezlenen konjugatların ve hazırlanan komplekslerin kimilerinde yapı işlev analizleri, sitotoksisite testleri, antioksidan özelliklerinin incelenmesi kimilerinde ise immünolojik hayvan deneyleri gerçekleştirildi.Bu sayede daha etkin, kararlı, hücre yönlendirmesi yapılabilen diagnostikler elde edilmesi amaçlanmakta, teşhis kitlerinde ve tedavi yöntemlerinde kullanılmasına yönelik ön çalışmaların yapılması hedeflenmektedir.