Autophagy
59 theses under this subject heading
Sıçan miyokardit modelinde insülin benzeri büyüme faktörü (IGF-1)'in kardiyoprotektif etkileri
Doksorubisin (Dox) oksidatif hasara bağlı kardiyotoksisik etkisi nedeniyle miyokardite neden olmaktadır. İnsülin benzeri büyüme faktör (IGF)-1 antiinflamatuvar, antiapoptotik ve antioksidan özelliğe sahip kardiyovasküler sistem üzerinde etkili farmakolojik bir ajandır. Yapılan çalışmada Dox ile indüklenen miyokardit modelinde IGF-1'in moleküler mekanizmalarının aydınlatılması ve kardiyoprotektif etkilerinin araştırılması amaçlandı. Wistar albino erkek sıçanlar Kontrol, Dox (4mg/kg/hafta), IGF-1 (1 µg /kg iki gün arayla) ve Dox + IGF-1 (4mg/kg/hafta Dox ve 1 µg /kg iki gün arayla IGF-1) olarak 4 gruba ayrıldı ve tüm uygulamalar intraperitoneal olarak yapıldı. 4 haftalık deney protokolünün sonunda Ketamin ve Ksilazin anestezisi altında sakrifikasyon yapıldı. Kan serumundan CK-MB ve Troponin-I seviyeleri biyokimyasal analizlerle ölçüldü. Kalp dokusundan histopatolojik ve immünohistokimyasal (Kaspaz-3 ve ICAM-1) değerlendirmeler yapıldı. Ayrıca kalp dokusundan ELISA yöntemiyle TNF-α, IL-6, TAS ve TOS seviyeleri ile RTPCR yöntemiyle Beclin-1, SQSTM1, LC3, HIF-1α, iNOS, SERCA2a ve MasR gen ekspresyonları analiz edildi. Dox uygulaması histopatolojik ve immünokimyasal skorları, CK-MB, Troponin-I, TNF-α, IL-6 seviyelerini ve TOS/TAS oranını arttırdı. Moleküler analizler sonucunda Beclin-1, SQSTM1, LC3, SERCA2a, MasR ve HIF-1α ekspresyonlarını indükleyerek kardiyak hasara neden oldu. IGF-1 tedavisi sonrasında hasar parametrelerinde anlamlı seviyede iyileşme görüldü. Dox ile indüklenen miyokardit modelinde IGF-1'in SERCA2a/ MasR sinyal yolağı aracılı otofajiyi inhibe ederek kardiyoprotektif etki sağladığı bulundu. IGF-1'in Dox ile indüklenen miyokardit modelinde inflamatuvar süreçlerin düzenlenme, oksidatif hasarı azaltma, apoptotik hücre ölümü ve otofajiyi inhibe etme mekanizmalarıyla terapötik etki sağladığı bulundu.
Şizofreni hastaları, sağlıklı kardeşleri ve sağlıklı kontrollerde serum beclin-1 ile ATG5 düzeylerinin incelenmesi
Çalışmamızda şizofreni tanılı hastalar ve hastaların sağlıklı kardeşleri ile kontrol grubu arasında otofaji adı verilen bir hücresel süreçte önemli rol oynayan Beclin-1ve Otofaji ile ilişkili 5 (Atg5) proteinlerinin düzeylerinin ölçülmesi, gruplar arasında fark olup olmadığının araştırılması ve otofajinin şizofreni etiyopatogenezindeki rolünün değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Araştırma kapsamında, DSM-5 tanı kriterlerine göre şizofreni tanısı konulan 26 hasta, bu hastaların 26 sağlıklı kardeşi ve 26 kontrol dahil edilmiştir. Tüm katılımcılar için, sosyodemografik ve klinik bilgi formu doldurulmuştur. Şizofreni tanısı konulan hastalara Negatif Semptomları Değerlendirme Ölçeği (SANS), Pozitif Semptomları Değerlendirme Ölçeği (SAPS) Apati Değerlendirme Ölçeği (ADÖ) ve Kısa Form-36 (SF-36) ölçeği uygulanmıştır. Katılımcıların serum Beclin-1 ve Atg5 seviyeleri, ELISA yöntemiyle ölçülmüştür. Verilerin istatistiksel analizinde SPSS 22,0 Windows versiyon paket programı ve MedCalc 19.8 paket programı kullanılmıştır. P<0,05 anlamlı kabul edilmiştir. Hasta ve kontrol grubu Beclin-1 ve Atg5 değerleri bakımından karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı düzeyde fark olduğu saptandı (her biri için p<0.05). Hasta ve sağlıklı kardeş grubu Beclin-1 ve Atg5 düzeyleri karşılaştırıldığında anlamlı fark saptanmadı (p>0.05). Sağlıklı kardeş ve kontrol grubunun Beclin-1 ve Atg5 değerleri arasında istatistiksel açıdan anlamlı fark vardı (p<0.05). Yapılan korelasyon analizinde hastaların Beclin-1 ile Atg5 düzeyleri arasında ilişki saptanmazken, sağlıklı kardeş grubunda pozitif yönde orta şiddette bir ilişki bulundu(r=0,488; p=0,011). Bu çalışma, bildiğimiz kadarıyla şizofreni hastaları ve sağlıklı kardeşleri arasında Beclin-1 ve Atg5 düzeyinin değerlendirildiği ilk araştırmadır. Çalışmamız şizofreni etiyolojisinde otofajinin rol oynayabileceğini ve otofajinin şizofreni hastalarının ve sağlıklı kardeşlerinde de benzer düzeyde bozuk olduğunu göstermesi açısından önemlidir. Bu durumun bir endofenotipik özellik olarak yorumlanabilmesi ve Beclin1, Atg5 düzeylerinin marker olarak kullanılabilmesi için daha büyük örneklemlerde ve farklı ırkların dahil edildiği çalışmalara ihtiyaç vardır.
Antikanser tedavisi olarak kanser hücrelerinde bakteriyel otofajiyi indükleyen lipopolisakkaritler
Escherichia coli (ATCC 8739) lipopolysaccharides (LPS) extracted from this stain were determined to be the most abundant in comparison to the DH5alpha- stain. So, the LPS obtained from E. coli (ATCC 8739) was tested on breast cancer cell lines to see whether it had any impact. LPS treatment has mixed outcomes on the MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines. LPS-treated breast cancer cells also demonstrated up-regulation of Toll-like receptor (TLR) stimulation pathway genes (TLR-4 and NFkβ) and autophagy associated genes (PI3KC3). Toll-like receptor 4 ligand LPS may thereby alter immune responses in many malignancies. It is possible to considerably enhance the effectiveness of chemotherapy by using LPS in conjunction with other medicines. Translational oncology research for breast cancer treatment may benefit from the use of LPS, according to our results. The aim of the present study was to evaluate effect of E. coli isolated LPS on various breast cancer cells. ATCC 8739 and DH5alpha- were the two E. coli strains used for LPS isolation. Various biochemical approaches were used to estimate the extracted LPS in terms of both quality and quantity. Keywords: Autophagy, Breast cancer, Toll-like receptors, Lipopolysaccharide, Gene expression
Let-7C ifadesinin çeşitli meme kanser hücre hatlarında otofaji ile ilişkisinin araştırılması
Otofaji, uzun ömürlü proteinlerin, hasarlı organellerin ve katlanmamış proteinlerin oluşturduğu çökeltilerin yıkımı için var olan lizozomal katabolik bir yolaktır. Otofajinin, kanser, otoimmün ve nörodejeneratif hastalıklar gibi birçok hastalıkta rol oynadığı bilinmektedir. MikroRNA'lar (miRNA), 19-25 nükleotid uzunluğunda tek zincirli kodlanmayan RNA'lardır ve gen ifadesinde transkripsiyon sonrasında görev almaktadır. miRNA'ların tümör gelişiminde, metastazında ve istilasında tümör baskılayıcı veya onkogen olarak rol aldıkları bilinmektedir. miRNA'ların ifadelerindeki düzensizlikler meme kanserinde de gözlemlenmektedir. Let-7c, çeşitli kanserlerde ifade seviyesi düşük bulunmuş ve tümör baskılayıcı olarak hareket ettiği düşünülmektedir. Bu çalışmada SKBR-3, MCF-7, CRL-2329 meme kanseri hatlarında ve CRL-4010 normal meme epitelyum hücre hattında let7c ifade seviyesi ve otofaji yolağındaki etkisi qRT-PCR, GFP-LC3, western blot teknikleri kullanılarak araştırılmıştır. Let7c ifadesi MCF-7 ve CRL2329'da normal meme epitel hücre hattına göre qRT-PCR yöntemine göre belirgin şekilde düşük bulunmuştur. Let7c ifadesinin arttırılması ile SKBR-3 ve CRL-2329'da GFP-LC3 tekniğiyle incelendiğinde otofagazom sayısında artış gözlemlenmiştir. Western blot tekniği ile ATG9A seviyesi SKBR-3 ve CRL4010'da azalış göstermiş, LC3II/LC3I oranı ise sadece CRL4010'da yüksek bulunmuştur. İleriki yapılacak çalışmalarla Let7c ve tahmini hedefi ATG9A arasındaki ilişki ve meme kanserinde let7c'nin terapötik potansiyeli çok daha iyi anlaşılacaktır.
Glial beyin tümörlerinde ve lenfoma dışı metastazlarda otofaji ile ilişkili miRNA'ların serum ve doku değerlerinin karşılaştırılması
Amaç: Merkezi sinir sistemi tümörleri hem çocuk hem de erişkin hastalarda görülür ve bu tümörlerin birçoğu sakatlık ve ölüme neden olur. Hastaların tanısı ve izlemi için yeni hedefleri belirlemek gayreti ile güncel çalışmalar moleküler alana odaklanmıştır. Bu çalışmamızda otofaji ile ilişkili miRNA düzeylerine serum ve dokuda bakarak serum miRNA değerlerinin biyomarkır olarak kullanılıp kullanılamayacağını araştırdık. Yöntem: Çalışmaya kliniğimizde ameliyat edilen ve patoloji örneğinin sonucu glial tümör veya lenfoma dışı metastaz olarak raporlanan 27 hasta dahil edilmiştir. Otofaji ile ilişkili miRNA'ların serum ve doku düzeyleri karşılaştırılmıştır ve saptanan değerler arasındaki korelasyon student t testi kullanılarak kontrol edilmiştir. Bulgular: Vakaların histopatolojik incelemesinde 14 glioblastom, 3 oligodendrogliom, 2 anaplastik astrositom, 2 karsinom metastazı, 2 pilositik astrositom, 1 anaplastik ependimom, 1 anaplastik oligodendrogliom, 1 diffüz astrositom ve 1 ependimom gözlendi. Serum Ct değerleri istatistiksel olarak doku Ct değerlerinden yüksek saptandı (p<0,001). Diğer taraftan çalıştığımız miRNA alt tiplerinden sadece beşinin serum ve doku düzeyleri arasında korelasyon saptadık. Ek olarak 12 miRNA alt tipinden beşini bazı serum örneklerinde Ct değeri tespit edemedik. Sonuç: Her ne kadar literatürde serum miRNA seviyeleri ile doku miRNA seviyeleri arasında korelasyon görülse de biz bu çalışmada herhangi bir mantıklı korelasyona rastlamadık. Çalışmamızdaki hasta sayımızın düşüklüğü litaratür ile olan bu uyumsuzluğu açıklayabilir. Dolayısı ile bu çalışmanın sonuçlarına bakarak miRNA'ların beyin tümörleri için biyomarkır olamayacağını söylemek için erken olduğuna inanıyoruz. Anahtar Kelimeler: Glial tümör, miRNA, biyomarkır, otofaji
Otofajinin kolorektal kanserlerde yeri ve önemi
Kolon kanseri tüm dünyada kadınlar ve erkeklerde üçüncü en sık gözlenen kanserdir. Yılda yaklaşık 1.200.000 yeni vaka ve yaklaşık 609.000 ölüm tahmin edilmektedir. Erkek ve kadınlardaki kanserlerin yaklaşık %10'unu oluşturmaktadır.. Otofaji, hücresel proteinlerin otofajik vakuoller aracılığı ile lizozomal degredasyonudur. Otofaji gelişimde, uzun yaşamda ve kanser gibi pek çok hastalığın patogenezinde büyük rol oynamaktadır. Tümör gelişimi ve uyarılması üzerine bazı etkiler gösterdiği saptanmıştır. Bu çalışmanın amacı, otofajinin, otofaji ilişkili ATG5 , ATG12 ve Beclin-1genlerinin ve proteinlerinin ekspresyonu ve kolorektal kanserin klinikopatolojik özellikleri ile ilişkisinin belirlenmesidir. Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Genel Cerrahi Anabilim Dalında kolorektal kanser nedeniyle opere edilen 45 hasta dahil edildi. Hastaların hem tümör hem de eşlenik normal kolon dokularından alınan örnekler ameliyathaneden itibaren sıvı azotta bankalandı. Daha sonra SYBR Green qPCR yötemiyle ATG5, ATG12, Beclin-1 gen ekspresyonlarına ve Western Blot yöntemiyle ATG5 , Beclin-1 , LC3 protein ekspresyonlarına bakıldı.Ekspresyon düzeyleri ile klinikopatolojik özellikler karşılaştırıldı. Gen ve protein ekspresyonları hem tümör hem de eşlenik normal doku örneklerinin çoğunda saptandı. Gen ekspresyon düzeyleriyle klinikopatolojik ve demografik veriler arasında anlamlı ilişki saptanamadı.Örneklerin TNM evreleriyle perinöral invazyon ve lenfovasküler invazyon arasında anlamlı ilişki saptandı. Bu çalışmanın sonuçları otofajinin kolorektal karsinogenezisde işe karıştığını önermektedir. Genişletilmiş çalışmaların yapılması otofaji ve kolorektal kanser ile ilişkili klinikopatolojik özellikleri belirlemede faydalı olabilecektir.
Otofaji ile ilişkili mikroRNA'ların akciğer kanserindeki rollerinin araştırılması
Akciğer kanseri, tüm kanser türleri arasında ülkemizde ve dünyada kansere bağlı ölümlerde ilk sırada yer almaktadır. Cerrahi müdahele, radyoterapi ve kemoterapi, tümör büyümesini azaltabilir, ancak genellikle nüks görülür. Otofaji, hasarlı organallerin ve uzun ömürlü proteinlerin lizozomal yıkımını kapsayan hücresel bir süreçtir. Kanserin erken evrelerinde tümör baskılayıcı olarak görev yapar ve genomik kararsızlığın azaltılması yönünde çalışarak kanser oluşumunu engeller, fakat ilerleyen evrelerde hasarlı protein ve organellerin yıkılıp, kanserli hücreye besin kaynağı olarak geri kazandırılmasına ve hücrenin kemoterapiye karşı direnç geliştirmesine katkı sağlar. Bu nedenle son yıllarda sitotoksik kemoterapi ile birlikte otofaji inhibisyon stratejileri de önerilmeye başlanmıştır. Bu tez çalışmasında, küçük hücre dışı akciğer kanseri modeli olan A549 ve HTB-54 hücre hatlarında miR-96-5p, miR-101-3p ve miR-138-5p'nin otofajiyi nasıl düzenlediklerinin araştırılması ile tedavi edici özelliklerinin olup olmadığının gösterilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla sitotoksisite, apoptozis, hücre proliferasyonu, koloni oluşumu, hücre göçü ve otofaji süreçleri üzerindeki olası etkilerinin araştırılması için çalışmalar yapılmış, her üç mikroRNA'nın da otofajiyi baskıladığı ve ayrıca tümör baskılayıcı gibi davranarak hücre proliferasyonu ve hücre göçünü azalttığı da gösterilmiştir. MiR-96-5p'nin otofaji genlerinden ATG9A'yı, miR-101-3p'nin ATG4D'yi hedefleyerek otofajiyi baskıladıkları gösterilmiş, miR-138-5p için hedef tanımlanamamıştır. Bu mikroRNA'ların otofajiyi inhibe ederek, akciğer kanseri hücrelerinin sağ kalımını azaltması, onların akciğer kanseri tedavisinde potansiyel yeni birer aday olabileceklerini göstermiştir.
Besin kısıtlamasının ve açlığın gebe farelerin plasentalarında ve fetuslarında otofaji ve sirtuin belirteç düzeylerine etkisi
Açlık genel anlamda insanlarda 12 saat ile üç hafta periyotları arasında değişen hiç veya az miktarda yiyecek alınmasıdır. Besin kısıtlaması; tüm besin değerlerinin değiştirilmeden ad libitum diyetinin(günlük gıda alınımı) yüzdesel olarak azaltılması olarak tanımlanır. Otofaji, çeşitli stresli durumlara besin yoksunluğu, oksidatif stres ve DNA hasarı gibi cevaben hücresel homeostazı korumak için uyarıldığı bilinmektedir. Otofajinin düzenlenmesinde Sirt1 ve Sirt2 için çok yönlü rolleri tanımlamıştır. Sirt1, otofajiyi, otofaji genlerinin (Atg) 5, 7 ve 8 ürünleri gibi otofaji indüksiyon ağının temel bileşenlerinin deasetilasyonu yoluyla doğrudan etkilediği bilinmektedir. Bu çalışmada fareler kontrol, Oruç, S-24, S-48, 1W, 2W, 3W olmak üzere 7 gruba ayrıldı. Gebeliğin 18.5 gününde anneden fetüs ve plasenta alınarak ağırlıkları ve boyları değerlendirildi. Besin kısıtlaması ve açlık uygulanmış farelerin SİRT1, SİRT2, ATG5 ve LC3/AB gibi genlerin organ bazında ve plasenta bölgesel açısından immünohistokimyasal ekspresyon düzeylerine bakıldı. Morfolojik değerlendirme için fetüs ve plasentaların Hematoksilen- Eozin boyamaları yapıldı. Deney sonuçlarına göre besin kısıtlaması ve çeşitli açlık uygulamalarının maternal farelerin fetüs ve plasenta ağılık ve boy ölçümleri arasında anlamlı olarak düşük saptanmıştır. Besin kısıtlaması ve açlık gruplarında immünohistokimyasal sonuçlarına göre plasentada anlamlı bir farklılık görülmemiştir. Ancak fetüs için organ bazında SIRT-1 belirteci için kalp ve sol ekstremite, ATG-5 belirteci için bağırsak ve LC3/AB belirteci için ise karaciğer dokularında anlamlı bulgular bulunmuştur. Bu çalışmanın deney sonuçları doğrultusunda besin kısıtlaması ve çeşitli açlık grupları ve SIRT-1, ATG-5 ve LC3/AB belirteçleri etkili olmakta ve ekpresyon düzeylerini etkilemektedir.
Prematüre ovaryan yetmezlik modelinde foliküler atrezi ile granüloza hücrelerinin hücre ölüm mekanizmaları açısından ilişkisinin incelenmesi
Amaç: Prematüre ovaryan yetmezlik (POY) özellikle 40 yaşından önce kadınlarda klinik olarak amenore, yüksek gonadotropin ve düşük östrojen seviyeleri ve ovaryumda gelişen folikül kaybına bağlı ovaryum rezervlerinin erken tükenmesi ile ortaya çıkan önemli bir infetilite nedenidir ve etiyolojisi hala tam olarak anlaşılamamıştır. Ovaryumda oosit ve folikül gelişimine metabolik destek sağlayan granüloza hücrelerinin aşırı kaybı ile tetiklenen foliküler atrezi sürecinde rol oynayan hücre ölüm mekanizmalarının araştırılması yeni tedavi protokollerinin geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Son zamanlarda POY etiyolojisinin araştırılmasında kematerapötiklerle indüklenmiş hayvan modelleri kullanılmaktadır. Kanser tedavisinde yaygın olarak kullanılan bir kemoteröpatik ajan olan siklofosfamid, ovaryumlara sitotoksik etki yaparak foliküler atreziyi tetiklemektedir. Çalışmamızda, siklofosfamid ile C57BL/6 cinsi dişi farelerde prematüre ovaryan yetmezlik modelinin oluşturulması, alınan kan ve doku örnekleri ile modelin oluşumunun biyokimyasal ve histopatolojik yönden doğrulanması ve foliküler atrezi sürecinde rol oynayan hücre ölüm mekanizmalarından apoptoz, otofaji ve paraptozun immünohistokimyasal yöntemlerle değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Gereç Yöntem: C57BL/6 cinsi dişi fareler rastgele kontrol, sham ve POY olmak üzere 3 gruba ayrıldı (n:6, herbir grup için). Prematüre ovaryan yetmezlik modeli siklofosfamid uygulaması ile oluşturuldu. Kontrol grubuna herhangi bir uygulama yapılmadı. POY grubuna siklofosfamid, sham grubuna ise aynı oranda serum fizyolojik uygulandı. Siklofosfamid 3 hafta boyunca her 2 günde 1 intraperitoneal, ilk doz 70 mg/kg, devam eden dozlar 30mg /kg olarak uygulandı. 3 hafta sonunda hormon serum seviyelerinin analizi için tüm gruplardan genel anestezi altında intrakardiyak 3ml kan alındıktan sonra hayvanlar servikal dislokasyonla sakrifiye edilerek ovaryumları alındı ve histolojik takip yöntemleri uygulanarak elde edilen kesitlere histopatolojik değerlendirme için hematoksilen-eozin boyaması yapıldı. Tüm gruplara ait kesitlerde ışık mikroskobu altında folikül sayımı yapıldı. Kanda serum FSH, LH ve östradiol seviyeleri ELİSA yöntemiyle çalışıldı. Hücre ölüm mekanizmaları belirteçlerinden apoptoz için kaspaz 3, kaspaz 8 ve kaspaz 9, otofaji için Lamp1 ve MAP LC3β, paraptoz için ise GRP78 ve CHOP primer antikorları ile immünohistokimyasal boyama yapıldı. Apoptotik hücre varlığının tespiti için TUNEL analizi uygulandı. Sonuçlar istatistiksel olarak değerlendirildi. Bulgular: Kontrol ve sham grubuna göre POY grubunda serum FSH ve LH seviyelerinde artış gözlenirken östradiol seviyelerinde düşüş saptandı. Gruplardan alınan ovaryum dokularının histopatolojik değerlendirmesinde, kontrol ve sham grubuna oranla POY grubunda ovaryum dokusundaki bozulma, foliküler atrezinin bir belirteci olan gelişen folikül kaybı ve atrezik folikül sayısında belirgin bir artış gözlendi. Folikül sayımı ile kontrol ve sham grubuna göre POY grubunda gelişen folikül sayısının azaldığı benzer oranda atrezik foliküllerde artış olduğu izlendi. İmmunohistokimyasal boyamalar sonucunda; kaspaz 3, kaspaz 8 ve kaspaz 9 immünoreaktivitesi kontrol ve sham grubunda hafif, POY grubunda ise kaspaz 3 hafif/orta, kaspaz 8 ve kaspaz 9'un orta şiddette; Lamp1 ve MAP LC3β immünoreaktivitesi kontrol ve sham grubunda hafif, POY grubunda ise Lamp1 hafif/orta, MAP LC3β orta şiddette; CHOP ve GRP78 immünoreaktivitesi kontrol ve sham grubunda hafif, POY grubunda ise orta şiddette gözlendi. TUNEL analizi sonucunda, POY grubu ovaryum kesitlerinde kontrol ve sham grubuna göre daha fazla apoptotik hücre tespit edildi. Sonuçlar: Prematüre ovaryan yetmezlik modelinin siklofosfamid uygulaması ile C57BL/6 dişi farelerde başarılı bir şekilde oluşturulduğu biyokimyasal ve histopatolojik olarak doğrulanmıştır. Foliküler atrezi sürecinde görülen hücre ölüm mekanizmalarından apoptoz, otofaji ve paraptozun varlığı immünohistokimyasal olarak gösterilmiştir. TUNEL analizi ile hastalık grubundaki apoptotik hücre artışı tespit edilmiştir. Bu çalışmada prematüre ovaryan yetmezliğe yol açan foliküler atrezi sürecinde apoptoz ve otofajinin yanı sıra paraptozun da rol aldığının gösterilmesi, yeni tedavi protokollerinin geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Anahtar Kelimeler: Prematüre Ovaryan Yetmezlik, Siklofosfamid, Foliküler atrezi, Apoptoz, Otofaji, Paraptoz
T98 ve U87 kanser hücre hatlarında betulinik asidin otofajik etkilerinin araştırılması
Beyin tümörlerinin %50'sini oluşturan Glioblastoma multiforme (GBM)'ye karşı tedavi seçenekleri, Kan beyin bariyeri (KBB) nedeniyle sınırlıdır. Beyaz huş ağacından (Betula sp.) izole edilen Betülinik asit (BeA) KBB'yi geçerek beyne ulaşabilen bir pentasiklik triterpenoiddir. BeA, somatik hücrelerde düşük sitotoksik etki ve tümör hücrelerinde yüksek apoptozis ortaya koyar. Bu nedenle, çalışmamızda BeA'nın iki farklı GBM hücre hattında apoptotik etkisinin incelenmesi amaçlanmıştır. 3-(4,5-dimetiltriazol-2-il)-2,5 difeniltetrazolium bromid (MTT) ile IC50 ve monodansilkadaverin (MDC) ile rapamycin ve chloroquine dozu belirlenmiş ve dozlar kombinasyon olarak da uygulanarak otofaji inhibisyonu ve aktivasyonunda BeA'nın etkisi incelenmiştir. İmmünfloresan ve western blotting teknikleriyle eNOS, iNOS, LC3-I-II proteinlerinin miktarı ve yerleşimleri, MDC ile veziküllerdeki değişimler, JC-1 ile mitokondriyal zar potansiyelinde (MMP) oluşan değişiklikler ve ANNEXIN-V/PI flow sitometri ile sağlıklı-apoptotik-nekrotik hücre oranları ölçülmüştür. BeA uygulamasının apoptozisi iki hücre hattında da arttırdığı, otofaji inhibisyonu ve aktivasyonu ile de iki katına çıkardığı belirlenmiştir. BeA'nın yüksek otofajik etki göstermediği, ancak MMP'yi bozduğu bulunmuştur. Kombinasyonlarda MMP hasarı artmış olup, hasar BeA+rapamycin grubunda daha yüksektir. Bu bulgular BeA'nın otofajik yolu kullanmayarak mitokondriyal yoldan apoptozisi başlattığını göstermektedir. BeA uygulamasında eNOS ve iNOS ekspresyonu iki hücrede de değişmemiş, ancak kombinasyon gruplarında ekspresyon artmıştır. Çalışmamızda BeA'nın GBM hücrelerinde apoptozisi tetiklediği, ancak apoptozisin otofajik inhibitör veya aktivatör kombinasyonlarında daha çok arttığı ve apoptozisin mitokondri kaynaklı olduğu gösterilmiştir. eNOS ve iNOS ekspresyonunun kombinasyon gruplarında yükselmesi mitokondriyal strese bağlı oksidatif stresle ilişkilidir. Sonuç olarak BeA, GBM hücrelerinde apoptozisi tetiklemekte, ancak otofaji aktivatör ve inhibitörleri ile birlikte uygulanması hücre ölümünü önemli ölçüde arttırmaktadır. Dolayısıyla, BeA'nın kemoterapötik etkisi otofajik mekanizmalar ile arttırılabilir ve GBM üzerinde tedavi amacıyla kullanılabilecek yeni bir kemoterapötik ajan olarak kullanılabilir.
Glı̇omasferlerde tı̇yorı̇dazı̇n aracılı hücre ölüm çeşı̇tlerı̇nı̇n araştırılması
Klasik in vitro çalışmalarında kullanılan monolayer (2B) hücre kültür yöntemi in vivo araştırmalara ön veri elde etmede yetersiz kaldığı öne sürülmektedir. Son yıllarda kullanılmaya başlanan sferoid (3B) hücre kültür yöntemi, hücrelerin in vivo koşullarındaki mikroçevre ve hücre-hücre etkileşimini oluşturmayı hedefleyen bir yöntemdir. Bu sayede in vitro koşullarda elde edilen veriler in vivo koşullara daha fazla benzerlik sağlayacağı düşünülmektedir. Yetişkinlerde gözlenen malign beyin tümörlerinden biri olan glioblastoma multiforme (GBM) IV Evre Astrositomdur. Cerrahi operasyon, kemoterapi ve radyoterapi tedavilerine rağmen sağ kalım oranı 12-15 aydır. Anti-psikotik bir ajan olan Tiyoridazin (THZ)' in yapılan çalışmalar doğrultusunda anti-kanser özelliği olduğu ortaya konmuştur. Buradan yola çıkarak monolayer ve sferoid hücre kültürlerinde karşılaştırmalı olarak THZ' nin GBM hücre hatları T98G ve U-87 MG üzerindeki sitotoksik etkileri ve tetiklediği ölüm mekanizmaları ortaya konulması amaçlanmıştır. Sferoid hücre kültürlerini oluşturmak amacıyla asılı damla yöntemi kullanılmıştır. THZ' nin monolayer ve sferoid kültürlerdeki sitotoksik etkisi MTT yöntemi ile ölçülmüştür. Ölüm mekanizmasının belirlenmesi amacıyla da Muse hücre analiz cihazıyla uyumlu testler ve ölüm yollarına spesifik inhibitörler kullanılmıştır. Monolayer ve sferoid hücre kültürlerine ayrı ayrı yapılan sitotoksisite deneyleri sonucunda IC50 değerleri sırasıyla 12,67 µM (monolayer T98G 24 saat), 29,30 µM (sferoid T98G 24 saat), 12,80 µM (monolayer U-87 MG 24 saat), 28,68 µM (sferoid U-87 MG 24 saat) olarak bulunmuştur. THZ' nin monolayer ve sferoid hücre kültürleri üzerindeki sitotoksik etkisinin otofaji mekanizması üzerinden tetiklendiği Muse hücre analiz yöntemi ve ölüm yoluna özgü inhibitörler aracılığıyla belirlenmiştir. Çalışmamızda THZ' nin hücresel etkisinin monolayer ve sferoid GBM kültürlerinde farklılık gösterdiği ilk kez ortaya konuldu. Bu çalışmanın bulguları ışığında ileride yapılacak in vitro sitotoksisite çalışmalarının sadece monolayer kültürlerde değil aynı zamanda in vivo' ya benzerliği açısından sferoid kültürlerde de yapılması önerilmektedir. Bununla birlikte, GBM hücre hatlarında THZ' nin sitotoksik etkisinin otofaji yolağı üzerinden etkili olduğunun tespit edilmiş olması bu ilacın, apoptozu uyaran kemoterapötiklere karşı dirençli olan GBM tedavisinde kullanılabilecek bir ajan olduğunun düşünülmesine neden olmaktadır. Anahtar kelimeler: Sferoid (3B) hücre kültürü, Monolayer (2B) hücre kültürü, Glioblastoma, Tiyoridazin, Sitotoksisite, Apoptozis, Otofaji.
Sıçanlarda otofaji inhibitörü 3-metiladenin ve aktivatörü rapamisinin üreme ilişkili parametreler üzerine etkilerinin araştırılması
Otofaji üreme döngüsü içerisinde primordial folikül, sperm gelişiminden embriyogenez ve plasenta gelişimine kadar birçok işlevde görev almaktadır. Mevcut çalışmada otofaji inhibitörü 3-Metiladenin ve aktivatörü Rapamisinin dişi ve erkek sıçanlarda üreme sistemi üzerine etkilerinin araştırılması amaçlandı. Çalışmada 32 erkek ve 32 dişi olmak üzere toplam 64 adet Wistar albino cinsi sıçan her grupta 8 hayvan olacak şekilde kontrol, sham (distile su 1 mL/gün), 3-Methiladenin (15 mg/kg/gün), Rapamisin (2 mg/kg/gün) olmak üzere 8 gruba ayrıldı. Uygulamalar oral gavaj ile toplam 40 gün yapıldı. Uygulanan ilaçların dişi ve erkek üreme sistemi üzerine etkilerinin belirlenmesi için spermiogram, ELISA, histolojik ve moleküler analizler kombine edilerek kullanıldı. Erkek sıçanlarda 3-MA'nın anormal kuyruk oranında artışa, testosteron seviyesinde ve RBM9, BAX, BCL2, CASP7, CASP3, APAF1 mRNA gen ekspresyon seviyesinde azalmaya, RAPA'nın ise testosteron seviyesinde ve RPS6 mRNA gen ekspresyon seviyesinde azalmaya; RBM9, RPL4, SITC, BCL2, APAF1 mRNA gen ekspresyon seviyesinde artışa neden olduğu belirlendi. Dişi sıçanlarda ise 3-MA'nın AMH seviyesinde azalma ve GDF9 mRNA ifadesinde artışa; RAPA'nın ise AMH seviyesinde ve RPS6 mRNA gen ekspresyon seviyesinde azalmaya neden olduğu gösterildi. Otofajik düzenlenmenin 3-MA ve RAPA gibi dışarıdan verilen çeşitli moleküllerle aktive edilmesi veya inhibe edilmesinin hem erkek hem de dişi sıçanlarda hormon profillerini ve gametogenezde etkili gen ifadelerini bozabileceği veya değiştirebileceği belirlenmiştir.
İnfertil erkeklerin semen örneklerinde otofaji ilişkili genler ve uzun kodlamayan ribonükleik asit (RNA) gen ifadelerinin araştırılması
Son zamanlarda yapılan çalışmalarda, uzun kodlamayan RNA (long non-coding RNA; lncRNA)'ların spermatogenez sürecinde görev aldıkları ortaya konmuştur. Mevcut çalışmada testis dokusunda ve sperm örneklerinde varlığı saptanan bazı lncRNA'ların ifadelerinin normospermik ejakulat örnekleriyle infertil bireylerden elde edilen belirli anomalilere sahip ejakulat örneklerinde karşılaştırılması amaçlamıştır. Çalışmaya 30 sağlıklı kontrol, 30 astenospermia, 30 teratospermia ve 30 oligoastenoteratospermia'lı birey dahil edildi. Bu bireylerden rutin spermiogram analizleri sırasında elde edilen ejakulat örnekleri toplandı. Ejakulat örneklerinde qRT-PCR yöntemi ile 8 tane otofaji ilişkili lncRNA ve 4 tane otofaji ilişkili gen olmak üzere totalde 12 genin ifade profilleri analiz edildi. Kontrol grubuna göre analiz edilen gen ifadelerinin asteno ve teratospermia gruplarında anlamlı olarak değişmediği ancak oligoastenoteratospermia grubunda H19, HOTAIR, MALAT1, NBR2, HULC, ROR, ATG7 ve LC3 gen ifadelerinin anlamlı olarak arttığı; TGFB2, MEG3, Beclin1 ve ATG5 gen ifadesinin ise değişmediği gözlendi. LC3 ifadesinin kontrole göre oligoastenoteratospermia grubunda anlamlı olarak arttığı gözlendi Otofaji indükleyici lncRNA ve genlerin oligoastenoteratospermi hastalarda yüksek miktarda ifade edildiği belirlendi. Bu veri özellikle oligoastenoteratospermia etyopatogenezinde otofajide görevli lnc-RNA'ların ve genlerin ifade artışlarının önemli roller oynayabileceğini ve otofajik düzenlenmenin ciddi bir şekilde bozulduğunu göstermektedir. Özellikle oligoastenoteratospermia hastalarında otofajik baskılayıcıların terapotik birer hedef olabileği öngörülmektedir.
Deneysel ülseratif kolit modelinde, Lycium barbarum'un (goji berry) apoptozis ve otofajideki rolü
Ülseratif kolit dünyada sıklıkla görülen bağırsak hastalıkları içerisinde yer almaktadır. Lycium barbarum (Goji Berry) antioksidan, antimikrobiyal, antiaging, antiinflamatuar etkileri olan, alternatif tıpta sıklıkla kullanılan bir meyve türüdür. Lycium barbarum'un (LB) bağırsak hastalıklarına etkisi kapsamlı olarak araştırılmasına rağmen ülseratif kolit modelinde, apoptozis ve otofajik yolak üzerindeki etki mekanizması henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu çalışmada; ülseratif kolit modeli üzerinde LB'un apoptozis ve otofaji yolağa etkisi araştırılmıştır. Araştırmada Wistar albino cinsi erkek sıçanlar, ülseratif kolit modeli oluşturmak için DSS kimyasalı, kolit oluşumunu engellemek amacıyla LB kullanılmıştır. Çalışmamızda DSS grubuna kıyasla LB+DSS grubunda; p53 ve Beclin 1 protein ekspresyon seviyelerinin arttığı, TIGAR protein ekspresyon seviyesinin azaldığı, MDA düzeyinin azaldığı, GSH düzeyinde ve katalaz aktivitesinde ise artış olduğu, ayrıca histopatolojik sonuçlarda ise LB+DSS grubunda ülseratif kolitin oluşmadığı belirlenmiştir. Genel olarak bulgularımız LB'un ülseratif kolit oluşumunu engellediği, oluşan hasarı azalttığı, savunma ve apoptozis/otofaji mekanizmalarını aktifleştirdiğini göstermektedir. Çalışmada elde ettiğimiz sonuçlar, bir bütün olarak değerlendirildiğinde LB'un ülseratif kolit oluşumunu engelleyen umut verici potansiyele sahip olduğunu söyleyebiliriz.
İnsan prostat kanser PC-3 hücre hattında TRPM2 iyon kanalının otofajik yolaklardaki rolünün araştırılması
Prostat kanseri, dünyada erkekler arasında önde gelen sağlık problemlerinden biridir. Son zamanlarda etyopatogenezine otofajik yolakların da katkıda bulunduğu gösterilmiştir. Otofajinin kilit düzenleyicisi olarak tanımlanan hücre içi kalsiyum düzeyleri kalsiyum kanalları tarafından düzenlenmektedir. Bir kalsiyum kanalı olan TRPM2'nin oksidatif stres aracılı apoptozda görevlidir. Reaktif oksijen türlerinden biri olan H2O2'in hem TRPM2'yi hem de otofajiyi aktive ettiği gösterilmesine rağmen oksidatif stress aracılı otofajik yolaklarda TRPM2'nin rolünün olup olmadığı bilinmemektedir. Bu çalışmada, prostat kanseri PC-3 hücre hattında, otofajik yolaklarda TRPM2'nin rolünün araştırılması amaçlanmıştır. PC-3 hücre hattında, otofajik ve apoptotik yolaklar ve TRPM2'nin aktivasyonu için H2O2 uygulandı. TRPM2, otofajik ve apoptotik aktiviteler sırasıyla; siRNA, 3-MA ve z-VAD-fmk uygulamalarıyla engellendi. Yapılan her uygulama sonucunda TRPM2, otofaji ve apoptoz ile ilişkili genlerin mRNA ekspresyon profilleri kantitatif RT-PZR ile ortaya konuldu. Otofajik aktiviteyi belirlemek amacıyla AO-EB boyaması yapıldı. H2O2 uygulamasının hücre canlılığını azalttığı ve z-VAD-fmk+H2O2 uygulamasının, 3-MA+H2O2 uygulamasına kıyasla daha fazla hücre ölümüne neden olduğu belirlendi. H2O2 uygulaması kaynaklı hücre ölümünün TRPM2-siRNA+H2O2 uygulamasından az da olsa fazla olduğu tespit edildi. BAX ve TP73 gibi apoptotik genlerin ekspresyonlarının H2O2, TRPM2-siRNA+H2O2, 3-MA+H2O2 ve TRPM2-siRNA+3-MA+H2O2 uygulamalarında kontrole kıyasla arttığı belirlendi. z-VAD-fmk+H2O2 uygulamasının otofajik süreçlerde yer alan genlerin ekspresyonlarını arttırdığı bulundu. TRPM2-siRNA+z-VAD-fmk+H2O2 uygulaması sonucu, otofajik gen ekspresyonlarının kontrole benzer olduğu belirlendi. Verilerimiz, H2O2'in genel olarak hem otofajik hem de apoptotik yolaklar için aktivatör olduğunu ve bu etkisini TRPM2 aracılı olarak gerçekleştirdiğini göstermektedir. Ayrıca TRPM2-siRNA uygulamasının H2O2 indüklü otofajik yolakları baskılarken apoptotik yolakları aktive ettiğini vurgulamaktadır. Sonuç olarak; TRPM2'nin, otofajik yolaklardaki rolünün tam olarak aydınlatılabilmesi için daha detaylı moleküler genetik çalışmalar yapılmalıdır.
İnsan akciğer kanser LC-3 hücre hatlarında TRPM5 iyon kanalının otofajik hücre ölümündeki rolünün araştırılması
ÖZET Otofajik yollar, akciğer kanseri (LC) etiyopatojenezisine katkıda bulunurlar. Otofajinin anahtar düzenleyicisi olarak tanımlanan hücre içi kalsiyum seviyeleri, kalsiyum kanalları tarafından kontrol edilir. Geçici potansiyel metastatin 5'in (TRPM5) otofajik yollarda rolünün olup olmadığı bilinmemektedir. Bu çalışmada, akciğer kanseri A459 hücre hattındaki otofajik yol üzerinde, bir kalsiyum kanalı olan TRPM5'in rolünün araştırılması amaçlanmıştır. A459 %5 CO2, % 95 hava ile 37°C'de nemlendirilmiş bir inkubatörde % 5 fetal bovin serumu içeren RPMI-1640 ortamında oluşturuldu. A459 hücre dizisindeki TRPM5, siRNA aracılığıyla bloke edildi. A459 hücrelerinden RNA izolasyonu ise üçlü reaktif ile yürütüldü. Otofaji ile ilişkili genlerin mRNA ifade şekilleri kantitatif RT-PCR (qRT-PCR) ile gösterildi. Transient Receptor Potential Melastanin 5-siRNA grubundaki TRPM5 mRNA expresyon düzeyinin, kontrol grubuna göre anlamlı derecede azalmış olduğu görüldü. siRNA verimliliği ise qRT-PCR verileri kullanılarak % 83 olarak hesaplandı. Ayrıca, qRT-PCR sonuçları kontrol grubu ile karşılaştırıldığında TRPM5-siRNA grubunda, otofaji ile ilgili genler olan ATG3, ATG5, ATG10, ATG12, LC3A, LC3B, LAMP3BECLIN1, AMBRA1, ULKE3 seviyelerinde belirgin bir artış olduğu gösterildi. Transient Receptor Potential Melastanin 5-siRNA uygulaması, otofajik yollardaki genlerin ekspresyonunu açıkça arttırmaktadır. Bu veriler, TRPM5 supresyonunun, otofajik mekanizmaları harekete geçirebileceğini göstermiştir. Kanserde, otofajinin, hücrelerin hem sağkalımına hem de ölümüne yol açabilen iki farklı fonksiyon gösterebileceği tespit edilmiştir. TRPM5 ile ilişikili otofajın tespit edilmesi ile TRPM5 otofajisi hedef alınarak inhibisyon ya da aktivasyon yapılabilir. Bu durum, hücrelerin otofajik ölümüne yol açan kanser tedavilerinin geliştirilmesine katkıda bulunabilir. Anahtar Kelimeler: Akciğer kanseri, otofaji, TRPM5 iyon kanalları, Hücre kültürü, qRT-PCR.
Besin açlığı durumunda sıçan ince barsak dokusunda BECN1 (beclin 1) immün lokalizasyonu
Maya Atg6'nın memeli ortoloğu olan Beclin 1, hücresel stres periyotları sırasında artan, programlı bir hücre sağkalım süreci olan otofajide merkezi role sahip bir proteindir. Açlık, ökaryotik organizmalarda hücresel homeostaziyi sağlamak için otofajiyi uyarmaktadır. Yapılan çalışmalar otofaji proteinlerinin bağırsak bağışıklığı, bariyer görevi ve bağırsak homeostazında temel bir role sahip olduğunu göstermektedir. Ancak açlık ile uyarılan otofajide sıçan ince bağırsak dokusunda Beclin 1'in immün ekspresyonuna dair bilgiye rastlanılmamıştır. Bu çalışma ile 12, 24, 36 ve 48 saat açlığa maruz bırakılan sıçanların ve ad libitum beslenen kontrol grubunun ince bağırsak dokularında Beclin 1 immün ekspresyonu araştırılmıştır. Çalışmada kontrol ve açlık gruplarındaki sıçanlardan immünohistokimya (IHC) analizleri için ince bağırsak doku örnekleri toplanmış, Beclin 1 immün lokalizasyonları belirlenmiş ve elde edilen sonuçlar semiquantitatif olarak değerlendirilmiştir. Çalışma sonucunda kontrol grubu ve açlık gruplarının hepsinin ince bağırsak dokularında Beclin 1 immün ekspresyonlarının pozitif olduğu ancak gruplar arası anlamlı ekspresyon farklarının olmadığı görülmüştür.
Autophagy regulates sex steroid synthesis in human ovary
Autophagy is an evolutionarily conserved process that aims to maintain the energy homeostasis of the cell by recycling long-lived proteins and organelles. Emerging data indicates that autophagy also regulates lipid metabolism in a process called lipophagy. Here we describe a novel role of autophagy in steroid biosynthesis in human ovary. Pharmacological inhibition or genetic interruption of autophagic process through silencing of autophagy genes (Beclin1 and ATG5) via siRNA technology significantly compromised steroidogenesis and resulted in a dose-dependent and progressive decline in basal and gonadotropin-stimulated progesterone (P4) production of the explant cultures of corpus luteum and the primary human granulosa cells. Blockage of autophagy was also associated with a marked cytoplasmic accumulation of the lipid droplets (LDs), which strongly co-localized with autophagy substrates (LC3 and SQSTM1/p62) and lysosome. Furthermore, we found that the expression of the autophagy genes, the co-localization of the LDs with autophagosome and lysosome are defective and, autophagy-mediated steroidogenesis are compromised in the corpora luteae of the patients who had clinically documented luteal phase defect due to their inability to produce P4 in sustainable levels to maintain pregnancy and prevent miscarriage. More interestingly, pharmacological induction of autophagy with rapamycin together with luteotropic hCG administration had a synergistic effect on steroidogenesis and autophagy and drastically corrected defective P4 production in the luteal GCs of these patients in vitro. Taken collectively these findings suggest that autophagy plays a pivotal role in basal and gonadotropin-stimulated steroidogenesis by promoting the association of the LDs with lysosome to deliver the lipid cargo within the LDs to lysosomes for degradation in order to release free cholesterol required for steroid synthesis in human ovary. Given that P4 hormone is essential for preparation of endometrium for implantation and maintenance of pregnancy, our findings may have significant clinical implications and open a new avenue in the treatment of infertility, pregnancy-related complications, and miscarriages in human.
Cancer dormancy-related changes in immune checkpoint molecules and the role of autophagy
Recurrence or relapse of cancer is very critical in the progression of the disease and related deaths. It is caused by metastasis, immune response and drug resistance-related mechanisms. Cancer cell dormancy emerges as an important determinant of cancer recurrence. Immune surveillance is one of the mechanisms that limits the number of dormant cancer foci. Therefore, understanding the mechanisms of interaction between dormant cells and components of the immune system is of great importance. Moreover, the role of autophagy in this context is not clear. In this study, 2D and 3D cancer models of dormancy have been developed and characterized, and co-culture systems with immune cells have been established. Using these models and systems, a set of immune checkpoint molecules that are differentially regulated in dormant cancer cells compared to proliferative counterparts, have been identified. We focused on one of the immune checkpoint genes/proteins that were differentially expressed in dormant cancer cells compared to actively proliferating counterparts. We also analyzed the role of autophagy in dormancy-related immune checkpoint responses. Our study underlines the importance of less studied immune checkpoint molecules and autophagy in dormant cancer-immune cell interactions, affecting anti-cancer immune responses. The study provides a battery of drug targets for the development of novel anti-cancer and anti-dormancy immune checkpoint inhibitors.
Böbrek kanseri hücre hatlarında cabozantinibin otofajik etkinliğinin in vitro değerlendirilmesi
Otofaji, hücrenin strese karşı zarar görmüş bileşenlerinin lizozomlar aracılığıyla parçalanarak geri dönüştürülmesini kapsayan bir mekanizmadır ve birçok kanserde ikili bir rol üstlenerek hücre koruyucu veya hücreyi ölüme götüren bir süreç olarak çalışabilir. Renal hücre karsinomları (RHK) tedavisinde birçok farklı anti-kanser ilaç kullanılsa da tedavi sonrası ilaç direnci nedeniyle beş yıllık sağ kalım oranı %10'dur ve bu dirençten büyük oranda otofajinin sorumlu olduğu düşünülmektedir. Cabozantinib RHK tedavisi için 2016 yılında FDA tarafından kabul edilen ve sağ kalım oranını RHK'da kullanılan diğer anti-kanser ilaçlarında göre anlamlı olarak arttırdığı bilinen bir çoklu tirozin kinaz inhibitörüdür. Bu tez çalışmasında cabozantinibin A498 ve ACHN'de otofajik ve apoptotik etkinliği gösterilmiştir. Cabozantinib iki hücre hattında da LC3-II ve ULK1 birikimine neden olarak otofajiyi arttırmıştır. Otofajinin klorokin (CQ) ile baskılanması apoptozu arttırmıştır. Cabozantinib, iki hücre hattında da olasılıkla cabozantinibin mitokondrilerde birikmesinden kaynaklanan ve AMPK aracılığıyla otofajik aktivasyona neden olan mitokondriyal hiperpolarizasyona neden olmuş, hücre içindeki ROS miktarını arttırmıştır. Met inhibitörü olan cabozantinib, Met'in etkilediği ve otofajiyle ilişkili olduğu bilinen proteinlerden Akt'yi baskılasa da ERK'i güçlü bir şekilde baskılayamamıştır. Cabozantinibin hücreleri S veya G2/M fazında tuttuğu gösterilmiştir. Bu da cabozantinibin doğrudan veya dolaylı olarak DNA hasarına etki ettiğini düşündürmektedir. Sonuç olarak bu tez çalışmasından elde edilen bilgiler otofaji düzenlenmesinin RHK tedavisinde yeni yaklaşımlar sağlayacağını göstermektedir.
Malign plevral mezotelyomalarda PD-L1, PD-l2 ve CRTLA-4 ekspresyonlarının immünohistokimya ve real-time pcr yöntemleri ile araştırılması
Malign mezotelyoma %90 plevra olmak üzere, periton, perikardın seröz yüzeylerinden ve nadiren tunika vajinalisten gelişen bir tümördür. Malign plevral mezotelyoma etyolojisinde bilinen en önemli faktörler; asbest veya erionit lifleri ile temastır. Malign mezotelyoma üç temel histolojik formda görülür: epiteloid, sarkomatoid veya mikst (bifazik). Malign mezotelyoma hastalarının uzun süreli sağkalım oranı kötüdür. Bu durum immün kontrol noktalarını bloke eden antikorlar gibi yeni tedavi yöntemlerini araştırmaya yönlendirmiştir. İmmün kontrol noktaları, otoimmüniteden kaçınmak ve doku hasarını önlemek için bağışıklık sistemini kontrolden sorumludur. CTLA-4 (CD152), esas olarak T-hücrelerinde ve daha düşük oranda aktive edilmiş B-hücreleri, monositler, dendritik hücreler ve granülositlerde bulunan bir immün inhibitör reseptördür. Kanserde, ko-inhibitör yolakların baskınlığının tümörün immün sistem kontrolünden kaçınma özelliğini etkilediği gösterilmiştir. PD-1 (CD279), immünoglobülin süper ailesinin bir üyesidir. B7/CD28 kostimülatör reseptör ailesinden olan PD-1, programlanmış ölüm ligandı 1 (PD-L1; CD274) ve programlanmış ölüm ligandı 2 (PD-L2; CD273) 'ye bağlanarak T-hücre aktivasyonunu düzenler. PD-1 bağlanması, T-hücre proliferasyonunu, interferon-γ, tümör nekroz faktörü-α ve IL-2 üretimini inhibe eder ve T-hücre sağkalımını azaltır. PD-1, B7 ailesinin özellikle PD-L1 ve PD-L2 inhibitör moleküllerine bağlanır ve böylece otoimmüniteyi önler ve doku hasarından kaçınır. Bu çalışmada malign plevral mezotelyoma hastalarında immün kontrol noktası reseptörlerinden CTLA-4, PD-L1 ve PD-L2 ekspresyonu ve bu ekspresyonun tümör tipleri ile prognostik parametrelerle ilişkisini araştırmayı amaçladık. Çalışmamızda 2010 ile 2017 yılları arasında Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalında değerlendirilen plevra biyopsi, dekortikasyon ve kitle eksizyon materyalleri arasından malign plevral mezotelyoma tanısı almış 50 olgu seçildi. Olguların Dünya Sağlık Örgütü Sınıflamasına göre 44'ü epiteloid tip, 1'i sarkomatoid tip, 5'i ise bifazik tipti. Tüm olgulara immünohistokimyasal ve Real- Time PCR yöntemleri ile PD-L1, PD-L2 ve CTLA-4 çalışıldı. Hastaların ortalama sağkalım süreleri belirlendi. İmmünohistokimyasal ve Real Time-PCR çalışma sonuçları yaş, cinsiyet, histolojik alt tip ve ortalama sağkalım süreleri ile karşılaştırıldı. Grupların karşılaştırmalı analizinde Kruskal Wallis ve Mann Whitney U testleri, kategorik verilerde Ki-kare testi uygulandı. İmmünohistokimyasal çalışma sonucunda histolojik alt tip ile CTLA-4, PD-L1 ve PD-L2 ekspresyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı fark izlenmemiştir. CTLA-4 ve PD-L1 immün ekspresyonu ile hastaların sağkalım süreleri arasında da anlamlı fark izlenmemiştir. Ortalama sağkalım süresi ile immünohistokimyasal PD-L2 ekspresyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki (p=0,045) izlenmiştir. Real Time-PCR yöntemi ile yapılan çalışmada CTLA-4, PD-L1 ve PD-L2 ekspresyonları ile histolojik alt tip ve ortalama sağkalım süresi arasında anlamlı ilişki bulunmamıştır. İmmünohistokimyasal CTLA-4, PD-L1 ve PD-L2 ekspresyonu ile Real Time-PCR yöntemi ile CTLA-4, PD-L1 ve PD-L2 overekspresyonu arasında anlamlı ilişki saptanmıştır (p=0,004, p=0,001 ve p=0,029). Literatürde malign plevral mezotelyoma hastalarında PD-L1 ekspresyon derecesinin, özellikle sarkomatoid farklılaşması olan hastalarda arttığı ve kötü sağkalım ile ilişkisi olduğu görülmektedir. Çalışmamızda sağkalım ile anlamlı ilişki bulunmamasını sarkomatoid tip malign plevral mezotelyoma hasta sayımızın yetersiz olmasına bağlı olabileceğini düşündük. Ortalama sağkalım süresi ile immünohistokimyasal PD-L2 ekspresyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki izlenmiş olup, sonuçlar literatürde yer alan az sayıdaki çalışma ile benzerdir ve PD-L2 ekspresyonunun iyi prognozla ilişkili olabileceğini göstermektedir. Literatürde CTLA-4 ekspresyonunun malign plevral mezotelyomada prognostik parametreler ile ilişkisini ortaya koyan veri çok sınırlıdır. Çalışmamızda CTLA-4 gen ekspresyonu ile malign plevral mezotelyoma histolojik alt tipleri ve ortalama sağkalım arasında anlamlı ilişki saptanmamıştır.
Radyoterapi ile eşzamanlı letrozol kullanımının meme kanseri hücre hattında hücre ölüm mekanizmaları üzerine etkilerinin araştırılması
Meme kanseri dünyada üçüncü sıklıkla rastlanan kanserdir ve kadınlarda en sık görülen malignitedir. Kadınlardaki kanser olgularının %37'sinden sorumludur. Meme kanserli hastaların adjuvan endokrin tedavi standartlarında son yıllarda önemli değişiklikler olmuştur. Preklinik ve klinik çalışma sonuçlarına göre hormon reseptör pozitif tümörler moleküler, biyolojik ve klinik farklılıklar göstermektedir. Hormon reseptörü pozitif meme kanserlerinin çoğunda hormonal tedavi kullanımı sağkalım süresini uzatmaktadır. Premenapozal kadınlarda standart endokrin tedavi tamoksifendir. Reseptör pozitif postmenapozal hastalarda ise optimal adjuvan hormonal tedavi, aromataz inhibitörlerini başlangıç tedavisi olarak ya da tamoksifen tedavisi sonrasında kullanmaktır. Üçüncü jenerasyon aromataz inhibitörleri ile yapılan çalışmalarla bu ilaçların ne zaman kullanıldığından bağımsız olarak progresyona kadar geçen süre ve hastalıksız sağkalım açısından en az tamoksifen kadar etkili ve daha üstün oldukları gösterilmiştir .Meme kanserinde postoperatif radyoterapi hem yerel bölgesel hastalığı kontrol etmek, yinelemeleri engellemek, hem de sağkalımı arttırmak amacıyla kullanılır. Deneysel ve klinik çalışmalarda tamoksifenin radyoterapi ile kullanımının radyoduyarlaştırıcı etkisi ve radyoterapiye bağlı akciğer fibrozisini arttırdığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, aromataz inhibitörleriyle eşzamanlı olarak radyoterapi uygulamasının etki ve yan etkileriyle ilgili çok kısıtlı bilgi vardır. Yapılan tek bir deneysel çalışmada letrozolün meme kanseri hücrelerinin radyasyon duyarlılığını arttırdığı ortaya konmuştur.Bu çalışmanın amacı hücre kültüründe iyonize radyasyon ve letrozolün eşzamanlı kullanımının hücre ölüm mekanizmaları üzerine etkisini incelemektir.Gereç ve Yöntem:Meme kanseri hücrelerinde radyoterapi ile eşzamanlı letrozol kullanımının hüc-re ölüm mekanizmaları üzerine olan etkilerini göstermeyi hedeflediğimiz çalışmamız in vitro koşullarda hücre kültürü yöntemleri kullanılarak yapıldı ve çalışmamızda, model olarak MCF-7 aro meme kanseri hücre hattı ve kontrol grubu olarak da MCF-7 hücreleri kullanıldı.Letrozol 100 nM, 500 nM ve 1000 nM dozlarında uygulandı. Hücre hatları 1,3 ve 6 gün letrozole maruz bırakılarak, Cobalt-60 kullanılarak, 2 ve 4 Gy dozlarıyla ışınlandı. Deneyler radyoterapi sonrası 24. saatte yapıldı. Apoptotik hücre ölümü ,?Fluorometric Caspase 3 Assay Kit? ile apoptotik davranış ölçümü ve ?Annexin-V FITC Apoptoz Tespit Kiti? ile akım sitometrede PI ile boyanan ölü hücrelerin analizi ile gösterildi. Hücre hatlarında otofajide rol alan beclin geninin ekspresyonunun protein düzeyinde belirlenmesi için western blot tekniği kullanıldı. MCF-7 hücreleri ile deneyler 3 kez tekrarlandı. MCF-7 aro hücrelerinin elde edilmesinde yaşanan problemler nedeniyle , bu hücre hattıyla deneyler sadece 1 kez yapılabildi.Bulgular:MCF-7 hücrelerinde hücre ölüm mekanizması şekillerinden biri olan apoptotik ölümü Kaspaz-3 ve Annexin-V yöntemi ile değerlendirdiğimiz deneylerimizde 1, 3 ve 6 günlük letrozol maruziyeti sonrası artan ilaç ve radyasyon dozlarında; erken apoptoz, geç apoptoz ve nekroz açısından anlamlı bir fark olmadığı gözlenmiştir. MCF-7 aro hücelerinde ise Letrozol varlığında hücre ölümünde genel olarak yüksek dozlarda apoptozisde azalma görmekteyiz. Deneyler sonucu gözlenen nekrozdaki azalma, hücre ölümünün nekrozdan apoptoza kaydığını göstermektedir.MCF-7 hücrelerinde 1 günlük belirlenen dozlardaki Letrozol maruziyeti ardından 4 Gy ışınlama sonrası kontrol grununa göre otofajide bir artış gözlenmektedir. 3 ve 6 günlük Letrozol maruziyeti sonrası ise otofajide hiçbir artış izlenmemektedir.MCF-7 Aro hücrelerinde her ne kadar tekrarlanması gerekse de Letrozol'ün in-düklediği otofajiyi değerlendirdiğimizde genel olarak 2 ve 4 Gy `de kontrol grubuyla karşılaştırıldığında bir artış gözlenmektedir.Sonuç:Elde edilen veriler doğrultusunda Letrozol'ün eşzamanlı kullanımının hormon duyarlı, reseptör pozitif ve aromataz enzimi eksprese eden hücrelerde hücre ölüm mekanizmaları üzerinde olumlu etkisi olduğu söylenebilmekle beraber daha sağlıklı bilgiler verebilmek için devam eden deneylerin sonuçlarına da ihtiyaç vardır. Bu konu ile ilgili yapılmış çok fazla çalışma olmaması nedeniyle bu sonuçlar geliştirilmiş ça-lışmalarla desteklenmelidir.
Kolon kanserinde ve ilaç direncinde otofajinin rolü
Amaç: Kolorektal karsinom dünyada üçüncü en sık gözlenen kanserdir. Otofaji, hücresel proteinlerin otofajik vakuoller aracılığı ile lizozomal degredasyonudur. Otofaji gelişimde, uzun yaşamda ve kanser gibi pek çok hastalığın patogenezinde büyük rol oynamaktadır. Tümör gelişimi ve uyarılması üzerine bazı etkiler gösterdiği saptanmıştır. Bu çalışmanın amacı, otofajinin, otofaji ilişkili protein beclin-1'in ve kolorektal kanserin klinikopatolojik özellikleri ile ilişkisinin belirlenmesidir.Yöntem: Kolorektal kanser hasta doku örnekleri Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Genel Cerrahi Ana Bilim Dalı'ndan elde edildi. Tümör ve eşlenik normal doku örnekleri 36 kolorektal kanser hastadan elde edildi. Beclin-1 proteini, kolon kanser doku örneklerinde otofaji varlığını göstermek için western blotting yöntemi kullanılarak belirlendi. Beclin-1 ekspresyonu ile invazyon, metastaz ve evreyi içeren klinikopatolojik özellikler arasındaki ilişki araştırıldı.Bulgular: Beclin-1 protein ekspresyonu hem tümör hem de eşlenik normal doku örneklerinin çoğunda saptandı. Hastaların üçünde hem tümör hem de normal doku örneklerinde beclin-1 ekspresyonu saptanmadı. Beclin-1 protein ekspresyonu yalnızca iki hastanın tümör dokusunda ve dört normal doku örneğinde belirlendi. Buna karşın, kolorektal kanser hastalarının klinikopatolojik özellikleri ile beclin-1 protein ekspresyonu arasında herhangi bir korelasyon saptanmadı.Sonuç: Bu çalışmanın sonuçları otofajinin kolorektal karsinogenezisde işe karııştığını önermektedir. Genişletilmiş çalışmaların yapılması otofaji ve kolorektal kanser ile ilişkili klinikopatolojik özellikleri belirlemede faydalı olabilecektir.
Gebe farelerde steroid ile indüklenmiş prenatal stres kaynaklı fetal beyin gelişim hasarında centella asiatica'nın etkisinin incelenmesi
Gebelik süresince yavrunun maruz kaldığı stres faktörleri, prenatal stres olarak tariflenmekte ve çocuklukta ve yetişkinlikte karşılaşılan psikososyal problemlerin nedeni olarak karşımıza çıkmaktadır. Bilişsel davranışsal, fiziksel ve duygusal problemler ve otizmle, prenatal stresin ilişkisini açıklayan çokça araştırma mevcuttur. Farklı hayvan türlerinde yapılan in vivo çalışmalarda, deksametazon veya betametazon formundaki sentetik glukokortikoid tedavisinin maternal uygulanmasının, fetal nöronal hücre çoğalmasını azalttığını ve yavruların hipokampus dentat girus ve neokorteksindeki nörojenezi inhibe ettiğini gösterilmiştir. Geleneksel Asya tıbbında, yüzyıllardır birçok hastalığın tedavisinde kullanılan Centella Asiatica, Apiaceae ailesinden olan otsu ve çok yıllık bir bitkidir. Modern tıpta da özellikle cilt hastalıklarında, uzun süredir kullanılmaktadır. Yara ve yanık tedavisinde, sedef, egzema, keloid, hipertrofik skar gibi cilt hastalıklarında etkili olduğunu öne süren bilimsel araştırmalar mevcuttur. Son yıllarda yapılan bilimsel çalışmalarda Centella Asiatica'nın, cilt dışında, özellikle santral sinir sisteminde de önemli etkilerinin olduğunu öne sürmektedir. Centella Asiatica'nın nöroprotektif, anksiyolitik, antikonvülzan, nörojenik, sinaps artırıcı etkilerinin olduğu ve bu yolla Alzheimer, Parkinson, Huntington hastalığı, inme gibi durumların tedavisinde faydalı olabileceğine dair görüşler öne sürülmektedir. Çalışmamızda, gebe farelerde intraperitoneal kortizon uygulanarak prenatal stres ortamı taklit edilmiş olup, oluşan fetal beyin gelişim hasarında, oral Centella Asiatica uygulamasının etkileri incelenmiştir. Çalışmamızda, 18 adet dişi ve 9 adet erkek Balb/c cinsi fare kullanılmış ve gebelik oluşması sağlanmıştır. Fareler kontrol (n=6), deney (n=6) ve tedavi grubu (n=6) olmak üzere üç gruba ayrılmıştır. Gebeliğin 9-15. günleri arasında toplam 5 gün, kontrol grubuna intraperoitoneal yolla 1mg/kg/gün Serum Fizyolojik (SF); deney grubuna intraperoitoneal yolla 1mg/kg/gün deksametazon; tedavi grubuna intraperoitoneal yolla 1mg/kg/gün deksametazon ile birlikte oral gavaj yoluyla 1mL/kg/gün Centella Asiatica verilmiştir. 18,5. günde gebelikler sonlandırılarak, embriyo beyinleri diseke edilmiş ve formaldehitte tespit edilmiştir. Fetus boyları (cm) ve fetal beyinlerin en (cm), boy (cm) ve ağırlıkları ölçülmüş, kayıt altına alınmıştır. İnceleme için, hematoksilen-eozin boyama, krezil viyole boyama ve immünohistokimyasal boyama (Cas3 ve Lc3ß) yapılmıştır. Çalışmamızda, gebe farelere uygulanan deksametazonun, fetus beyinlerinin en, boy ve ağırlık değerlerinde anlamlı azalmaya neden olduğu gözlenmiştir. Bununla birlikte, deksametazonla birlikte Centella Asiatica uyguladığımız tedavi grubunda, fetus beyin ölçümlerinin, kontrol grubuna benzer olduğu görülmüştür. Centella Asiatica'nın apopitoza gidişi engellediğine dair kanıtlar mevcuttur. Bizim çalışmamızda da, Cas3 immunohistokimyasal boyamasıyla yapılan incelemelerde, Centella Asiatica uygulamasının apopitozu gidişi engellediği ve incelenen dönem içinde (kısa vade) hasar oluşumunu azalttığı gözlenmiştir. Centella Asiatica'nın otofaji üzerine de baskılayıcı etkileri öne sürülmektedir. Bizim çalışmamızda da, Lc3ß immunohistokimyasal boyama yöntemi ile, otofajinin, Centella Asiatica uygulanan tedavi grubunda, deney grubuna göre daha az olduğu gözlenmiştir.