Asma protoplastlarında prime düzenleme tekniğinin değerlendirilmesi

Asma hem ülkemiz hem de dünyada çok geniş bir alanda yetiştiriciliği yapılan kültürel ve ekonomik açıdan en önemli bitkilerden bir tanesidir. Asma yetiştiriciliğinde Uncinula necator mantarı sebep olduğu külleme hastalığı nedeni ile ciddi verim kaybına ve ekonomik zarara yol açmaktadır. Artan dünya nüfusu ve iklim değişikliğine bağlı olarak, geleneksel bitki ıslahı yöntemlerinin, insan beslenmesi için gereken tarımsal ürünlerin yetiştirilmesinde yetersiz kalacağı öngörülmektedir. Bu sebeple klasik ıslah tekniklerine alternatif olarak transgen içermeyen ve nükleazları kullanarak genomda hedeflenen değişiklikleri yapabilen CRISPR gibi genom düzenleme araçlarının kullanılmasının tarımsal üretimde önemi artmaktadır. CRISPR-Cas9 sisteminin yeni bir adaptasyonu olan prime düzenleme ve bu tekniğin bitkilerde daha başarılı sonuç vermesini sağlayan dual-epegRNA yaklaşımı ile bitkilerde genom düzenleme çalışmaları hızlı bir şekilde ilerlemektedir. Bitkilerde genom düzenleme çalışmalarının en uzun süren ve maliyetli basamağı bitki doku kültürü uygulamalarıdır. Bu nedenle, genom düzenleme bileşenlerinin bitki protoplastlarında test edilmesi ve doğrulanması büyük önem taşımaktadır. Bu tez çalışmasında, külleme hastalığına dayanıklılık ile ilişkili pLL3 ve pLL13, pektat liyaz benzeri genler, ile PDS geni hedef alınarak prime düzenleme ve dual-epegRNA yaklaşımı kullanılarak elde edilen DNA konstrüktleri Chardonnay protoplastlarında test edilmiş ve düzenleme verimlilikleri karşılaştırılmıştır. Tez çalışması kapsamında, Chardonnay yapraklarından optimize edilmiş protoplast izolasyon protokolü ile en yüksek 75x106/g yaprak protoplast verimi elde edilmiş, protoplast canlılığı ise %91 olarak belirlenmiştir. Optimizasyonu gerçekleştirilen PEG aracılı protoplast transformasyon metodu kullanılarak, GK plazmidleri için ortalama transformasyon verimliliği %20,25-%27,79 aralığında elde edilmiştir. Transformasyon sonrasında, protoplast DNA'ları amplikon sekanslama ile analiz edilmiş ve çalışma kapsamında elde edilen konstrüktlerin genom düzenleme verimliliği %0.16-%0.76 aralığında bulunmuştur. Kullanılan genom düzenleme tekniğinin asma protoplastlarında başarılı bir şekilde çalıştığı ve hedef mutasyonları gerçekleştirebildiği doğrulanmıştır. Çalışma kapsamında optimize edilen protoplast izolasyonu ve transformasyonu protokollerinin, bu alanda çalışan araştırmacılar için önemli bir kaynak olabileceği düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: Asma (V. vinifera L.), Chardonnay, pLL genleri, prime düzenleme, dual-epeg, protoplast izolasyonu, geçici gen ekspresyonu