358
Archived Theses
0
DOIs Assigned
0%
DOI Rate
Discipline
Aptamer temelli afinite kromatografisiyle protein C saflaştırılmasının araştırılması
Protein C (PC), K vitaminine bağımlı bir plazma proteinidir. Aktive Protein C (APC) protein C'den türeyen bir glikoproteindir. Trombin bağlı trombomodulin (T-TM) kompleksi tarafından bir aktivasyon peptitinin kırılmasıyla oluşur. Aktive Protein C güçlü bir antikoagülanttır ve kan pıhtısının parçalanmasını kolaylaştırır. Aktive Protein C pıhtılaşma kaskadında kofaktörlerini (FVa ve FVIIIa) inhibe ederek antikoagülant özelliği gösterir. PC kanda 4 μg/mL derişime sahip eser bir proteindir. Kandaki PC seviyesi azaldığında ciddi problemler gözlenir. Protein C eksikliği hastaları DVT (derin damar trombozu) riskine ve hayati tehdit oluşturabilecek doku oksijeninde azalmaya neden olan pıhtılaşma komplikasyonları riski altındadır. Bu kan pıhtıları kan akışına karışırsa kalp krizi, inme ve pulmoner emboliyi tetikler. Protein C'nin etkin ve ekonomik bir yöntemle saflaştırılması son derece önemlidir. Kriyojeller, monomer veya polimer başlatıcıların kısmi olarak dondurulmuş çözeltilerde hazırlanmış jel matrisleridir. Birbirleri ile bağlantılı makro gözeneklerden oluşurlar ve ozmotik, kimyasal ve mekanik özellikleri sayesinde birçok biyolojik uygulamada kullanılırlar. Kriyojellerin uygulama alanları; doku iskelesi olarak, biyomoleküllerin, hücrelerin vb. immobilizasyonunda taşıyıcı olarak, proteinlerin, mikroorganizmaların, hücrelerin vb. kromatografik ayırma işlemlerinde kullanılır. Bu tez çalışmasında, afinite tekniğinden faydalanarak farklı oranlarda Aktive Protein C (APC) spesifik DNA aptamer temelli kriyojel membranlar sentezlenmiştir. Aptamer temelli kriyojeller protein C saflaştırma ve ayırma işlemleri için uygulanmıştır. Üç farklı oranda DNA aptamer takılı kriyojel membranlar hazırlanmıştır. Sentezlenen APC spesifik DNA aptamer kriyojeller Fourier dönüşümü kızılötesi spektroskopisi (FTIR), tarama elektron mikroskobu (SEM), şişme testi ve yüzey alanı analizi ile karakterize edilmiştir. Kriyojellerin makrogözenekli yapıları SEM analizi görüntüleri ile verilmiştir. Protein C adsorpsiyonuna pH'nın, Protein C derişiminin, sıcaklığın, iyonik şiddetin etkileri ve tekrar kullanılabilirlikleri incelenmiştir. Maksimum PC adsorpsiyonu en yüksek oranda DNA aptamer takılı kriyojel membran ile 89.02 g/mg olarak bulunmuştur. Kriyojellere ardarda on defa adsorpsiyon-desorpsiyon çalışması uygulandığında adsorpsiyon kapasitesindeki kararlılık %96.11 olarak hesaplanmıştır. Ayrıca aptamer temelli kriyojel membranların farklı proteinlere karşı olan seçiciliği araştırılmıştır. Sonuç olarak PC'ye karşı yüksek seçicilik gösterdiği belirlenmiştir. Tez çalışmasının son kısmında yapay plazma ortamından Protein C saflaştırılması sodyum-dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) kullanılarak saflaştırıldığı analiz edilmiştir.
Adenozin tayinine yönelik optik temelli nanosensörlerin geliştirilmesi
Tez kapsamında canlı yapısında önemli molekül olmakla birlikte idrar ve serum seviyelerinin nörodejeneratif hastalıklar ve kanser gibi hastalıklarla doğrudan veya dolaylı olarak bağlantısı bulunan adenozin nükleozidinin allil merkaptan ile yüzeyi aktif hale getirilen altın çip üzerine baskılanması sağlanmıştır. Nanofilm yüzey modifikasyonu moleküler baskılama tekniği yoluyla gerçekleştirilmiştir ve fonksiyonel monomer olarak metakrilik asit (MAA) kullanılmıştır. Adenozin tayini için yüzey plazmon rezonans (SPR) cihazı kullanılmıştır. Adenozin tayini için 3.0 -7.4 aralığında pH taraması yapılmış ve optimum pH 7.4 olarak belirlenmiştir. Kinetik çalışmalarda ise pH 7.4 fosfat tampon çözeltisi ile tespit aralığı için 0.5 nM- 400.0 nM aralığında farklı derişim seviyeleri ile analizler yapılmıştır ve nanosensörün çalışma aralığı belirlenmiştir. Geliştirilen nanosensörün seçicilik analizlerinde guanozin ve sitidin nükleozidleri de kullanılarak farklı oranlarda derişimlerdeki çözeltilerde SPR nanosensörünün seçiciliği belirlenmiştir. Moleküler baskılanmamış polimer (NIP) çip yüzeyi MAA monomeri ile kaplanmış ve pH 7.4 fosfat tampon çözeltisiyle adenozin, guanozin ve sitidin ile farklı derişim ve karışımlarda yapılarak hem kinetik çalışmaları hem de seçicilik tayinleri yapılmıştır. Adenozin baskılanmış nanosensör çipi ile adenozin tayinleri aynı gün içerisinde peşpeşe yapılmış ve aynı zamanda farklı zaman aralıklarında da adenozin analizleri yapılmıştır. Adenozin baskılanmış SPR çipinin gerçeğe uygun medikal analiz ve araştırmalarda kullanılması amaçlandığından adenozin analizlerinde 1.0 nM- 5.0 nM derişim aralığında yapay idrar ve serum örneklerinde de çalışılarak geri kazanımları hesaplanmıştır. Yapılan çalışmada 0.1 nM- 100.0 nM lineer aralığında sulu çözeltilerde tespit limiti(LOD) değeri 0.018 nM, yapay plazmada tespit limiti değeri 0.015 nM ve yapay idrarda tespit limiti değeri 0.013 nM olarak belirlenmiştir. Ayrıca miktar tayini sınırı (LOQ) değerleri ise sulu çözelti, yapay plazma ve yapay serumda sırasıyla 0.061 nM, 0.052 nM, 0.046 nM olarak hesaplanmıştır. Adenozin baskılanmış SPR çipinin yüzeyi atomik kuvvet mikroskobu, elipsometre ve temas açısı ölçümleri alınarak karakterize edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Adenozin, Moleküler Baskılanmış Polimerler, Nanofilm Yüzey Modifikasyonu, SPR, Nanosensörler
Konkanavalin a baskılanmış yüzey plazmon rezonans temelli biyosensörün hazırlanması
Bu tez kapsamında, Konkanavalin A tayini için Konkanavalin A baskılanmış yüzey plazmon rezonans (SPR) biyosensörler hazırlanmıştır. Bu amaçla, ilk olarak SPR biyosensör çip yüzeyi allil merkaptan ile modifiye edilmiştir. Daha sonra N-metakriloil-(L)-histidin metil ester (MAH) monomeri kullanılarak Konkanavalin A kalıp molekülü ile birlikte farklı molar oranlarında ön polimerizasyon kompleksleri oluşturulmuştur. Ön kompleks, fonksiyonel monomer olarak kullanılan HEMA, çapraz bağlayıcı olarak kullanılan EGDMA ile oluşturulan polimer karışımı içerisine katılmış ve AIBN başlatıcısı varlığında SPR çip yüzeyinde UV ışığı kullanılarak polimerleştirilmiştir. Kontrol grubu olarak Konkanavalin A kalıp molekülü kullanılmadan aynı işlemler gerçekleştirilmiş ve Konkanavalin A baskılanmamış SPR biyosensörler hazırlanmıştır. Hazırlanan SPR çipler atomik kuvvet mikroskobu (AFM), elipsometre ve temas açısı ölçümleri ile karakterize edilmiştir. Konkanavalin A molekülü için uygun pH değerinin belirlenmesi amacı ile Konkanavalin A baskılanmış biyosensör ile pH 4, 5, 6, ve 7.4 fosfat tamponları ile hazırlanmış Konkanavalin A çözeltileri kullanılarak pH taraması gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sensorgramlar ile Konkanavalin A molekülü için uygun pH değeri 7.4 fosfat tamponu olarak tespit edilmiştir. Daha sonra farklı derişimlerdeki Konkanavalin A çözeltileri (0.01-50 ng/mL) ile kinetik analiz yapılarak SPR biyosensörün ölçüm hassasiyeti belirlenmiştir. Ölçüm sonuçlarından elde edilen sensorgramlar sonucunda hazırlanan baskılanmış biyosensörün doğruluğu (0.01-5 ng/mL) derişim aralığında %99; (10-50 ng/ml) aralığında ise %96 doğrulukta ölçüm yapmaktadır. Tayin limiti (LOD) 0.0011 ng/mL ve tayin sınırı (LOQ) 0.0038 ng/mL olduğu hesaplanmıştır. Farklı derişimlerde hazırlanmış Konkanavalin A çözeltileri bağlanma kinetiğinin belirlenmesi amacı ile kullanmıştır. Hazırlanmış olan biyosensör için en uygun adsorpsiyon modeli Langmuir olarak tespit edilmiştir. Seçicilik çalışmaları, Konkanavalin A baskılanmış ve baskılanmamış SPR biyosensörler ile moleküler yapı bakımından benzer olan sığır serum albumin (BSA) ve miyoglobin (Myg) yarışmacı molekülleri ile gerçekleştirilmiştir. Gerçek örnek çalışmaları için soya fasulyesinden Konkanavalin A molekülü saflaştırılmıştır. Gerçek örnekten hazırlanan örneklerin Konkanavalin A baskılanmış SPR biyosensör ile kinetik analizleri gerçekleştirilmiş ve elde edilen sensorgramlar ile Konkanavalin A miktarı ve geri kazanım hesaplanmıştır. Konkanavalin A molekülünün yapay kontrol plazma ortamındaki uygunluğunu belirlemek amacıyla yapay kontrol plazma içerisinde farklı derişimlerde hazırlanmış Konkanavalin A çözeltilerinin baskılanmış SPR biyosensör ile kinetik analizleri gerçekleştirilmiş, elde edilen sensorgramlar ile Konkanavalin A miktarı ve geri kazanım hesaplanmıştır. Konkanavalin A molekülünün tekrar kullanılabilirliğinin incelenmesi amacıyla aynı gün içerisinde peş peşe 4 tekrarlı analizler gerçekleştirilmiştir. Ayrıca farklı zamanlardaki biyosensör kullanılabilirliğini test etmek amacıyla 1., 2., 4. ve 6. aylarda kinetik analizler gerçekleştirilmiştir. Hazırlanan Konkanavalin A baskılanmış SPR biyosensörün Konkanavalin A tayini için hassas, hızlı, uzun ömürlü ve maliyetli bir teknik olduğu gösterilmiştir.
Poli(3-hidroksi bütirat)/poli(bütilen adipat-ko-tereftalat)/ipek- bazlı tendon doku iskeleleri: Karakterizasyon ve tenojenik aktivite
Tendonlarda, mekanik stres birikimi, yaşlanma, genetik yatkınlık ve travma gibi etkenler sonucunda oluşan inflamasyon ve lezyonlara bağlı olarak tendon rüptürleri (kopma) sıklıkla görülmektedir. Tendon dokusunun düşük miktarlarda hücre içermesi, zayıf vaskülarizasyon ve düşük yenilenme potansiyeli nedeniyle hasarlı bölgede sağlıklı rejenerasyon gerçekleşmesi için tendon doku mühendisliği yaklaşımlarına ihtiyaç duyulmaktadır. Sunulan tez çalışmasında tendon rejenerasyonunda yama olarak kullanılabilecek ipek fibroin/poli(3-hidroksibütirat) (SF/P3HB) ve ipek fibroin/poli(bütilen adipat-ko-tereftalat) (SF/PBAT) hizalı nanofibröz matrikslerin geliştirilmesi ve bu matrikslerde sıçan adipoz kökenli mezenkimal kök hücreler (rAdMSC), büyüme faktörü ve dinamik kültür koşulları varlığında in vitro tenojenik aktivitenin belirlenmesi hedeflenmiştir. Tez çalışmasının ilk aşamasında klasik elektroeğirme yöntemi kullanılarak SF/P3HB ve SF/PBAT nanofiberlerin üretimi gerçekleştirilmiştir. Her 2 malzeme için de optimum elektroeğirme koşulları "response surface methodology" (RSM) yaklaşımı ile belirlenmiş ve hedeflenen şekilde hizalı ve ortalama 700 nm çap değerine sahip SF/P3HB ve SF/PBAT nanofibröz matriksler elde edilmiştir. İkinci aşamada ise, hizalı nanofibröz matrikslere uygulanan stabilizasyon işlemi sonrası ipek fibroine ait α-heliks yapısının β-tabaka yapısına geçişinin indüklendiği ve her iki nanofibröz matriksin mekanik dayanım açısından tendon dokuda kullanıma uygun olduğu, ancak SF/PBAT nanofibröz matriksin tendon dokuya benzerlik açısından daha üstün mekanik özellikler sergilediği belirlenmiştir. Stabilizasyon ve sterilizasyon işlemlerinin matrikslerin yüzey ıslatılabilirlik ve kristalinite özelliklerini etkilemediği, ancak otoklavda sterilizasyonu yapılan SF/P3HB nanofibröz matrikslerde hücre canlılığının etilen oksit yöntemine göre daha yüksek olduğu bulunmuştur. SF/PBAT nanofibröz matrikslerin ise ısıl işlemler için uygun olmadıkları belirlenmiştir. Ayrıca, SF/P3HB nanofibröz matrikslerin bakteriyostatik etkiye sahip olduğu bulunmuştur. Tez çalışmasının üçüncü aşamasında, hizalı SF/P3HB ve SF/PBAT nanofibröz matrikslerde rAdMSC'ler ile büyüme/farklılaşma faktörü-5 (GDF-5) varlığında/yokluğunda 21 günlük statik kültür çalışması yapılmış ve tenojenik farklılaşma karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Hücrelerin kültür boyunca yüksek canlılıkta olduğu ve hizalanmaya uygun olarak matriksler üzerinde organize olduğu görülmüştür. Kültür sonunda bozunmaya bağlı olarak her iki doku iskelesinde de mekanik özelliklerde azalma tespit edilmiştir. SF/PBAT doku iskeleleri üzerinde kültüre edilen rAdMSC hücrelerinin SF/P3HB'e oranla daha yüksek COL1A1, COL3A1, SCX, TNC ve düşük PPAR gen ifadeleri nedeniyle tenojenik aktivite açısından daha uygun oldukları belirlenmiştir. Ayrıca, GDF-5 büyüme faktörü, gen ifadelerinde artışa yol açarak hücre iskeletinin düzenlenmesini ve farklılaşmayı indüklemiştir. Hizalı topografya rAdMSC hücrelerinin tenojenik farklılaşmasında oldukça etkin olmasına rağmen gen ekspresyonları açısından yeterli bulunmamıştır. Mekanik uyarım biyoreaktöründe yapılan çalışmalarda SF/P3HB doku iskelelerinin dinamik kültür çalışmaları için yeterli mekanik özelliklere sahip olmadığı belirlenmiştir. Tez çalışması sonunda, hizalı SF/PBAT nanofibröz matrikslerin tenojenik aktivite açısından SF/P3HB nanofibröz matrikslere göre daha üstün özellikler gösterdiği ve tendon rejenerasyonunda yama materyali olarak kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.
Yüzey plazmon rezonans sensörü ile sentetik reseptörler kullanılarak sütte bulunan benzilpenisilinin tayini
Gıda ürünlerinde, içme suyunda ve çevrede bulunan antibiyotik kalıntıları, antibiyotiğe dirençli bakteri suşlarının ortaya çıkması, normal ekolojik dengenin bozulması ve alerjik reaksiyon insidansının artması dahil olmak üzere ciddi sağlık sonuçlarına neden olmaktadır. Bu sebeplerden dolayı, halk sağlığının korunması için gıda ve çevredeki bu antibiyotik kalıntılarının tespiti hayati önem taşımaktadır. Bu tez çalışması kapsamında, moleküler baskılama tekniği kullanılarak hazırlanan yüzey plazmon rezonans (SPR) sensör ile hem sulu çözelti hem de süt örneklerinden benzilpenisilin antibiyotiğinin seçici ve hassas tayini gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, benzilpenisilin baskılanmış poli (hidroksietil metakrilat-grafen oksit-N-metakriloil-L-fenilalanin) (MIP-GO) SPR sensör hazırlanmıştır. Hazırlanan sensör yüzeyinin farklı yöntemler ile karakterize edilmesinden sonra MIP-GO SPR sensör benzilpenisilini 1-100 ppb derişim aralığında 0.021 ppb düşük tayin sınırı ve 0.9665 korrelasyon katsayısı ile doğrusal ilişki göstererek tayin etmiştir. MIP-GO SPR sensörün hedef molekül benzilpenisilini seçici tayin ettiğini göstermek amacı ile seçicilik çalışmaları gerçekleştirilmiş ve benzilpenisilini, amoksisilinden 8.16 kat ve ampisilinden 14.04 kat daha seçici tayin ettiği tespit edilmiştir. Baskılama verimliliğini incelemek amacı ile benzilpenisilin baskılanmamış poli (hidroksietil metakrilat-grafen oksit-N-metakriloil-L-fenilalanin) (NIP-GO) SPR sensör benzilpenisilin molekülü eklenmeden aynı polimerizasyon reçetesi kullanılarak hazırlanmıştır. MIP-GO SPR sensör ile NIP-GO SPR sensör karşılaştırıldığında baskılama verimliliği (IF) 11.06 olarak tespit edilmiştir. Grafen oksit (GO) yüzey plazmon rezonans sinyal yanıtını artırmak amacı ile eklendiğinden, bu etkiyi incelemek için GO eklenmeden hazırlanan poli (hidroksietil metakrilat-grafen oksit-N-metakriloil-L-fenilalanin) (MIP) SPR sensör ile kontrol deneyleri gerçekleştirilmiştir. MIP-GO, NIP-GO ve MIP SPR sensörler, fourier dönüşümlü kızılötesi spektrofotometresi, atomik kuvvet mikroskobu ve temas açısı ölçümleri ile karakterize edilmiştir. MIP-GO SPR sensörün tekrarlanabilirlik çalışmaları, 25 ppb benzilpenisilin derişimi içeren çözelti ile gerçekleştirilerek istatistiksel olarak analiz edilmiştir. %1.0'den az olan gün-içi analizlerin yüzde göreli standart sapması (RSD), aynı sensörle dört adsorpsiyon-desorpsiyon döngüsünden sonra bile benzilpenisilin algılama yeteneğinde ihmal edilebilir bir kayıp olduğuna işaret etmiştir. Gerçek gıda örneği olarak içine 6.25 ppb benzilpenisilin eklenen ve eklenmeyen sütteki benzilpenisilin miktarı MIP-GO SPR sensör ile tespit edilmiştir. Validasyon çalışmaları için yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) deneyleri gerçekleştirilmiştir.
Havayolu modellemesi amaçlı tasarlanan mühendislik ürünü 3B hücre kültür sistemlerinin geliştirilmesi
Kronik hava yolu hastalıkları çevresel ve genetik faktörlerin rol oynadığı bir dizi karmaşık mekanizmaya sahiptir. Bu hastalıkların moleküler patolojilerinin çalışılması ve kritik cerrahi ameliyatlar sonrasında ihtiyaç duyulan doku nakli için in vivo ortamı taklit eden uygun hücresel model sistemlerin kurulması oldukça önemlidir. Literatürde havayolunu modellemek için çeşitli hücresel in vitro model sistemler oluşturulmuştur. Havayolu hücre kültürleri için kullanılan in vitro modeller arasında en yaygın yöntemlerden biri hava-sıvı arayüzü (Air Liquid Interface -ALI-) kültür sistemi ve bu sistemde kullanılan transwell-insert membran yapılarıdır. Ancak halihazırdaki ALI-kültür uygulamalarında transwell membranların her iki yüzüne de ekim yapabilecek pratik bir sistem tasarımı bulunmadığı için hücre-hücre etkileşimi incelenirken ALI kültür sisteminin iki yüzü etkin kullanılamamaktadır. Ticari olarak günümüzde satılan sistemlerin 3 boyutlu (3B) hücre ko-kültür sistemlerine yatkınlığı da son derece kısıtlıdır. Çalışmanın ilk basamağında; halihazırda ALI kültür sistemlerde kullanılan transwellerin kullanımı daha efektif hale getirilerek modifiye edilmiş ve bu amaçla transwell adaptörler 3B yazıcıdan çıkartılmış, sızıntı denemeleri gerçekleştirilmiş ve ALI sistemine uyarlanarak epitel-fibroblast ko-kültürleri yapılmıştır. Ko-kültür modeller üzerinde immünositokimya ve gerçek zamanlı PZR çalışmaları gerçekleştirilmiş ve modellerin etkinliği doğrulanmıştır. Denemelerin sonucunda 3B ko-kültür sistemine dönüşümünü sağlayan yeni bir ürün geliştirilmiştir. Çalışmanın ikinci kısmında epitel doku greft gelişimine uygun transwell yapısında kullanılmak üzere biyobozunur membranlar geliştirilmiştir. Bu amaçla poli (L-laktik asit) (PL24, Corbion, intrinsik viskozite=1.5-2.0 dL/g) ve poli(e-kaprolakton) (PCL12, Corbion, intrinsik viskozite=1.0-1.3 dL/g polimerleri kullanılarak elektroeğirme yöntemiyle örgüsüz nanofiber ağ yapısında membranlar sentezlenmiştir. Optimizasyon ve karakterizasyon çalışmaları yapıldıktan sonra uygun bulunan membranlar 3B ALI-kültür sistemine entegre edilerek hücre kültür sistemlerinde değerlendirilmiştir. Geliştirilen biyobozunur özellikteki membranın, fizyolojik ortamda doğal olarak oluşan bariyer yapısı gibi sürdürülebilir özellikte olduğu ve havayolu modellemesi için ALI-kültür sistemlerinde kullanımının uygun olduğu sonucuna varılmıştır.
Kemik tümörlerinde lipozomal kannabinoidlerin reseptör aracılı antiproliferatif ve apoptotik etkilerinin araştırılması
Primer osteosarkom hızlı metastaz özelliği ile bilinen, çocuklarda ve gençlerde en sık izlenen osteojenik tümördür. Klinikte uygulanan tedavi yöntemlerinin sınırlılıkları ve hastalarda görülen yan etkiler yeni tedavi ajanlarının araştırılması gerekliliğini ortaya koymaktadır. Endokannabinoidler, insan kas-iskelet sisteminde sentezlendiği bilinen, osteoblast, osteoklast ve osteoprogenitör hücrelerde CB1, CB2 ve TRPV1 reseptörleri aracılığıyla kemik yapımı ve yıkımını düzenliği bildirilmiş lipit yapılı ligandlardır. Kannabinoidlerin osteosarkom hücrelerinde CB2 veya TRPV1 reseptörleri aracılı hücre çoğalmasını azaltıcı ve apoptozu indükleyici etkileri bildirilmiştir. Hepatokarsinom ve endometriyum kanserinde antiproliferatif ve apoptotik etkinliği bildirilen sentetik spesifik CB2 reseptör agonisti CB65, CB2 reseptörü aracılı olarak osteosarkom hücrelerinde antiproliferatif ve apoptotik etki gösterebilir. CB65'in osteosarkom için ilaç adayı olarak kontrollü salımını sağlayabilecek ve biyoyararlanımını arttırabilecek biyouyumlu lipozom taşıma sistemi kullanılabilir. Varsayımı test etmek amacıyla in vitro koşullarda deney ve kontrol gruplarını içeren gözlemsel bir çalışma tasarlanmıştır. Tez çalışmasında insan Saos-2 osteosarkom hücre hattında pozitif kontrol A549 hücrelerine göre qRT-PCR ile yüksek CB2 reseptör ekspresyonu saptanmıştır. İnsan MG63 ve Saos-2 hücrelerinde in vitro koşullarda akım sitometrisi ile hücre içi ve hücre zarındaki CB1 ve CB2 reseptörlerinin varlığı gösterilmiştir. Buna göre MG63 ve Saos-2 hatlarında yüksek oranda CB2 immün işaretlenme saptanmıştır. MG63 ve Saos-2 hatlarında WST-1 ile saptanan 10-12 – 10-8 M antiproliferatif etkili doz penceresi gerçek zamanlı proliferasyon analizi ile değerlendirildiğinde MG63 için 1.11x10-11 M ve Saos-2 için 4.95x10-11 M ED50 hesaplanmıştır. CB65'in osteosarkom hatlarındaki proliferasyonu azaltıcı etkisi CB2 antagonisti AM630 ile bloke olmuş, CB65'in CB2 reseptörü aracılı etki gösterdiği saptanmıştır. ED50 CB65, Annexin/PI işaretlemesi ile MG63 hücrelerinde geç apoptozu ilk 48 saatte %7.31 ve Saos-2 hücrelerinde ilk 24 saatte %19.06 oranında indüklemiştir. CB65, ince film oluşturma yöntemi ile lipozomal sisteme %51.12 oranla yüklenmiş ve 24 saatlik kontrollü salımı sağlanmıştır. Lipozomal sistemden 1.11x10-11 M CB65 salındığında gerçek zamanlı proliferasyon analizinde MG63 ve Saos-2 hücrelerinde 16. saatten 56. saate kadar hücre çoğalmasını azaltıcı etki göstermiştir. Sonuç olarak, yeni stabil ve erken etkili lipozomal CB65 yüklü kontrollü salım sistemi başarıyla oluşturulmuş ve in vitro koşullarda insan osteosarkom hücrelerindeki CB2 reseptör aracılı agonistik antiproliferatif ve apoptotik etkisi doğrulanmıştır. Ortopedik onkoloji klinikleri, in vivo validasyonun ardından ilaç adayını pediatrik kemik kanserlerini iyileştirmek için hedefli ve akıllı bir araç olarak kullanabilir.
Epilepsi tedavisinde kullanılmak üzere fenitoin yüklü katı lipid nanopartiküllerin sentezi ve karakterizasyonu
Epilepsi dünya nüfusunun %1' ini etkileyen ve spontan tekrarlayan nöbetler ile karakterize kronik bir nörolojik hastalıktır. Yaygın nedenleri arasında kritik nöronal genlerdeki patojenik genetik varyantlar, travmatik beyin hasarları, enfeksiyon ve genetik destekli olan veya olmayan gelişimsel malformasyonlar bulunmaktadır. Epilepsi tedavisinde çeşitli ilaçlar kullanılmakla birlikte bu ilaçlar epilepsiyi tedavi etmemekte sadece nöbet oluşumunu önlemektedir. Bu nedenle epilepsi tedavisin de kullanılan bu tür ilaçlar antikonvülsanlar olarak bilinmektedir. En yaygın kullanılan antikonvülsanlardan biri olan fenitoindir. Fenitoin yüksek oranda protein bağlanma kapasitesine sahiptir ve fenitoin nöbet önleyici etki gösterdiği dozlarda protein bağlanma özelliği, fenitoinnin yan etkisini arttırmaktır. Bu durum nöbet önleme etkisi yüksek olmasına rağmen fenitoinin epilepsi hastalarında kullanımı günümüzde oldukça azalmıştır. Günümüzde konvensiyonel tanımlı terapötiklerin biyoyararlanımlarını artırmak / yan etkilerini azalmak için nanopartiküller taşıyıcı sistemleri ile kombinasyonu çalışılan konulardandır. Nanopartiküllerin sağladığı temel avantajlar; (1) suda çözünürlüğü arttırarak iyileştirilmiş biyoayarlanım, (2) vücuttaki direnç süresini arttırma (klirens için yarı ömrü arttırma/ aynı kökenli reseptörleri için özgüllüğü arttırma) ve (3) ilacı belirli bir bölgeye (etki yeri) hedeflemedir. Böylece gerekli ilaç miktarında ve doz toksisitesinde eş zamanlı azalmaya neden olarak toksik teröpatik ilaçların güvenli bir şekilde verilmesini ve hedef olmayan hücre ve dokuların ciddi yan etkilerden korunmasını sağlamasıdır. Serbest fenitoinin canlı içerisinde proteine tutunarak işlevsizleşmesi, suda çözünmüyor olması ve yüksek dozlarda hastaya verilmesi durumunda önemli yan etkilere sebep olması göz önünde bulundurularak son dönemlerde bu gibi durumların önlenmesi için ilaç taşıyıcı olarak ve kontrollü salım gerçekleştirmek üzere sık kullanılmaya başlanan nanopartiküler sistemler ile fenitoinin yeniden epilepsi tedavisinde kullanılmaya başlanabileceği öngörülmüştür. Bu amaçla sunmuş olduğumuz proje önerisinde stearik asit nanopartiküller içerisine enkapsüle edilen fenitoinin in vitro karakterizasyonu gerçekleştirilecek ve glial ve nöronal hücrelerdeki etkileri incelenecektir. Bu amaçla T98G gliablastoma hücre hattında in vitro epilepsi modeli oluşturulacak ve bu modellerin ilaç yüklü nanopartikül ile etkileşimi sonucu hücrelerde meydana gelen değişimler (TOS ve 8-OHdG) incelenecektir. Anahtar Kelimeler: Epilepsi, Fenitoin, Katı Lipid Nanopartiküller, TOS, 8-OHdG
Yapay zeka yöntemi ile bölütlenmiş karmaşık damar yapılarının üç boyutlu biyoyazıcı ile üretimi
Dünya Sağlık Örgütü'ne göre kalp hastalıkları dünya çapında başlıca ölüm nedenlerinden biridir. Kalp ve koroner hastalıklarının teşhisi ve tedavi planlamasında girişimsel bir medikal görüntüleme yöntemi olan ve çok detaylı görüntüler elde edilebilen Bilgisayarlı Tomografi Anjiyografi (BTA) kullanılmaktadır. Bilgisayarlı Tomografi Anjiyografi görüntüleri üzerinden koroner arterleri incelemek için bir dizi bilgisayarlı görü ve tanı destek sistemlerine ihtiyaç bulunmaktadır. Tez çalışması kapsamında, koroner arterlerin yapay zeka ile bölütlenmesi ve bölütleme sonu elde edilen üç boyutlu (3B) modelin biyobaskılanabilirliği incelenmiştir. Bu kapsamda, halka açık erişimi bulunan koroner arterlerin sınıflandırıldığı CLS12 adlı BTA görüntüleri kullanılarak, derin öğrenme mimari çerçevesi olan nnU-Net içerisindeki 3B U-Net ile eğitim gerçekleştirilmiştir. Üç boyutlu karmaşık koroner arter damar bölütlemesi tam otomatik olarak U-Net, MultiRes U-Net, nnU-Net ve transfer öğrenme ile nnU-net ile gerçekleştirilmiş ve diğerleriyle karşılaştırıldığında transfer öğrenme ile nnU-net eğitimi 0.86 Dice benzerlik katsayısı (DSC) ile daha başarılı bir bölütleme sağlamıştır. Bölütleme sonucu 3B koroner arter modeli başarılı bir şekilde elde edilmiş ve '.stl' formatında kaydedilerek 3B biyoyazıcıyla kullanılabilir hale getirilmiştir. Tezin ikinci kısmında, yapay zeka yöntemiyle oluşturulmuş 3B koroner arter modelinin biyobaskılanması için ticari olarak satılan ve eriyik biriktirme yöntemiyle çalışan bir 3B yazıcı, açık kaynaklı donanım ve yazılım araçları kullanılarak düşük maliyetle bir 3B biyoyazıcıya dönüştürülmüştür. Geliştirilen koroner arter modeli, aljinat biyomürekkebi kullanılarak mikroekstrüzyon presibiyle çalışan 3B biyoyazıcı aracılığıyla Pluronic F-127 destek banyosu içerisine başarılı bir şekilde biyobaskılanmıştır. Çalışmanın devamında 3B biyobaskılanmış damar yapıları, makroskopik görüntüleme, mikro-bilgisayarlı tomografi ($\mu$-BT) ve akış deneyleriyle karakterize edilmiştir. Bu analizlerde biyobaskılanmış damar yapısının içi boş olarak üretilebildiği ve içerisine gönderilen çözelti akışının düzenli ve sızdırmaz olarak gerçekleştiği görülmüştür. Makroskopik ve $\mu$-BT görüntüleme analizlerinde gerçek veri ve yapay zeka sonuçları üzerinden oluşturulan 3B modellerin karşılaştırılması yapılmıştır. Makroskopik görüntüler üzerinden yapılan analizlerde, biyobaskılama öncesinde \%200 olarak ölçeklendirilmiş gerçek 3B damar yapısı için damar çapları farklı bölgelerde 4.3 mm ve 6 mm, yapay zeka çıktısı 3B damar yapısı için ise damar çapları 4 mm ve 5.8 mm olarak ölçülmüştür. Dondurularak kurutulmuş örneklerin $\mu$-BT görüntüleri üzerinden yapılan analizlerde ise, gerçek 3B damar yapısı için farklı bölgelerde dış damar çapları 4 mm ve 5.3 mm ve iç lümen çapı farklı bölgelerde 2 mm ve 1.5 mm, yapay zeka çıktısı 3B damar yapısı için ise dış damar çapları 3.5 mm ve 5 mm ve iç lümen çapı farklı bölgelerde 1.8 mm ve 1.5 mm olarak ölçülmüştür. Sonuç olarak, bu tez çalışması kapsamında yapay zeka yöntemi ile kişiye özel olarak 3B koroner arter bölütlenmesi kullanıcıdan bağımsız bir şekilde başarıyla gerçekleştirilmiş ve karmaşık yapıların 3B biyoyazıcıyla üretilebilirliği gösterilmiştir. Yapay zeka üzerinden bölütlenmiş 3B koroner arterlerin, mikroekstrüzyon temelli biyoyazıcılar ile doku mühendisliği çalışmalarında başarılı bir şekilde kullanılabileceği gösterilmiştir. Dahası, üç boyutlu biyobaskılama süreçleri yapay zeka ile desteklendiğinde, karmaşık mimarideki diğer doku/organların geliştirilmesi çalışmalarına da yol gösterici olabileceği düşünülmektedir.
Böbrek transplantasyonu yapılacak PRA (panel reaktif antikor) pozitif hastalarda HLA haplotipleri ile immünofenotip ilişkisinin araştırılması
İnsan Lökosit Antijeni (HLA- Human Leucocyte Antigen) son derece kompleks bir morfolojiye sahiptir. Bu kompleks yapı, özellikle böbrek gibi bazı organ nakilleri söz konusu olduğunda hasta ve donör arasındaki uyumsuzluğa sebep olan önemli bir faktördür. HLA lokuslarında ne kadar çok uyum varsa rejeksiyon riski ve kullanılacak immünsupresiflerin miktarı o kadar azdır. Panel Reaktif Antikor (PRA) testi ise hastanın serumunda bulunan anti-HLA antikorların tanımlanmasını sağlayan bir testtir. Böbrek bekleme listesindeki hastalarda, hastanın serumunda oluşan anti-HLA antikorlarının varlığı hastada hiper akut ve akut rejeksiyona sebep olmaktadır. PRA pozitif hastaların PRA negatif hastalara göre nakil başarısı daha düşüktür. Bu çalışmada 2012-2022 tarihleri arasında Dışkapı Yıldırım Beyazıt Eğitim ve Araştırma Hastanesi Doku Tipleme Laboratuvarı'na gelen ve kronik böbrek yetmezliği (KBY) teşhisi konulmuş, çalışma için uygun olan 24 hasta seçilmiştir. T lenfositler böbrek naklinde immün düzenleyici olarak rol alırlar. Antijen sunucu hücrelerle etkileşime giren T lenfositler uyarılır ve sinyal oluştururlar. En önemli sinyal, T hücre reseptörü CD3'ün bir majör histo uyumluluk kompleksi (MHC) ile temasından elde edilir. Bununla birlikte, T hücreleri üzerinde ifade edilen diğer sinyal molekülleri de T hücrelerinin düzenleyici veya effektör hücrelere farklılaşmasını ve aktivasyonunu etkiler. Transplante edilen organın reddinin başlatılması ve sürdürülmesinde aktive edilmiş bu T hücreleri yer alır. Ancak böbrek nakli hastalarının kanında bulunan T lenfosit alt gruplarının ve HLA-DR pozitif hücrelerinin klinik önemi hala belirsizliğini korumaktadır. Bu çalışmayla 9 PRA pozitif hastanın antikorları belirlenmiştir. Doğal öldürücü hücreler (Natural Killer-NK), T Lenfosit, B lenfosit aktivasyonunun belirlenmesi aşamasında Flow Sitometri cihazı (Beckman Coulter Navios-model, USA) ile HLA-DR, CD3, CD4, CD8, CD16, CD56, CD25 CD127, CD45, CD57, CD19 belirteçleri kullanılarak lenfosit profili belirlenmiştir. Bu profil hastaların doku tipi ve kendi içinde alt gruplarına göre ayrılarak aradaki fark istatistiksel olarak karşılaştırılmıştır. PRA pozitif hastalarda sık görülen organ rejeksiyonları ile lenfosit profili arasındaki ilişki SPSS 23 analizi ile sorgulanmıştır. KBY Hastalarının PRA, nakil ve rejeksiyon durumlarına göre aktive CD4+ hücreleri tanımlayan CD4+CD25low ve CD4+HLA-DR+ T hücre yüzey belirteç değerlerinin karşılaştırılması yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar istatiksel olarak incelendiğinde: KBY Hastalarının PRA durumuna göre CD4+CD25low ve CD4+HLA-DR+ T hücre yüzey belirteç ortancaları PRA pozitif hastalarda PRA negatif hastalara göre daha yüksek bulunmuştur (z=4.025; p<0.001; r=0.821). KBY hastalarına ait PRA pozitif hastaların sınıf I ve sınıf II yüzde değerlerinin CD4+CD25low ve CD4+HLA-DR+ T hücre yüzey belirteç değerleri ile karşılaştırılması yapıldığında değişkenler arasında anlamlı bir fark bulunmamıştır. KBY Hastalarının nakil durumuna göre CD4+CD25low T hücre yüzey belirteç ortancaları nakil olan hastalarda nakil olmayan hastalara göre daha yüksektir (z=2.578, p=0.009, r=0.520). CD4+HLA-DR+ T hücre yüzey belirteç ortancaları için anlamlı bir fark elde edilmemiştir (z=0.550, p=0.608, r=0.110). KBY Hastalarının rejeksiyon durumuna göre CD4+CD25low ve CD4+HLA-DR+ T hücre yüzey belirteç ortancaları rejeksiyon olan hastalarda olmayan hastalara göre daha yüksek saptansa da istatistiksel anlamlı bir değişkenlik göstermemiştir (z=1.776, p=0.095, r=0.562). Hasta sayısı arttırıldığında anlamlı bir fark elde edileceği etki büyüklüğü değerinden (r=0.562; r>0.50 large effect size) anlaşılmaktadır. Hastaların HLA-A, HLA-B ve HLA-DRB1 doku tiplerine ait lokus numaraları ile PRA durumları istatiksel olarak Chi-Square analizi ile incelenmiştir. PRA test sonucu pozitif veya negatif olan hastalarda HLA-A, HLA-B ve HLA-DRB1 lokus numaraları açısından anlamlı bir farklılık gözlemlenmemiştir. Yapılan çalışma kapsamında elde edilen sonuçlar değerlendirildiğinde; KBY hastalarının PRA durumuna göre CD4+CD25low ve CD4+HLA-DR+ T hücre yüzey belirteç değerlerinin hasta monitorizasyonu için ek bir parametre olarak kullanılabileceğini düşündürmüş ancak, hasta sayılarının arttırılarak ve çok değişkenli istatistiksel analiz yapılması gerekmektedir.
Anti-HER2 scFV antikor fragmanının Escherichia coli bakterisinde üretim bölgesinin optimizasyonu
Antikorlar ve antikor fragmentleri, kanser ve viral enfeksiyonlar gibi çeşitli hastalıkların tanısında, görüntülemede ve hedefe özgü tedavilerde kullanılmaktadır. Bulaşıcı hastalıklarla mücadelede de önemli bir yere sahiptir. Esnek bir peptit parçası ile bir hafif zincirin V kısmına bağlanmış bir ağır zincirin V kısmından oluşan tek-zincir antikor fragmentleri (scFv), daha küçük boyutlarda olması, bakteri sistemlerinde daha ucuz ve kolaylıkla üretilebilmesi ve hedef antijene karşı, antikorlara benzer düzeyde, yüksek seçicilik ve afinite göstermelerinden dolayı, son zamanlarda tam-antikorlar yerine kullanılabilmektedir. Biyofarmasötik proteinler küresel ilaç pazarının yaklaşık yarıya yakınını oluşturmaktadır. Biyofarmasötik ürünlerin çoğunluğunu monoklonal antikor ve antikor fragmentleri kapsamaktadır. Rekombinant protein üretiminde yaygın olarak kullanılan Escherichia coli'nin, üretim maliyetlerini düşürdüğü, verimliliğin arttırdığı ve diğer mikroorganizmalara kıyasla manipülasyonu daha kolay olduğu bilinmektedir. Literatürde, disülfit bağı içeren anti-HER2 scFv'nin optimum üretim yerinin belirlenmesine yönelik E. coli'nin üç farklı bölmesindeki üretimlerin bir arada olduğu, bu bölgelere özgü farklı yolakları kullanan birbirinden farklı sinyal peptitleri ve suş kullanılarak karşılaştırılmasına ve üç bölme arasında optimum üretim yerinin belirlenmesine yönelik bir çalışma bulunmamaktadır. Yapılan tez çalışmasında, meme kanseri hücrelerinde normalden fazla miktarda ortaya çıkan insan epidermal büyüme reseptörü 2 (HER2)'ye karşı seçici anti-HER2 scFv'nin, genetiği değiştirilmiş ticari E. coli bakterisinin SHuffle T7 Express suşunda sitoplazmik bölgede üretimi, BL21(DE3) suşunda DsbA, MBP sinyal peptitleri kullanarak yapılan tasarımla periplazmik ve YebF sinyal peptidi kullanarak yapılan tasarımla hücre dışında üretimleri karşılaştırılmıştır. Üretim sonrası >99% oranında saflaştırılan scFv'lerin, çözünür ve aktif formda oldukları yapılan çalışmada gösterilmiştir. Sıcaklık taraması yapılarak, üretim için uygun sıcaklık belirlenmiştir. Üretim sürecinin optimize edilmesinin ardından scFv'ler farklı yönleri ile kıyaslanmıştır. Özgüllükleri değerlendirilen periplazmik, sitoplazmik ve ekstraselüler örnekler, in vitro analizlerde antijene doğru şekilde bağlanmıştır. Sitoplazmik örneğin üretim verimi 6,2 mg/L iken, spMBP ile yapılan periplazmik üretimin verimi 5,1 mg/L, hücre dışı üretim verimi ise 2,5 mg/L olarak bulunmuştur. Ayrıca, özgül ısı ve erime sıcaklıklarına (Tm) bakıldığında, sitoplazmik örneğin termal olarak daha kararlı olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Özetle bu çalışma, tıbbi tanı ve tedavide rol oynayan, rekombinant DNA teknolojisi ile üretilecek ve disülfit bağı içeren proteinlerin üretim maliyetlerini azaltım sürecine rehberlik edebilecek bir çalışma olmuştur. Özellikle anti-HER2 scFv'nin aktif ve çözünür formdaki üretimi, kompleks proteinlere özgü yöntemler ve suşlar kullanarak E. coli'de klonlanması ve farklı yönleriyle değerlendirilmesi literatüre önemli bir katkı sağlayacaktır.
Potansiyel EEG tabanlı beyin bilgisayar arayüzleri için motor imgeleme aktivitelerinin tespit edilmesi
Bu tez çalışmasında, potansiyel Beyin-Bilgisayar Arayüzü uygulamaları için motor imgeleme aktivitelerinin tespit edilebilmesi, teorik ve deneysel olarak incelenmiştir. Teorik çalışma, Beyin-Bilgisayar Arayüzü sistemlerinde farklı motor imgeleme davranışlarının sınıflandırılmasına yönelik başarım oranını iyileştirmek için birkaç yaklaşıma dayalı (Ortak Ortalamaya Referanslama, Temel Bileşenler Analizi, Kör Kaynak Ayırma, Genelleştirilmiş Özdönüşüm) doğrusal uzamsal filtreleme tekniğinin performansını değerlendirmek ve karşılaştırmaktır. Uzamsal filtrelerin performanslarının değerlendirilmesi için BBA yarışma veri setleri içerisindeki farklı imgeleme davranışlarına (sağ el/sol el ve ayak/dil) ait veriler kullanılmıştır. Verilerde beyazlatma ve düzenleme parametreleri ile, uzamsal filtrelerin sınıflandırma performanslarının iyileştirilmesi hedeflenmiştir. Deneysel çalışmada, iki kanallı bir EEG cihazı kullanılarak farklı motor imgeleme davranışları (sağ el/sol el) ile değişen alfa bandı genlik düşüşü ritimlerinin (Eyleme Bağlı Desenkronizasyon, "EBD") tespit edilebilirliği incelenmiştir. Teorik çalışmada incelenen uzamsal filtreleme yaklaşımlarından Genelleştirilmiş Özdönüşüm yöntemi, aktivitenin gerçekleştiği topografik bölgenin tespiti ve elektrot ölçümleri içerisinden aktivitelere bağlı değişen sinyal örüntülerinin çıkartılması için kullanılmıştır. Deneysel çalışmalar 6 sağlıklı ve sağ elini kullanan katılımcı ile gerçekleştirilmiştir ve ipucu tabanlı bir prosedür kullanılmıştır. Teorik çalışmadaki bulgulara göre, Genelleştirilmiş Özdönüşüm yaklaşımı diğer yaklaşımlara göre baskın olarak daha iyi bir sonuç vermiştir. Verilerde beyazlatma ön işlemesi uzamsal filtrelerin performansında iyi bir derecede iyileşme sağlamıştır. Genelleştirilmiş Özdönüşüm yaklaşımı için düzenleme parametreleri, genel sınıflandırma başarıları için düşük boyutta bir iyileşme gösterirken bazı denekler için iyi bir sınıflandırma başarısı sağlamıştır. Deneysel çalışmalardaki bulgulara göre, 6 katılımcı içerisinden 4 katılımcı için imgeleme aktivitelerine ait zaman dilimlerinde ve topografik olarak beynin imgelemelerle ilişkilendirilmiş bölgelerinde sinyal genliklerinin referans periyotlarına göre ortalama yaklaşık %50'sine (ort. %47,3) kadar azaldığı EBD örüntüleri, kullanılan uzamsal filtre yaklaşımı ile tespit edilebilmiştir.
Kişiye özel kraniyal implantlarda yapısal parametrelerin araştırılması: Sonlu elemanlar analizi uygulaması
Kraniyoplasti, kafatası defektlerinin onarımı için yapılan cerrahi işlemdir. Bu tür defektler, doğuştan gelen kusurlardan, hastalıklardan, kazalardan, enfeksiyonlardan veya tümörlerden kaynaklanabilir. Kraniyoplasti, kafatasının bütünlüğünü sağlayarak, hastanın dış görünüşünü düzeltmek ve buna bağlı olarak hastanın özgüvenini artırmakla kalmayıp, aynı zamanda kafa içi basıncı da dengeler ve beyni koruyarak defektin oluşturduğu olumsuz sonuçları azaltır. Bilgisayar destekli tasarım ve 3 Boyutlu yazıcı teknolojilerinin gelişmesi kişiye özel kraniyoplasti implantlarının tasarlanmasına ve üretilmesine olanak sağlamıştır. İntraoperatif kraniyoplasti cerrahisi ile kıyaslandığında, kişiye özel implantların birçok avantajı bulunmaktadır. Bunlar, ameliyat süresinin ve karmaşıklığının azalması, cerrahi doğruluğun artması, daha iyi kozmetik sonuç olarak özetlenebilir. Tez kapsamında, kişiye özel kraniyal implant tasarımı yapılmış, ve kafatası – implant montajı, sonlu elemanlar yöntemine dayanan hesaplama simülasyonları kullanılarak analiz edilmiştir. İmplant malzemesi ve implant üzerindeki delik çapının, implanttaki deformasyon ve gerilime olan etkisi araştırılarak, iki farklı defekt boyutu üzerinde, implantın mekanik performansına olan etkisi incelenmiştir. Yapılan çalışmada, implant üzerindeki delik çapı küçüldükçe, implanttaki deformasyon ve gerilim değerlerinin arttığı gözlemlenmiştir. Ayrıca, defekt büyüklüğü arttıkça implantlardaki deformasyon değerinin arttığı ve implant malzemesinin elastisite modülü arttıkça implanttaki deformasyon değerlerinin azaldığı görülmüştür.
Fonksiyonel pet nano fiberlerin üretilmesi ve yara örtüsü olarak kullanmak üzere modifiye edilmiş pet fiberlere protein kaplı gümüş nanoparçacıkların adsorpsiyonu
Bu çalışmada, serisin kaplı gümüş nanopartiküller (S-AgNPs) poli(etilen tereftalat)-g-poli(hidroksietilmetakrilat) (PET-g-HEMA) nanolifleri üzerine adsorbe edilmiş ve elde edilen materyalin yara örtüsü olarak kullanımı araştırılmıştır. Öncelikle, serisini indirgeme ajanı olarak kullanarak farklı derişimlerde S-AgNPs'ler sentezlenmiş ve UV-Vis spektrofotometre kullanılarak 420 nm'de gözlemlenen yüzey plazmon pikleri ile S-AgNPs oluşumu kanıtlanmıştır. S-AgNPs'lerin zeta potansiyelleri Zeta-Sizer, kimyasal yapıları fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi (FTIR) ve morfolojileri geçirimli elektron mikroskobu (TEM) ile incelenmiştir. Yara örtüsü eldesi için, öncelikle PET lifleri başlatıcı olarak benzoil peroksit kullanılarak HEMA ile aşılanmıştır. Farklı HEMA aşılama oranlarına (%20, 55, 110, 175) sahip kopolimerler taramalı elektron mikroskobu (SEM), FTIR ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (1H-NMR ve 13C-NMR) analizleri ile karakterize edilmiş ve HEMA'nın yapıya eklenmesi ile liflerde meydana gelen morfolojik ve kimyasal değişimler gösterilmiştir. Elektroeğirme işleminde, polimer derişimi %20 (trifloro asetik asit içerisinde, ağırlık/hacim), uygulanan voltaj 12 kV, polimer çözeltisinin akış hızı 5 µL/dk ve iğne ucu ile toplayıcı arasındaki mesafe 12 cm olduğunda, orijinal PET, %20 ve %55 aşılama yüzdesine sahip PET-g-HEMA polimerlerinden sürekli, pürüzsüz, boncuksuz ve ortalama çapı 1000 nm'nin altında nanolifler toplanmıştır. Tez çalışması kapsamında, yara örtüsü olarak kullanılmak üzere, %55 aşılama yüzdesine sahip PET-g-HEMA kopolimerinden elde edilen nanolif membranlar seçilmiş membranların yüzeyine negatif yüklü S-AgNPs'ler adsorbe edilmiştir. Modifiye edilen membranlar SEM, UV-Vis, X-Işını floresans spektrometresi (XRF), elementel analiz, temas açı, mekanik, termal, antibakteriyel ve sitotoksite analizleri incelenmiştir. Antibakteriyel aktivite testleri için Staphylococcus aureus (ATCC 6538) ve Escherichia coli (ATCC 25922) bakterileri kullanılarak disk difüzyon testi ve sıvı kültür testleri yapılmış ve orijinal nanolif yüzeylerin antimikrobiyal etkiye sahip olmadığı, ancak S-AgNPs ile modifiye edilen nanoliflerin antimikrobiyal etkiye sahip olduğu görülmüştür. Biyouyumluluk testleri için ise L929 fibroblast hücre hatları kullanılarak metiltiazol difenil tetrazolyum (MTT) testi yapılmış ve modifiye edilen materyal ekstraktı ile inkübe edilen hücrelerin canlılık oranlarının 1 ve 3 günlük inkübasyonlar sonunda %70'in altına inmediği görülmüştür. In vivo çalışmalarda, Sprague-Dawley cinsi sıçanlarda oluşturulan derin yanık yaraları S-AgNPs'lerin adsorbe edildiği PET-g-HEMA nanolifler ile kapatılmış ve belirlenen günlerde yara küçülmeleri hesaplanarak makroskobik değerlendirmeler yapılmıştır. Bu değerlendirmelere göre, kontrol grupları ile karşılaştırıldığı zaman, S-AgNPs ile kaplı membranların uygulandığı yaraların daha hızlı kapandığı görülmüştür. Ayrıca, yara alanlarından alınan doku örneklerine ait kesitler, histolojik değerlendirmeye tabi tutulmuş ve böylece, nanolifli yüzeyin epitelizasyon üzerindeki etkisi de incelenmiştir.
Plateletçe zengin plazmanın ayrımı için disk tabanlı bir sistemin tasarımı ve geliştirilmesi
Kan, % 55'i plazma denilen sıvıdan ve % 45'i şekilli kan hücrelerinden oluşur. Plazmanın ana görevi besin, atık ürünler, antikorlar, pıhtılaşma proteinleri, hormonlar, vücudun sıvı dengesini korumaya yardımcı proteinler ve kan hücrelerini taşımaktır. Günümüzde yaralı bağ dokunun iyileştirilmesine yönelik kullanımının yanı sıra estetik açıdan da yeni bir yaklaşım sunan plateletçe zengin plazma (PZP) tedavisi, hastanın kendi platelet derişimlerinin enjeksiyonu ile gerçekleştirilen popüler bir uygulamadır. Bu yöntemde, iyileştirme ve geliştirmeye yönelik her bir hastanın kendi iyileşme sistemini kullanarak immun riski en aza indirmek amaçlanmaktadır. PZP tedavisinin daha etkili sonuç verebilmesi için kandan istenilen oranda ve yüksek saflıkta platelet elde edilmesi gereklidir. Bu amaçla günümüzde sadece ticari olarak piyasada bulunan PZP kan tüpleri ve santrifüj yöntemi kullanılmaktadır. Kullanılan 2 ayrı yöntem bulunmaktadır. Bunlar tek santrifüj ile PZP eldesi ve çift santrifüj işlemi ile PZP eldesidir. Tek santrifüj işleminde genellikle kısa sürede yüksek hızlarda, çift santrifüj işleminde ise uzun sürede ve değişken hızlarda santrifüj işlemi yapıldığından, platelet hücrelerinin strese girmelerine, hasar görmelerine, aktif olmalarına, topaklanmalarına ve istenilen saflıkta elde edilememelerine neden olmaktadır. Sunulan tez çalışmasında bu problemlerin en aza indirilebilmesi için, disk tabanlı bir PZP ayırma kiti geliştirilmiştir. Bu ayırma kitinin geliştirilmesinde üç farklı basamak bulunmaktadır. Bunlar sırasıyla, disk tabanlı sistemin geliştirilmesi, santrifüj cihazının geliştirilmesi ve tiksotropik jel'in geliştirilmesidir. Bu amaç doğrultusunda kandaki plateletçe zengin bölgenin hızlı ve basit bir şekilde ayrılmasını sağlamak için ilk olarak, farklı tasarımlara sahip disk tabanlı sistemler Solidworks 2018 Premium programı ile 2- Boyutlu ve 3-Boyutlu olarak geliştirilerek etkinlikleri incelenmiştir. Bu doğrultuda farklı kanal yapıları, kanal tasarımları, yükleme aparatları gibi parametreler kan numunesinin miktarına ve kırmızı kan hücresi/plazma oranına göre optimize edilerek en uygun disk tasarımı belirlenmiştir. Tasarım, lazer kesim cihazı yardımıyla Polimetilmetakrilat (PMMA) tabakalar ve 130 μm kalınlığa sahip çift taraflı bant katmanlarından oluşturulmuştur. İkinci aşamada, disk tabanlı sisteme uygun bir santrifüj cihazı geliştirilmiştir . Bunun için STM32F103 geliştirme kartı programlanarak BLDC Grand Turbo GT2215/09 motor ile birleştirilerek disk tabanlı sisteme uygun merkezkaç kuvvetinin uygulanmasını sağlayacak şekilde tasarlanmıştır. Disk tabanlı sistemin santrifüj işlemi sırasında görüntülenmesini sağlamak için Arduino Uno geliştirme kartı programlanarak Power led'li stroboskop sistemi ile Canon Eos 450D fotoğraf makinesi kullanılmıştır. Üçüncü aşamada ise kandan etkin bir şekilde PZP eldesi için disk tasarımına entegre edilmek üzere tiksotropik jel geliştirilmiştir. Bu jel, ticari olarak piyasada bulunan bir jel ile karşılaştırılarak FTIR ve reolojik özellikleri belirlenmiştir. Reolojik analizler sonucunda, geliştirilen jelin tiksotropik olduğu sonucuna varılmıştır. Sonuç olarak çalışma neticesinde, geliştirilen tiksotropik jelin entegre edildiği uçak tasarımında denemesi yapılan Z şekilli kanal ile elde edilen PZP'nin, platelet sayım analizi yapılmıştır. Analiz sonucuna göre elde edilen PZP'nin tam kandaki platelet sayısını zenginleştirme faktörünün 3,53 kat olduğu tespit edilmiştir. Böylelikle tam kandan, disk tasarımı nedeniyle uygulamada kolay, platelet hücrelerini strese sokmadan düşük santrifüjleme hızında, daha kısa sürede ve uygun maliyetli kırmızı kan hücrelerini ayırıcı jel içeren bir disk tabanlı sistem kullanılarak, PZP eldesi başarı ile gerçekleştirilmiştir. Geliştirilen bu ayırma yönteminin farklı tıbbi amaçlar için PZP uygulamalarında önemli bir ilerleme sağlayacağına inanıyoruz.
Kompozit interferans vidaların geliştirilmesi
Ön çapraz bağ, diz ekleminde femur ve tibia kemiklerini birbirine bağlayan yapılardan biridir. Dizin normal işlev görmesi için çok önemli olan bu bağ, tibia kemiğinin anormal bir şekilde öne doğru yer değiştirmesini engelleyen en önemli yapıdır. Ön çapraz bağ kopması çok yaygın bir spor yaralanmasıdır. Rekonstrüksiyon cerrahisi bu tip yaralanmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Ön çapraz bağ yaralanması olan bireylerde tedavideki amaç dizdeki boşluk ve emniyetsizlik hissini ortadan kaldırmak, kişinin spor veya zorlayıcı aktiviteler sırasında güvenle basabileceği bir diz elde etmektir. Cerrahinin başka bir amacı ön çapraz bağ yaralanması olan kişileri, yaralanma öncesinde bulundukları sağlık seviyesine geri döndürmek ve dizde yeni yaralanmalar oluşmasını engellemektir. Bağ tamiri için genellikle diz çevresindeki kasların kirişleri kullanılır. Bunun için en sık kullanılan dokular dizin ön kısmında yer alan patellar tendon ve dizin arka kısmında yer alan hamstring tendonlarıdır. Bu ameliyatlarda greft adı verilen, kişinin kendisinden alınan bu yeni bağın geçeceği yolu hazırlamak için diz eklemindeki kemiklere tüneller açılır. Bu tendonların ameliyatlarda implante edilmesi için, bağı yerinde tutan ve biyolojik olarak absorbe edilebilir interferans vidalar yaygın olarak tercih edilmektedir. Bu tez çalışmasında ön çapraz bağ ameliyatlarında kullanılan, vücut içinde implante edildikten sonra belirli bir süre sonunda vücut tarafından emilebilen kompozit interferans vidaların ağırlıkça 70/30 % Poli(Laktik Asit-ko-Glikolik Asit) (PLGA) ve β-Trikalsiyum Fosfat (β-TCP) kullanılarak farklı uzunluk ve çaplarda elde edilmesi ve elde edilen vidaların fiziksel, kimyasal ve biyolojik testlerinin sonuçlarının değerlendirilmesi gerçekleştirilmiştir. Buna göre, belirlenen oranda bileşen içeren kompozit denemeleri ile beraber proses sonrası polimerdeki değişime kimyasal olarak bakılmış; sıcaklık, basınç, kurutma gibi proses parametreleri geliştirilmiş ve değerlendirilmiş, ısıl işlemlerin polimer üzerindeki etkileri kimyasal olarak araştırılmış, kompozit interferans vidalar mekanik olarak incelenmiştir. Tez çalışmasının nihai çıktısı kompozit interferans vida üzerinde gerçekleştirilen TGA analizi sonucunda; ağırlıkça 71.08 % PLGA miktarı ve 28.90 % β-TCP miktarı belirlenmiştir. DSC analizi sonucunda; Tg değeri 60.40 (ºC), Tm değeri ise 162.16 (ºC) olarak belirlenmiştir. FT-IR analizi sonucunda; 543 cm-1, 604 cm-1, 945 cm-1, 970 cm-1 bantlarında PO43- (fosfat) grubu pikleri görülmüştür. 1748 cm-1 bandında ise (-C=O-) karbonil pik noktası görülmüştür. Ca3(PO4)2 gruplarının varlığı XRD analizi yardımıyla gerçekleştirilmiştir. Numunedeki kristal boyutu Scherrer formülü yardımıyla 26 nanometre olarak hesaplanmıştır. Hammaddeye uygulanan ICP-MS analizi yardımıyla malzemede Pb (Kurşun) miktarı 0.58 ± 0.03 mg/kg (ppm), Cd (Kadmiyum) miktarı ise 0.19 ± 0.01 mg/kg (ppm) olarak belirlenmiştir. Arsenik ve civa miktarı ise tayin sınırının altında yer almıştır. µ-CT analizi yardımıyla madde yoğunluğunun hacmen %99.99 olduğu belirlenmiştir. 557 tane kapalı por tespit edilmiştir. Altı aylık degradasyon çalışması sırasında başlangıç anında İnherent Viskozite değeri 1,56 dl/g olarak hesaplanmıştır. Pürüzlülük ise yaklaşık olarak 25 µm olarak hesaplanmıştır. Yine başlangıç anı için gerçekleştirilen static torsiyon analizi sonuçlarına göre; Burulma Akma Dayanımı ortalama 6.2 (N.m), Maksimum Tork ortalama 6.6 (N.m) ve Kırılma Açısı ortalama 43 (°) olarak belirlenmiştir.
The investigation of surface modifications on polyester based fibrous matrices for cell expansion in packed bed bioreactors
This study was financially supported by Hacettepe University Scientific Research Projects Coordination Unit (BAP) with the project entitled "The Investigation of The Effects of Surface Modifications on Fiber Based Polyester Matrices for Mesenchymal Stem Cell Production in Packed Bed Bioreactors" (project no: FYL-2018-17359). This study aims to investigate the effects of surface modifications on polyester matrices for mesenchymal stem cell (MSC) production in a packed bed bioreactor. Firstly, sulfuric acid and sodium hydroxide treatments were applied on PET with different parameters in order to increase hydrophilicity and all surface-treated groups of PET disks were examined through water contact angle measurements, Attenuated Total Reflectance-Fourier Transform Infrared Spectroscopy (ATR-FTIR), Scanning Electron Microscope (SEM) and Energy Dispersive X-Ray Spectroscopy (EDS) analyses. After characterization studies, 3M H2SO4 and 0.05M NaOH treated PET disks were further studied in vitro with MC3T3-E1 cells and cell activity was found to be higher in sodium hydroxide treated PET disks than sulfuric acid-treated PET disks. Secondly, collagen type-1 (30 µg/disk) and vitronectin (0.15 and 0.60 µg/disk) were coated on the PET surfaces via physical and chemical immobilization methods. In the characterization studies, hydroxyproline analysis and SEM analysis demonstrated that the physical immersive coating technique was more efficient and resulted in evenly distributed collagen type-1 on the PET disk surface. Meanwhile, the results of SEM and ATR-FTIR analyses of collagen type-1 and vitronectin crosslinking on PET disks were similar to that of the control group. Also, the results of static cell culture conducted with rAdMSCs demonstrated no significant differences between collagen type-1 and vitronectin coated PET disks with plain sodium hydroxide treated PET disks. Thus, sodium hydroxide treated PET disks were selected for dynamic cell culture studies. In the last part of the thesis, rAdMSC expansion was investigated in our custom made packed-bed bioreactor using sodium hydroxide treated PET as packing material. In dynamic studies, two different cell seeding densities were used: 30 x 106 cells/ 1 g disks and 10 x 106 cells/0.5 g disks. The specific growth rate and doubling time of rAdMSCs with higher seeding density were calculated as 0.06 h-1 and 65 h and it was determined that glucose concentration in the culture medium was insufficient. And the specific growth rate and doubling time of rAdMSCs harvested from the bioreactor were calculated as 0.2516 h-1 and 42 h, which were comparable to the characteristic values given in the literature. In the differentiation studies of rAdMSCs harvested from the bioreactor, ALP-von Kossa staining was done in the osteogenic differentiation studies, whereas oil red o staining was done for adipogenic differentiation studies. In addition, it was determined that harvested cells had similar SOX2, Nanog and OCT 4 gene expressions in comparison to the control group. However, in the dynamic studies growth rate of cells in the bioreactor exhibited a trend independent of cell seeding density, which should be further investigated in a more comprehensive cell expansion study. Keywords: Polyethylene terephthalate; Surface Modification; Collagen; Vitronectin; Packed-bed Bioreactor; Mesenchymal Stem Cell Production
Nog gen ifadesi susturulmuş hücrelerin oluşturulması ve ipek doku iskeleleri üzerinde osteojenik farklılaşmalarının incelenmesi
Bu çalışma "CRISPR/Cas9 ile Nog Gen İfadesi Susturulmuş Hücrelerin Oluşturulması ve İpek Doku İskeleleri Üzerinde Osteojenik Farklılaşmalarının İncelenmesi" başlıklı Lisansüstü Tez Projesi (FYL-2018-17253) kapsamında Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından desteklenmiştir. Sunulan tez çalışmasında, öncelikle moleküler gen düzenleme mekanizmaları kullanılarak (CRISPR-Cas9, siRNA), kemik morfogenetik proteini (BMP) sinyal yolağının antagonisti olan Noggin protein sentezinin inhibe edilmesiyle preosteoblastik MC3T3-E1 hücreleri üzerinde moleküler düzenlenmenin gerçekleştirilmesi amaçlanmıştır. Ardından bu hücreler ile üç boyutlu (3B) ipek doku iskelelerinde osteojenik farklılaşmanın arttırılması hedeflenmiştir. Bu hedeflere yönelik olarak, sunulan tez çalışması 4 basamakta gerçekleştirilmiştir. İlk basamakta, Bombyx mori ipek kozalarından ipek çözeltisi elde edilmiş ve çözücü döküm partikül uzaklaştırma yöntemi kullanılarak ipek doku iskeleleri üretilmiştir. SEM görüntüleri ile doku iskelelerinin içsel bağlantılara sahip gözenekli bir yapı sergiledikleri belirlenmiş ve gözeneklilik %93.5 olarak hesaplanmıştır. Büyük gözeneklerin ortalama çapı 448±76 μm, küçük gözeneklerin ortalama çapı ise 85±27 μm olarak bulunmuştur. İpek doku iskelesinin yaklaşık 5. dk'da %1300 değerinde denge su tutma kapasitesine ulaştığı belirlenmiştir. Tez çalışmasının ikinci basamağında, MC3T3-E1 hücreleri üzerinde UltraCruz® ve Lipofektamin®3000 transfeksiyon ajanları kullanılarak kontrol CRISPR plazmidinin transfeksiyon çalışması gerçekleştirilmiştir. Ancak, kullanılan transfeksiyon ajanlarının etkin transfeksiyon için yeterli olmadığı saptanmıştır. Etkin transfeksiyonun sağlanabileceği elektroporasyon veya virüs bazlı transfeksiyon metotlarının kullanılması için laboratuvar koşullarımızın yeterli olmaması nedeniyle transfeksiyon çalışmalarına siRNA ile devam edilmiştir. Üçüncü basamakta, siNog ile MC3T3-E1 hücreleri üzerinde transfeksiyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Öncelikle kırmızı floresan işaretli kontrol siRNA/Lipofektamin®3000 ile transfeksiyon koşulları belirlenmiştir. Sonrasında, iki boyutlu ortamda (2B) MC3T3-E1 hücreleri üzerinde siNog/Lipofektamin®3000 ile transfeksiyon çalışması gerçekleştirilmiştir. Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) analizi sonucunda, siNog grubunda Nog gen ekspresyonunun, kontrol ve negatif kontrol grubuna göre anlamlı derecede azaldığı görülmüştür (p<0.05*). Tezin son basamağında, MC3T3-E1 hücreleri 3B ipek doku iskelesi üzerine ekilmiş ve siNog/Lipofektamin®3000 ile transfeksiyon çalışması gerçekleştirilmiştir. Kültür 100 ng/mL BMP2 içeren osteojenik farklılaşma ortamıyla 21 gün devam ettirilmiştir. Sonrasında, kemik doku oluşumunu ve transfeksiyon etkinliğini incelemek amacıyla; Nog, Alp, Col1a1, Osp ve Ocn genlerinin ekspresyon düzeyleri RT-PCR ile belirlenmiştir. RT-PCR sonucunda, Nog gen ekspresyonunun siNog grubunda başarılı bir şekilde baskılandığı ve özellikle Ocn gen ifadesinin, kültürün 21. gününde siNog grubunda kontrol grubuna göre yaklaşık 5 kat arttığı belirlenmiştir (p<0.05*). Hücrelerin proliferasyon davranışları MTT (3-[4,5-Dimetilazol-2-il]-Difeniltetrazolyum Bromür) testi ile analiz edilmiş ve transfekte hücrelerin hücre yapışmasını ve proliferasyonunu olumsuz etkilemediği sonucuna ulaşılmıştır. SEM analizi ile hücre morfolojisi incelendiğinde, kontrol ve siNog gruplarında hücrelerin gözeneklerin iç kısmına kadar ulaştıkları, başarılı bir şekilde doku iskelesi üzerinde üredikleri gözlemlenmiş ve siNog gruplarında kontrol grubundan farklı olarak mineral yapılarına rastlanmıştır. EDAX analizi ile mineral yapıları incelendiğinde, siNog gruplarında hücreler üzerinde kümelenmiş yoğun Kalsiyum (Ca) ve Fosfor (P) elementlerine rastlanmıştır. Histolojik boyamalar sonucunda, siNog gruplarında yoğun mineralize bölgelerin olduğu görülmüştür. Sonuç olarak, ipek doku iskelesine ekilip siNog ile transfekte edilen MC3T3-E1 hücrelerinin kontrol grubuna göre daha etkin bir osteojenik farklılaşma gösterdiği, mineralizasyondan sorumlu olan Ocn gen ifadesinin daha yüksek seviyede olduğu ve yoğun mineralize bölgelere sahip olduğu belirlenmiştir. siNog ile transfekte edilen preosteoblastik hücrelerin 3B ipek doku iskeleleri ile birlikte kullanılmasıyla, özellikle mineralizasyonun arttırılmasına bağlı olarak kemik doku mühendisliği çalışmalarında avantaj sağlayacağı sonucuna ulaşılmıştır. Anahtar Kelimeler: İpek, siRNA, BMP2, Noggin, Kemik doku mühendisliği
İn vitro diyagnostik sistemlerde kullanılmak üzere yeni nesil elektrotların tasarımı ve geliştirilmesi
Bu çalışmada, in vitro diyagnostik sistem uygulamaları için altın ve elmas benzeri karbon (DLC) ince film özelliklerine sahip elektrotların ilk kez üretilmesi amaçlanmıştır. Çok fonksiyonlu yüzey ve yığın özelliklerine sahip, iletken altın nanoağ bağlı elmas benzeri karbon nanofilm (CGN-DLC) elektrotların hazırlanması için kendiliğinden düzenlenme (self-assembly) yöntemi kullanılmıştır. Geliştirilen nanofilmlerin nispeten yüksek bir sp3 karbon dağılımına, 1,4 × 103 S.cm-1 elektrik iletkenliğine ve 1,42 eV ve 3,87 eV optik bant aralıklarına sahip oldukları bulunmuştur. Azalan tam yansıma-fourier dönüşümü kızılötesi (ATR-FTIR) spektroskopisi ve X-ışını fotoelektron spektroskopisi (XPS) analizleri, DLC yüzeyinde karboksilik asit fonksiyonel gruplarının varlığını ortaya çıkarmıştır. CGN-DLC nanofilmlerinin kalitatif ve kantitatif olarak değerlendirilmesinde yüksek çözünürlüklü geçirimli elektron mikroskopisi (TEM), taramalı elektron mikroskopisi (SEM), X-ışını kırınımı (XRD), RAMAN spektroskopisi, dönüşümlü voltametri (CV) ve elektrokimyasal empedans spektroskopisi (EİS) kullanılmıştır. TEM ve SEM analizleri, CGN-DLC nanofilmlerini üretmek için trisodyum sitrat ve altın nanopartiküllerinin başarılı bir şekilde kullanıldığını göstermiştir. XRD spektrumundan, altın nanoağ yapısına ait Au (111), Au (200), Au (220) ve Au (311) pikleri ve DLC yapısına ait C (002), C (032) ve C (111) pikleri belirlenmiştir. RAMAN spektroskopisi elmas benzeri karbon yapının D ve G bandı piklerini sırasıyla 1388,6 cm-1 ve 1568,0 cm-1 konumlarında göstermiştir. DLC filminin sp3 içeriği de yaklaşık % 30 bulunmuştur. CV ve EİS, CGN-DLC nanofilmlerinin biyosensör uygulamalarında etkili modifiye edici ajan olarak kullanılabileceğini göstermiştir. Sunulan tez kapsamında, zararlı kimyasallar veya fiziksel yöntemler kullanılmadan CGN-DLC nanofilmlerinin elde edilmesi için sürdürülebilir bir yöntem gösterilmiştir. CGN-DLC nanofilm performansını değerlendirmek için, sentezlenen nanofilm kalem grafit elektrot (PGE) üzerine modifiye edilmiş ve prostat kanseri biyobelirteci olan miRNA-410-5p'nin hassas ve seçici olarak elektrokimyasal tayini gerçekleştirilmiştir. Tasarlanan biyosensör platform üzerinde herhangi bir amplifikasyon ve/veya etiketleme işlemi kullanılmamıştır. Hazırlanan biyosensör platformu, 0,3 fM ile 100 fM doğrusal aralığı ve 0,27 fM'lik bir tayin sınırı (LOD) ile diferansiyel puls voltametri (DPV) yöntemi kullanılarak hedef miRNA'ları saptamıştır. Sonuç olarak, sentezlenen CGN-DLC nanofilminin biyo/sensörler, fotovoltaikler, transistörler, amplifikatörler, enerji depolama unsurları ve biyomedikal gibi geniş uygulama alanlarında kullanılması gelecek çalışmalarda beklenmektedir.
Fare testisi mikroskop görüntülerinden yapay zekâ teknikleri ile tübül ve spermatogonyal kök hücre tespiti
Spermatogonyal kök hücreler fertiliteyi sağlayan az sayıdaki sperm öncülleri olup saptanmaları zordur. Puberte öncesi testis hasarıyla gelişen infertilitede spermatogonyal kök hücre havuzunun sayıca belirlenmesi klinik için önemlidir. Görüntü işleme ve yapay zekâ alanındaki bölütleme ve öznitelik çıkartma yöntemleri ile somatik ve germ hücreleri saptanarak sayılabilmektedir. Bu çalışmada bölütleme, öznitelik çıkarımı ve derin öğrenme (YOLOv4) yöntemleriyle testis kesit mikrograflarındaki verilerle seminifer tübüller ve spermatogonyal kök hücrelerin hızlı, pratik ve güvenli bir şekilde tanımlanması ve sayılmasını sağlayan bir biyomühendislik sistemi geliştirileceği varsayılmıştır. Bu varsayımı test etmek için C57BL/6 yeni doğan farelerin testis parafin bloklarının seri kesitlerinde hematoksilen eozin ve spermatogonyal kök hücre belirteci SALL4 ile işaretlenmiştir. 66 dijital mikrografta aktif kontur modeliyle elde edilen seminifer tübül veri setlerinde makine öğrenmesi yöntemleri; destek vektör makineleri, karar ağacı, rastgele orman, naive bayesian, k en yakın komşu ve lojistik regresyon kullanılarak sınıflandırma işlemi gerçekleştirildiğinde sırasıyla %96,5, %96,5, %97,1, %90,4, %89,1 ve %96,5 oranında tespit sağlanmıştır. YOLOv4 tekniğinde kullanılmak üzere seminifer tübül için 12734 adet veri, spermatogonyal kök hücre için 9889 adet veri kullanılarak veri seti oluşturulmuştur. Buna göre seminifer tübüller %94, spermatogonyal kök hücreler %93 oranında tespit edilmiştir. Sonuç olarak, yeni doğan erkek fare testis kesitlerinden elde edilen mikrograflarla oluşturulan bu yapay zekâ teknikleri ile spermatogonyal kök hücrelerin tespitini sağlayarak başarıyla çalışmış olup, elde edilen sonuçlar ileri çalışmalarla geliştirildiğinde, deneysel hayvan modellerinde spermatogonyal kök hücre havuzunun hesaplanması için ve prepubertal testis biyopsisi alınan çocuklarda biyopsi etkinliğini belirlemek üzere kliniğe aktarılabilecek yeni ürünler oluşturma potansiyeli taşımaktadır.
Sinir doku mühendisliği için iletken poli (gliserol-sebakat) kompozitlerinin geliştirilmesi
Periferik sinir yaralanması yaygın bir klinik sorundur ve hastaların yaşam kalitesini etkilemektedir. Geleneksel tedavi yöntemleri sinir hasarlarının giderilmesinde yetersiz kalması araştırmacıların doku mühendisliği alanına daha fazla odaklanmasını sağlamıştır. Periferik sinir yaralanmalarına yönelik geliştirilen sinir kondüitleri dokuya göre ayarlanabilen iskele özellikleri, hücresel olayları desteklemeleri, kolay erişilebilir olmaları gibi nedenlerden dolayı tercih edilmektedir. Bu tez çalışması periferik sinir yaralanmalarında sinir hasarlarının giderilmesini sağlayarak sinir rejenerasyonunu arttırıp doku bütünlüğünü korumayı amaçlamıştır. Bu doğrultuda yüzey desenli poli(gliserol-sebakat) (PGS) elastomerinin iletken materyallerle birleştirilerek sinir doku mühendisliğinde etkinliği değerlendirilmiştir. Çalışmanın ilk aşamasında PGS elastomeri sentezlenmiş ve özelliklerinin sinir dokuya uygunluğu ayarlanmıştır. İkinci olarak elastomer yüzeyine CO2 lazer ile mikro kanallar oluşturulmuştur. Bu kanallar sinir hücrelerinin yönlenmesini sağlamak açısından oldukça önemlidir. Sinir hücrelerini desteklemesi amacıyla PGS elastomeri karbon nanofiber (KNF) ve magnezyum (Mg) alaşımı ile birleştirilmiştir. KNF, elastomerle birleştirilmesi için fonsiyonelleştirilmiş, bu işlemin KNF'nin özelliklerini iyileştirdiği belirlenmiştir. İki farklı AZ31 Mg alaşımı çeşitli karakterizasyon testlerine tabi tutularak yapısal ve hücresel özellikleri daha iyi olan alaşım seçilmiştir. Optimize edilen iletken materyaller kullanılarak kompozit doku iskeleleri üretilerek çeşitli karakterizasyon testleri ile etkinlikleri değerlendirilmiştir. Buna göre iletken materyal katkısının PGS elastomerinin özelliklerinin sinir dokuya uygun olarak iyileştirildiği tespit edilmiştir. Çalışmanın son aşaması PC12 hücre hattı ve S42 hücre hattı ile yapılan in vitro çalışmaları kapsamaktadır. Buna göre iki hücre hattıyla yapılan çalışmada da doku iskeleleri üzerinde hücre proliferasyonunda artış gözlemiş olup bu sonuç çeşitli boyama yöntemleri ve SEM analizi ile doğrulanmıştır. Özellikle PGS elastomerine Mg alaşımının katkısı hücre canlılığını olumlu yönde etkilemiştir. Sunulan bu tez çalışmasında yapılan bütün deneylerin sinir doku mühendisliği çalışmaları için önemli bir katkı olacağına inanılmaktadır.
Tükürükte eroin ve metabolitlerinin toksikolojik analizinde yeni bir analitik gereç olarak yüzey zenginleştirilmiş raman spektroskopi
Eroin, çeşitli analitik yöntemlerle tespit edilebilir ve ölçülebilmektedir. Ancak adli bilim uzmanları ve kriminal laboratuvarlar daha ucuz ve daha hızlı tespit yöntemleri bulmak için çalışmaktadır. Yüzey zenginleştirilmiş Raman spektroskopisi (SERS), genişleyen uygulama alanları ile olası bir alternatif analitik yöntem olarak dikkat çekmektedir. Literatürde eroin ve metabolitlerinin Raman ve SERS spektrumları ile ilgili az sayıda çalışma olup bunlarda birbirleriyle çelişen veriler sunmaktadır. Bu çalışmada, opiat tespiti için en uygun Raman-aktif substratı bulmak ve tükürükte eroin ve metabolitlerinin hızlı miktar analizi SERS yöntemi geliştirilmesi amaçlandı. Analizi yapılan opiatların SERS analizi için en uygun Raman-aktif yüzeyin belirlenmesi amacıyla Morfin standart materyali kullanıldı. Bu amaçla, ince tabaka kromatografi (TLC) kağıdı, gümüş nano yüzey (AgNS), altın nano-parçacık nanoselüloz (AuNP/Nanoselüloz), altın nanoparçacık polianilin (AuNP/Polianilin) ve altın nano-rod (AuNR) yüzeyler karşılaştırıldı. Eroin ve metabolitleri (morfin, morfin-3-ß-glukuronid ve 6-monoasetil morfin) için saf madde ve tükürük numunesi için ayrı kalibrasyon eğrileri oluşturuldu. Farklı konsantrasyonlarda eroin ve metabolitleri içeren tükürük numunelerinin tekrarlı SERS analizi 785 nm lazer kaynaklı Raman mikroskobu, AuNR yüzey ve AgNP sinyal artırıcı kullanılarak gerçekleştirildi. Elde edilen sonuçlar, eroin ve metabolitlerinin SERS tabanlı bir sistem kullanılarak tükürük numunelerinde tespit edilebileceğini ve ölçülebileceğini göstermiştir. Bu çalışma, AuNR yüzey ve gümüş nanoparçaçık (AgNP) sinyal arttırıcının sinerjik etkisinin SERS spektrumunda tanımlanabilir bant sayılarını ve yoğunluklarını artırdığını ortaya koymuştur. Geliştirilen yöntemle ve kalibrasyon bağlamında geliştirilen konsantrasyon intansite eşleşmesi ile oluşturulan formül kullanılarak blank tükürük numunelerinde eklenen konsantrasyonlara çok yakın olarak eroin ve metabolitlerinin miktar analizinin yapılabildiği saptandı. Bu veriler ışığında, tükürük numunesinde eroin ve metabolitlerini tespit etmek ve ölçmek için hızlı, doğru ve fiyat-fayda dengesi açısından çok avantajlı bir yöntem geliştirildi.
Tetrasiklin tayinine yönelik aptamer bağlı peroksidaz benzeri mikropartiküllerin geliştirilmesi
İnsan güvenliğini ve sağlığını korumak için gıdalarda ve sularda biriken antibiyotik kalıntılarının tayinine yönelik hassas ve seçici yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Kullanımı yaygın olan tetrasiklinin kalıntılarının tayini için kullanılan geleneksel yöntemlerin zaman alıcı olması, profesyonel çalışma becerisi gerektirmesi ve tayin için yüksek maliyetli cihazlar kullanılması gibi dezavantajları vardır. Sunulan tez kapsamında, sulu çözeltilerde tetrasiklin antibiyotiğinin tayini için peroksidaz benzeri aktivite gösteren manyetik mikropartikül ve aptamerden oluşan bir biyosensörün geliştirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmada kullanılan peroksidaz benzeri aktivite gösteren manyetik mikropartiküller, son yıllarda kullanılan tetrasiklinin tayin yöntemlerine alternatif oluşturmak için geliştirilmiştir. Bu kapsamda, (3-glisidiloksipropil) trimetoksisilan (GLYMO)-bağlı manyetik silika (MagSiO2) mikropartiküller ve (3-aminopropil)trietoksisilan (APTES)-bağlı mikropartiküller sentezlenmiştir. GLYMO-bağlı MagSiO2 mikropartiküllerin sentezi için, MagSiO2 mikropartikülleri, tolüen ve GLYMO ile 110ºC'de reflux sisteminde 8 saat boyunca reaksiyona girmiştir. Mikropartiküller sırasıyla etanol, ddH2O ve sodyum karbonat (Na2CO3) ile yıkandıktan sonra etilendiamin ve Na2CO3 ile 60ºC'de t=24 st boyunca reaksiyona bırakılmıştır. Reaksiyonun ardından mikropartiküller sırasıyla fosfat tampon çözeltisi (PB) ve ddH2O ile yıkandıktan sonra gravimetrik analiz ile partikülün yoğunluğu belirlenmiş ve mikropartiküller tekrar PB ile yıkanmıştır. APTES-bağlı MagSiO2 mikropartiküllerin sentezi için APTES, MagSiO2 mikropartikülleri, tolüen ve tris-etilamin ile de benzer bir sentez yöntemi izlenmiştir. Mikropartiküllerin peroksidaz benzeri aktivitesini ölçmek için o-fenilendiamin (OPD) kullanılmıştır. GLYMO-bağlı MagSiO2 mikropartiküllerin, APTES-bağlı MagSiO2 mikropartiküllerden daha fazla absorbans değeri verdiği görülmüştür. Gluteraldehit çapraz bağlayacısı ile GLYMO-bağlı MagSiO2 mikropartiküller 18-24 saat süre aralığında, oda sıcaklığında ve karanlıkta reaksiyona girmiş, sonrasında partiküller PB ile yıkanmıştır. Aptamerler ise 5 dakika boyunca 95°C'de denature edildikten sonra 10 dk buzun üzerinde bekletilmiş; aptamer çözeltisi ve mikropartiküller oda sıcaklığında t=2 st boyunca reaksiyona bırakılmıştır. Aptamer tutuklanmış mikropartiküller, PB ile yıkandıktan sonra tetrasiklin çözeltisi (100-200-500-1000-2000 ng/µl) ile karanlıkta t=30 dk boyunca reaksiyona girmiştir. Partikül-aptamer-tetrasiklin PB ile yıkandıktan sonra OPD ile oda sıcaklığında ve karanlıkta, t=45-75 dk zaman aralığında reaksiyona bırakılmıştır. Farklı iyon ve derişimlere sahip tampon çözeltiler kullanılarak değişen aptamerin katlanma şeklinin ve aptamer yoğunluğunun tetrasiklin tayinine olan etkisi de incelenmiştir. OPD çözeltisi hazırlanırken pH, ortam tampon çözeltisi, çözeltinin derişimi ve H2O2 miktarının optimizasyonu yapılmıştır. Plaka okuyucuda OD=450 nm'de yapılan ölçümler sonucunda pH=7 olan fosfat sitrat tampon çözeltisi ile hazırlanmış 10 mM OPD solüsyonu kullanıldığında en yüksek ΔA değerine ulaşılmış ve t=60 dk'nın optimum reaksiyon süresi olduğu sonucuna varılmıştır. OPD'nin reaksiyonunu durdurmak için 3 M HCl kullanılmış, OD=492 nm'de yapılan ölçümler sonucunda HCl miktarı arttıkça absorbans değerinin arttığı, ancak ΔA değerinin azaldığı tespit edilmiştir. Yapılan tüm optimizasyon çalışmaları neticesinde tetrasiklin derişimi taranmış, alt tespit limiti LOD=100 ng/µl olarak bulunmuştur. Sütte izin verilen tetrasiklinin maksimum kalıntı limitleri ise Avrupa Birliği'nde 200 ng/µl'dir. Sonuç olarak bu çalışmada, tetrasiklini tayinine yönelik kullanımı kolay, düşük maliyetli, enzim benzeri özellik gösteren mikropartiküller ile aptamer-bağlı bir biyosensör geliştirilmiştir.
Trikalsiyum fosfata bağlanmış mezenkimal kök hücre eksozomlarının kemik yenilenmesine etkisi
Kemik fizyolojik koşullarda kendini yenileyebilen bir doku olmasına rağmen metabolik hastalıkları, nekrotik ya da travmatik hasarlarında yapı ve işlevleri bozulabilir. Kritik kemik kayıplarının, kemik inorganik matriksinin ana bileşeni osteokondüktif kalsiyum fosfat bileşiklerinin yanında osteoindüktif büyüme faktörleri ya da bunlara kaynak sağlayan kök/öncül hücreler ile desteklenmesi gereklidir. Mezenkimal kök hücre eksozomları, kemikte rejeneratif etkili molekülleri içermeleri, hedef hücreye kolayca alınmaları ve immün yanıt oluşturmamaları nedeniyle, mezenkimal kök hücreler yerine tercih edilebilir. Bu çalışmada anneksin V ile kalsiyum eksik hidroksiapatite kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomları bağlanarak oluşturulan biyomühendislik temelli formülasyon ile osteoblastların çoğalma, matriks sentezi ve mineralizasyonunun uyarılabileceği varsayılmıştır. Bu hipotezi test etmek için, deney ve kontrol gruplarını içeren in vitro deney düzeneğinde (1) kalsiyum eksik hidroksiapatitin üretilmesi ve karakterizasyonu, (2) insan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomlarının izolasyonu ve karakterizasyonu, (3) kalsiyum eksik hidroksiapatit ve insan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomlarının anneksin V aracılığı ile bağlanması, bağlanma ve salımın karakterizasyonu, (4) oluşan bu formülasyonun osteoblastların çoğalma ve mineralizasyonuna etkisinin değerlendirilmesi hedeflenmiştir. Hedefler doğrultusunda kimyasal çöktürme yöntemiyle kalsiyum eksik hidroksiapatit sentezi gerçekleştirilmiştir. Kalsiyum eksik hidroksiapatitin X-ışını difraksiyonuyla ve Raman spektroskopisiyle yapısal karakterizasyonu, geçirimli elektron mikroskobunda morfolojik karakterizasyonu yapılmıştır. İnsan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler morfoloji, kültür plağına tutunma, spesifik yüzey belirteçleri ve kondrojenik farklılaşma analizi yöntemleriyle karakterize edildikten sonra ultrasantrifüjleme ve MACS yöntemleriyle eksozomları izole edilmiştir. Eksozomlar transmisyon elektron mikroskobunda değerlendirilmiş; BCA analizi ile protein konsantrasyonları, NTA yöntemiyle partikül sayısının ve partikül boyutlarının analizi yapılmıştır. Akım sitometresiyle CD 9 ile yakalanan eksozomların CD63 ile ve CD81 ile işaretlendikleri, her üç belirtece de sahip oldukları gösterilmiştir. Kalsiyum eksik hidroksiapatite, anneksin V aracılığıyla insan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomlarının bağlanması; Raman spektroskopisi ve jel elektroforezi ile gösterilmiştir. Kalsiyum eksik hidroksiapatite bağlı eksozomların BCA analiz yöntemi ile ilk 12 saatte büyük çoğunluğunu kontrollü olarak saldığı gösterilmiştir. Kalsiyum eksik hidroksiapatit ve insan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomlarının insan fetal osteoblastlarındaki etkili proliferatif dozu gerçek zamanlı impedans temelli olarak 1. günden 3. güne ölçülmüş ve sırasıyla 0.1 µg/ml ve 25 µg/ml olarak belirlenmiştir. Belirlenen etkili dozlarda hazırlanan formülasyon osteoblastlara uygulandığında gerçek zamanlı olarak osteoblastların çoğaldıkları; matriks sentezi ve mineralizasyonu gösteren ALP aktivitesinin 0-7 gün zaman aralığında kontrol grubuna göre arttığı saptanmıştır. Sonuç olarak bu tez çalışması ile ilk kez kalsiyum eksik hidroksiapatit, anneksin V ile kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomlarına bağlanarak orijinal ve yenilikçi, yüksek teknolojik, kişiye özel ve hedefli bir formülasyon geliştirilerek in vitro koşullarda insan osteoblastlarındaki yenileyici etkisi ortaya konmuştur. Bu yeni formülasyonun in vivo hastalık modellerindeki deneysel validasyonunu takiben klinikteki metabolik ya da travmatik kemik hasarlarının onarılmasında otojenik, kişiye özel ya da allojenik bir tedavi ajanı olarak yer alma potansiyeli bulunmaktadır. Tez kapsamındaki biyomühendislik temelli yeni tedavi ürününün ülkemizin ortopedik hastalıkların tedavisine ait uluslararası pazarda rekabet gücünü arttırma hedefini karşılaması önemlidir. Bu kapsamda, tezden elde edilen çıktılar ile Hacettepe Teknokent Teknoloji Transfer Merkezi Patent Ofisine patent başvurusu yapılmıştır (Başvuru no: 2021/002221).
Biyobozunur plastik polihidroksialkanoatların bacillus megaterium'da genetik mühendisliği yoluyla üretiminin artırılması
Günümüzde yaygın bir şekilde kullanılmakta olan fosil yakıt türevli plastik malzemeler, hafiflik, kolay şekillendirilebilme, hammadde ve imalat açısından ekonomik olmaları gibi avantajlarıyla hemen her alanda artan bir üretim ve tüketim değerine sahiptir. Ancak bu plastikler doğada uzun zamanda parçalanmaları ve içerdiği kanserojen bileşenler nedeniyle insan ve çevre sağlığına ciddi tehdit oluşturmaktadır. Sınırlı fosil yakıt kaynaklarının hızla tükenmesiyle birlikte petrol bazlı plastiklerin yerini alabilecek alternatif malzemelerden birisi de biyoparçalanabilirlik ve biyouyumluluk özellikleri bulunan polihidroksialkanoatlardır (PHA). PHA, oksijen, azot ve fosfor gibi bileşenler yönünden zayıf, karbonca zengin bir besi yerinde, hücresel stres anında kullanılmak üzere sentezlenen poliesterlerdir. Ancak, bu biyopolimerlerin ticari olarak tercih edilebilmesi için bakterilerde üretim verimlerinin arttırılması gerekmektedir. Bu tez çalışmasında, PHA'yı rekombinant (r)-Bacillus megaterium bakterisinden çeşitli genetik modifikasyonlarla yüksek verimlilikte üretmek için genetik mühendisliği yöntemleri uygulanmıştır. B. megaterium genomunda bulunan PHA sentez genleri phaC ve phaR ekspresyon vektörüne klonlanarak (r)-B. megaterium suşu ilk kez geliştirilmiştir. Doğal fenotip B. megaterium NRRL B-14308 suşu ile phaC-phaR genleri overekspres edilmiş (r)-B. megaterium suşu ve daha önce araştırma grubumuzda geliştirilmiş olan ve phaC geni overekspres edilmiş (r)-B. megaterium suşunda üretilen PHA'nın üretim verimleri ve üretilen PHA'ların yapıları karşılaştırılmıştır. Orbital çalkalamalı biyoreaktörde 72 saat inkübasyon sonucunda pC-HIS1623hp-phaC-phaR, pC-HIS1623hp-phaC ve kontrol grubu olan pC-HIS1623hp plazmidlerini içeren (r)-B. megaterium suşlarından sırasıyla 2,3 g L-1, 2,2 g L-1 ve 2,1 g L-1 verimlerinde PHA elde edilmiştir. PHA sentezi için gerekli olan PhaC ve PhaR proteinleri SDS-PAGE yöntemli ile teyit edildikten sonra, çözücü ekstraksiyonu yöntemiyle saflaştırılan biyopolimerlerin yapısal ve termal özellikleri Gaz Kromatografisi (GC-FID), Fourier Transform Infrared Spektroskopisi (FT-IR), Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (1H-NMR), Termogravimetrik Analiz (TGA) ve Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) analizleri ile karakterize edilmiştir. Rekombinant suşlardan elde edilen PHA'ların karakterizasyonları sonucunda polimerlerin kopolimer (PHB-ko-PHV) yapısında olduğu ve 3-hidroksibütirat (3HB) ile 3-hidroksivalerat (3HV) monomer birimlerinden oluştuğu belirlenmiştir.
Hücre ölüm yolaklarının tespiti için kağıt tabanlı biyosensör tasarımı
Sunulan tez kapsamında, apoptozun erken (ekstrinsik yolak) ve geç (instrinsik yolak) safhasının tespitinde kullanılmak üzere kağıt tabanlı biyosensör tasarımı gerçekleştirilmiştir. Çalışmada geleneksel apoptoz tayin yöntemlerinin yüksek maliyet, büyük hacimlerdeki örneklem gereksinimi, uygun laboratuvar ve ekipman koşulları gibi dezavantajları bertaraf etmek için daha ucuz, kolay, düşük hacimlerde örneklem kullanımı sağlayan ve daha hassas kantitatif sonuçlar veren kağıt tabanlı bir sistem geliştirilmiştir. Çalışmanın ilk aşamasında; ilk olarak örneklem ile etkileştirilecek manyetik nanopartiküllerin sentezi ve primer kaspaz antikorlarının bu nanopartiküllerin yüzeyine immobilize edilmesi gerçekleştirilmiş ve taramalı elektron mikroskobu (SEM), Zeta potansiyel ve boyut ölçümü, Fourier dönüşümlü infrared spektroskopisi (FTIR), Termogravimetrik Analiz (TGA), Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) ile karakterize edilmiştir. Primer antikor immobilize manyetik nanopartiküllerin standart kaspaz proteinleriyle oluşturduğu kompleksin optimizasyonu ve seçicilik çalışmaları HPLC sistemi ile incelenmiştir. Optimizasyon çalışmaları kapsamında pH: 7.4'te protein konsantrasyonları (11,2-0,7 mg/mL), optimal süre (5-90 dk), sıcaklık (4-42°C) parametreleri incelenmiştir. Optimal koşullar pH: 7.4, konsantrasyon; 5,6 μg/mL, süre: 45 dk ve sıcaklık: oda sıcaklığı olarak belirlenmiştir. Seçicilik çalışmaları kapsamında ise yarışmacı proteinlerin ( Kaspaz-3, Kaspaz-8, Kaspaz-9 ve lizozim) adsorbsiyonu araştırımıştır. Aynı yarışmacı proteinler kontrol grubu olarak antikor immobilize edilmeyen manyetik nanopartiküllerle de etkileştirilmiştir. Daha sonra toplama bölgesine immobilize edilecek upconversion silika nanopartiküllerin sentezi ve bu partiküllere sekonder antikorun immobilizasyonu gerçekleştirilmiş ve taramalı elektron mikroskobu (SEM), Zeta potansiyel ve boyut ölçümü, Fourier dönüşümlü infrared spektroskopisi (FTIR), Termogravimetrik Analiz (TGA), Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) ile karakterize edilmiştir. Ardından primer antikor immobilize edilmiş manyetik nanopartiküllerle optimal koşullarda muamele edilmiş standart kaspaz proteinlerinin, sekonder antikor immobilize edilmiş upconversion silika nanopartiküllerle dispersiyon ortamında oluşturduğu suprakompleksin zeta potansiyel ve boyut ölçümü ve florasan emisyon spektrometresi analizi gerçekleştirilmiştir. Bu analizlerin sonucunda dispersiyon ortamında oluşan sandviç ELISA modelinin upconversion özelliğini koruduğu ve yapıya katılan protein miktarının artmasıyla bu özellikten kaynaklı emisyon yoğunluklarında düşüş olduğu gözlenmiştir. Bu da kantitatif bir sonuç elde edilebilmesini sağlamıştır. Çalışmanın ikinci aşamasında hücre deneyleri gerçekleştirilmiştir. Bu kapsamda 100 μM Cisplatin ile muamele edilen ve edilmeyen MCF-7 meme kanseri hücre hattı kullanılmış ve bu hücrelerin lizatından elde edilen proteinler tasarlanan sistem ile dispersiyon ortamında analiz edilerek kaspaz protein miktarları saptanmıştır. Elde edilen sonuçlar geleneksel apoptoz tayin yöntemleri ile (İkili boyama, Annexin-v, MTT) karşılaştırılmıştır. Çalışmanın üçüncü aşamasında ise kağıt tabanlı sistem tasarlanmıştır. Bu amaçla, kullanılacak olan kağıt boyutu, üzerinde toplama bölgesine immobilize edilecek sekonder antikor immobilize upconversion slika nanopartikül hacmi (2,5-12,5 μL) ve örnek bölgesinden uzaklığı, örnek bölgesine damlatılacak primer antikor immobilize manyerik nanopartiküllerin hacmi (10-100μL) belirlenmiştir. Ardından dispersiyon ortamında standart kaspaz proteinlerle ve hücre lizatlarıyla gerçekleştirilen çalışmalar kağıt üzerinde incelenmiştir. Dispersiyon ortamından elde edilen sonuçlar ile kağıt üzerinde gerçekleştirilerek elde edilen sonuçlar karşılaştırılarak validasyon yapılmıştır. Tüm bu çalışmaların sonucunda tasarlanan kağıt tabanlı sistem ile geleneksel yöntemlerden daha hassas ve güvenilir sonuçlar elde edilebileceği gösterilmiştir.
İçeceklerde bulunan amaranth tayinine yönelik sensörlerin hazırlanması
Çalışma kapsamında moleküler baskılama tekniği kullanılarak içeceklerde ve çeşitli gıda ürünlerinde kullanılan ve sağlığa zararlı olduğu bildirilen, bir azo gurubu gıda boyası olan Amaranth tayini için Amaranth baskılanmış yüzey plazmon rezonans (SPR) sensör hazırlanmıştır. Öncelikle fonksiyonel monomer olarak metakrilik asit (MAA) ve akrilamid (AM) kullanılarak Amaranth baskılanmış nanopartiküller (MIP), etilen glikol dimetakrilat (EGDMA) ve hidroksi etil metakrilat (HEMA) polimerizasyonu ile hazırlanmıştır. Kontrol gurubu deneyleri için ise Amaranth kullanılmadan aynı kimyasallar ile Amaranth baskılanmamış nanopartikül (NIP) sentezi yapılmıştır. Hazırlanan nanopartiküller Zeta-boyut analizi, FTIR-ATR spektroskopisi ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak karakterizasyon işlemleri yapılmıştır. SPR altın çip yüzeyi nanopartiküllerin bağlanması için allil merkaptan ile modifiye edilmiş ve Amaranth baskılanmış nanopartiküller SPR çip yüzeyine immobilize edilmiştir. Sensör çip yüzeyi elipsometri, temas açısı ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile karakterize edilmiştir. Karakterizasyon işlemleri ile uygun koşullar belirlendikten sonra Amaranth baskılanmış sensör ile pH 7.4 fosfat tamponu ile hazırlanmış Amaranth çözeltileri (0.1-150 mg/mL) analiz edilerek sensörün ölçüm hassasiyeti araştırılmıştır. Elde edilen sensorgramlar ile yapılan hesaplamalar sonucunda hazırlanan sensörün % 99 doğruluk ile ölçüm yaptığı, tespit sınırının (LOD) 0.0180 mg/mL, tayin sınırının (LOQ) ise 0.06 mg/mL olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Farklı derişimlerde Amaranth çözeltileri ile yapılan ölçüm ve değerlendirmeler, adsorpsiyon kinetiğini belirlemek için kullanılmış ve hazırlanan sensör için en uygun adsorpsiyon modelinin Langmuir modeli olduğu tespit edilmiştir. Sensörün seçicilik çalışmaları için aynı azo gurubu gıda boyaları olan Tartrazin ve Allura Red çözeltileri kullanılmıştır. İçeceklerden Amaranth tayini için hazırlanan sensörün gerçek örnek analizleri için piyasada satılan meyve suyu örneklerinden Amaranth tayini yapılmış, elde edilen sensorgramlar ile meyve sularında bulunan Amaranth miktarı belirlenmiştir. Validasyon çalışmaları için ise sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) tekniği kullanılmıştır. Yapılan tüm analizlerin ardından son işlem olarak aynı gün art arda ve 1, 2, 4, 6. aylarda yapılan kinetik analizlerle sensörün tekrar kullanılabilirliği ve kullanım ömrü araştırılmıştır. Çalışmalar, hazırlanan Amaranth baskılanmış SPR sensörün içeceklerden Amaranth tayini için hassas, hızlı, eş zamanlı ölçüm yapabilen ve tekrar kullanılabilir, uygun maliyetli bir teknik olduğunu göstermiştir.
Konjenital septal defektlerin onarımına yönelik perikard bazlı rejeneratif kardiyak yamaların doku mühendisliği yöntemi ile geliştirilmesi
Kardiyak yamalar konjenital kalp hastalıklarının ve miyokardiyal enfarktüs (MI) tedavisinde yaygın olarak kullanılmakla birlikte henüz ideal bir kalp yaması geliştirilmemiştir. Bu tez kapsamında konjenital septal defektler, MI onarımı gibi çeşitli kardiyak doku hasarlarında kullanılmak üzere rejeneratif kardiyak yamaların doku mühendisliği yöntemi ile geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla tez çalışmasının birinci bölümünde sıçan kemik iliğinden izole edilmiş mezenkimal kök hücreler (rt-MKH) aselüler perikard dokusuna ekilerek 10 µM 5-Azasitidine (5-Aza) maruz bırakılmış ve kalp atımının mekanik ve elektriksel uyarımlarla taklit edildiği biyomimetik biyoreaktör sisteminde kültür edilmiştir. Uygulanan biyofiziksel uyarımların kardiyomiyosit faklılaşması üzerine etkileri incelenmiştir. qPCR analiz sonuçları kök hücrelerin elektromekaniksel uyarımlar altında kardiyak spesifik belirteçlerini (GATA-4, MEF2C, NKX2.5 ve CACNA1C) ifade ettiğini göstermiştir. Elektromekaniksel uyarım uygulanarak geliştirilmiş kardiyak yamaların in vivo etkinlikleri MI modelinde test edilmiştir. İmplantasyondan 21 gün sonra denekler sakrifiye edilerek histolojik analizler yapılmıştır. Sonuçlar, MI modelinin başarılı bir biçimde oluşturulduğunu, yara bölgesinde yama kaynaklı kalsifikasyonunun görülmediğini, elektromekaniksel olarak uyarılmış yamaların kullanıldığı grupta daha fazla hücrelerin yamadan yara bölgesine göç ettiği ve daha düşük düzeyde inflamasyonun geliştiğini göstermiştir. Ayrıca hem yara bölgesinde hem de yara bölgesinden çıkarılan yamada temel kasılma birimi olan sarkomer yapısı ile ilişkili proteinleri (kardiyak troponin T (cTroT), miyozin ağır zinciri (MHC), sarkomerik alfa aktinin (SAC)) ve hücreler arasındaki mekanik bağlantı birimi olan N-kaderini (nCAD)) ifade eden hücrelerin olduğu görülmüştür. Çalışmanın ilk bölümünde umut vaden sonuçlar elde edilmiş olmakla birlikte biyofiziksel uyarımların kök hücrelerin kardiyomiyojenik farklılaşmasında yeterli olmadığı ve yeni stratejilerin geliştirilmesi gerektiği sonucuna varılmıştır. Bu nedenle tez çalışmasının ikinci bölümünde ise rt-MKH'lerde kimyasal (5-Aza ve dimetilsülfoksit (DMSO)) ve biyolojik stimülatörlerin (TGF-β1, FGF-2 ve BMP-2) birlikte kullanılarak çeşitli farklılaştırma prosedürleri test edilmiştir. 7. günün sonunda 5-Aza (10 µM) ve DMSO'nun (%1) birlikte kullanıldığı grupta yüksek hücre canlılığı ve en yüksek kardiyak spesifik belirteçlerin elde edildiği gözlenmiştir. 5-Aza ve DMSO'ya maruz bırakılan hücrelerin kardiyak spesifik proteinleri (cTroT, SAC, konneksin 43 (Cnx43) ve α-düz kas aktini (α-SMA)) ifade ederek kardiyomiyositlere farklılaştıkları, ancak organize olmayan bir sarkomer yapısı ve protein paterni bakımından fetal dönem kardiyomiyosit yapısı gösterdikleri gözlemlenmiştir. Organize sarkomer yapısı ve yetişkin dönem fonksiyonel kardiyomiyositler elde etmek için insan ve sıçan kaynaklı kemik iliği MKH'leri (h-MKH ve rt-MKH) epigenetik yeniden programlama (asetilasyon aktivasyonu ve metilasyon inhibisyonu) ve biyolojik yolak manipülasyonlarını (WNT ve TGFβ sinyal yolaklarının inhibisyonu) sağlayacak küçük moleküllere (valproik asit (Va), 5-Aza, DMSO, IWP-2 (WNT inhibitörü), repsox (TGFβ inhibitörü)) maruz bırakılmış ve hücre morfolojisi, hücre canlılığı, kardiyak spesifik belirteçlerin gen ve protein düzeyindeki ifadesi incelenmiştir. Sonuçlar, hücre kaynağına ve küçük molekül kombinasyonuna bağlı olarak farklı hücre morfolojisi ve kardiyak spesifik gen ifadesinin elde edildiğini göstermiştir. h-MKH'lerde yüksek hücre canlılığı ile birlikte kardiyomiyosit benzeri homojen bir morfoloji (uzamış iğsi bir görünüm) ve GATA-4, NKX2.5 ve MEF2C ifadelerinde rt-MKH'lerine göre anlamlı düzeyde artış meydana geldiği izlenmiştir. 14 gün sonunda yapılan immünfloresan boyama analiz sonuçları uygulanan farklılaştırma prosedürüne ve hücre kaynağına bağlı olarak protein ifade paterni ve sarkomer organizasyounun değiştiğini göstermiştir. Her iki hücre tipinin uygulanan tüm farklılaştırma prosedürleri ile translasyonel düzeyde kardiyomiyositlere farklılaştığı ancak rt-MKH'lere kıyasla h-MKH'lerin Cnx43, cTroT ve α-SMA ifadesi bakımından yetişkin kardiyomiyositlere daha çok benzediği ve daha organize sarkomer yapısına sahip olduğu görülmüştür. Sonuç olarak kardiyak doku mühendisliği uygulamalarında çeşitli küçük molekül kombinasyonları kullanılarak MKH'lerin daha yüksek verimle kardiyomiyosit hücrelerine farklılaştırılabildiği gösterilmiştir. Ayrıca yetişkin kardiyomiyositlerin elde edilmesinde h-MKH'lerin daha uygun hücre kaynağı olduğu sonucuna varılmıştır.
Development of JAK1 sIRNA mediated nanotherapeutics for non-melanoma skin cancer therapy
Non-melanoma skin cancer is one of the most common cancers with still no effective treatment. Due to the side effects observed after long and high dose treatments and acquired resistance to the chemotherapy drugs, different attempts have been made to overcome these problems and to provide more effective treatment with low dose usage. With successful results and advances in gene therapy, it has been observed that concurrent gene silencing and drug administration may be a better approach in cancer treatment compared to drug/drug combination therapies. The main purpose of this study was to investigate the therapeutic efficiency of liposomal formulation for delivery of both JAK1 siRNA and 5-Fluorouracil (5-FU) in non-melanoma skin cancer. For this purpose, combined nanoliposome formulations containing both 5-fluorouracil (5-FU), a cytotoxic chemotherapeutic agent, or JAK1 (Janus kinase 1) siRNA have been prepared and characterized in terms of size, polydispersity, zeta potential, morphology, encapsulation efficiency, cytotoxicity, and stability. Prepared liposomal nanoformulations were uniform and had a size of 80-120 nm, the PDI below 0.3, and remained stable for a period of 3 months. Positive zeta potential of liposomal nanoformulations successfully internalized across cell membrane, and delivered 6-FAM or cy5 labeled siRNA to the cells even within 30 minutes of incubation, and could remain in the A-431 cells as observed under fluorescence or confocal microscope. Encapsulation or hydrophilic 5-FU in the nanoliposomes was achieved at different drug/lipid ratios, and showed the highest encapsulation efficiency at the 0.2 drug/lipid ratio, and had the 1st order release kinetics. In the evaluation of nanoliposome formulations toxicities, cells express viability over 80 % for the treatment concentrations up to 5x103 µg/mL after 24 hours of incubation. Prolonged incubation reduced cell viability to 70 % at the concentration of 5x103 µg/mL. Delivery of 5-FU using nanoliposome formulations resulted in a significant reduction of cell viability after 24 hours incubation at the 5-FU concentration of 5 µM and above (p<0.05). Evaluation of JAK1 mRNA expression was done using RT-qPCR, proceeding with relative protein expression using Western Blot analysis. Nanoliposome formulations containing JAK1 siRNA were effective for in vitro gene silencing, by inhibition of mRNA expression by 50 %. Similarly, JAK1 protein level was also reduced after treatment with JAK1 siRNA nanoliposomes. After finalizing in vitro gene knockdown studies, in vivo studies have been initiated. Treatment efficacy with the most optimal formulations was evaluated in nude male mice. First of all, the tumor model was formed with inoculation of 1X106 to the right flank region of mice and after tumor volume reached approximately 50-100 mm3, intratumoral administration of nanoliposome formulations containing 5-FU or JAK1 have been initiated. Nanoliposomes formulations containing either 5-FU, JAK1 siRNA or both, significantly suppressed the tumor volume increase compared to the control group (p<0.05), showing the tumor inhibitory rate of approximately 80 % after 28 days of treatment. With relatively less tumor areas observed, 5-FU or siRNA containing groups also reduced the expression of JAK1, ERK, AKT, pAKT, pERK proteins. In addition, JAK1-siRNA loaded nanotherapeutics strongly induced apoptosis in vivo. Based on these findings, the delivery of JAK1 siRNA and 5-FU by developed nanoliposomes appears to be a promising treatment strategy for non-melanoma skin cancer. Keywords: nanotherapeutics, liposomes, JAK1 siRNA, 5-FU, gene silencing, tumor inhibition
Menisküs doku mühendisliği için hibrit doku iskelelerin geliştirilmesi
Ortopedi cerrahisinde yürütülen en sık prosedürlerden biri ilerleyen yaş, yaranmalar ve çeşitli travmalar sonucunda meydana gelen menisküs lezyonlarının tedavisidir. Menisküs yaralanmalarındaki artma oranı, efektif bir onarım stratejisi geliştirilmesindeki acil ihtiyacın göstergesi olmaktadır. Doğal menisküs dokusunun mikroskobik ve makroskobik özelliklerini taklit edebilecek bir malzeme halen araştırılmaya devam etmektedir. Tez çalışması kapsamında, menisküs dokularının hücresizleştirilmesi ile ultrayapının korunduğu ve jel sisteminin entegre edilerek in situ çapraz bağlanabilir 3B iç içe geçmiş ağ yapılarından oluşan aselüler hibrit iskeleler elde edilmiştir. Tezin ilk kısmında deselülerizasyon metotlarının bir karşılaştırılması yapılmış; Süperkritik karbon dioksit (scCO₂) teknolojsi özgün bir yöntem olarak menisküs dokusunda denenmiştir. Fiziksel ön işlem, tripsin ajanı ile enzimatik ajitasyon ve SDS ajanı ile kimyasal ajitasyonu birleştirilerek % 82 genomik DNA azalmasını sağlayan optimum metot ortaya çıkarılmıştır. scCO₂ deselülerizasyonunda ise fiziksel ön işlem ardından tripsin ajanı ile penetrasyon derinliği artırılmış ve 37°C ve 4500 psi basınçta 1 saat prosesin gerçekleştiği grup % 76 DNA azalması ile optimum grup olarak belirlenmiştir. H&E ve DAPI boyamaları ile de grupların hücresizleştirildiği kanıtlanmıştır. Kolajen fiberlerin görüntülenmesi Masson Trichrome boyaması; proteoglikan yapılarının dokudaki varlığı Safranin/FCF boyaması ile sağlanmıştır. Histolojik çalışmalara senkronize olan biyokimyasal analizlerde ise Hidroksiprolin analizi ile kolajen miktarlarında değişme yaşanmadığı fakat DMMB analizinde GAG miktarında konvansiyonel deselülerizasyon grubunda % 42 ve scCO2 grubunda % 58 azalma yaşanmıştır. Her iki grupta da yaş ve kuru ağırlıklarında düşüşler yaşanırken scCO2 grubunda daha fazla azalma görülmüştür. SEM analizi ile kolajen demetlerinin organizasyonuna bakılmış ve deselülerizasyon sonucu minör gevşemeler bulunmuştur. GAG kaybına bağlı olarak deselülerize dokularda kompresif modulüsleri 22,8 ± 0,91 MPa'dan konvansiyonel deselülerize iskelede 15,26 ± 0,28 MPa ve scCO deselülerize dokuda 14,49 ± 0,48 MPa 'a düşüş yaşanmıştır. MTT elüsyon metodu ile sitotoksisite testi yapılan dokularda her iki grubun da % 75 üzeri hücre canlılığı tespit edilmiştir. Çalışmanın ikinci bölümünde hibrit yapıların sentezlenebilmesi için polimer karışımları ve foto başlatıcı optimizasyonu yapılmıştır. Öncellikle jelatin molekülü metakrilik anhidrit eklenerek fonksiyonelleştirilmiş ve fonksiyonelleşme derecesi ¹HNMR analizi ile %75 bulunmuştur. LAP foto başlatıcısının absorbsiyonunun UVA ışık spektrumu ile çakışması hızlı bir in situ polimerizasyon sağladığı görülmüştür. GelMA ve desteklediği hidrojellere, LAP ve I2959 ile UV ışık altında çapraz bağlanarak oluşturulan yapılara, şişme, mekanik ve FTIR analizleri yapılmıştır. Tek fazdan ise 2 fazlı hidrojellerin daha stabil ve dayanıklı yapılar olduğu gözlenmiştir. HAMA molekülü 3. Fazı sağlaması adına yapılara eklenmiş ve en yüksek mekanik dayanımı sağlayan grup olmuştur. Nihai alternatif aselüler iskelenin üretilmesinde GelMA-Hibrit(G-Hibrit), PEGDMA/HAMA-Hibrit(PG-Hibrit) ve PEGDMA/GelMA/HAMA-Hibrit(PGH-Hibrit) yapıları LAP foto başlatıcısı ile oluşturulmuştur. Pre-jeller 5 mm kuru doku iskelesine emdirilmiş ve inkübasyonu sağlanmıştır. UV ışık ile arkalı önlü çapraz bağlanan gruplardaki kimyasal değişimler FTIR analizi ile incelenmiş ve karakteristik pikleri ortaya konulmuştur. Şişme testi ile çapraz bağlanan iskelelerdeki su alma kapasiteleri ölçülmüş ve çapraz bağlanan iskelelerin doğal dokuya yakın şişme fenomeni gösterdiği bulunmuştur. Basma analizi ile mekanik dayanımındaki iyileşmeler çapraz bağlı iskelelerde görülmüş ve buradan çapraz bağlama yoğunluğu en fazla olan PGH-Hibrit grubu bulunmuştur. Aselüler iskelelerin termal özelliklerinin saptanabilmesi için TGA ve DSC analizi yapılmış ve çapraz bağlanmış yapıların dekompozisyon ve protein denatürasyon sıcaklıklarında iyileşmeler gözlenmiştir. SEM ile doku iskeleleri içerisindeki 3B hidrojel yapılarının kolajen fiberleri kaplaması görüntülenmiştir. Çapraz bağlanan iskeleler PBS ve enzimatik degredasyonda % 25 altı ağırlık kaybı ile doğal dokuya benzer bir davranış sergilemiştir. Deselülerize ve hibrit iskelelere L929 hücre hattı kullanılarak Alamar Mavisi ile 1., 4. ve 7. günlerdeki hücre proliferasyonu incelenmiştir. 1. günde kontrol gruba göre % 80 üstü olan canlılık hibrit yapılarda 7. günde daha fazla yükseliş göstererek kontrol grup ile yakın olmuştur. Burada GelMA ve HAMA polimerinin hücrenin göçü ve proliferasyonunda daha etkin olduğu PGH-Hibrit grubunda görülen hücre canlılık oranının en yüksek olması ile anlaşılmıştır. Oluşturulan biyomalzemenin ayarlanabilen fizikokimyasal ve mekanik özellikleri ile menisküs doku mühendisliğinde kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.
Hücresizleştirilmiş sığır gözü kası ve PCL-kas matriksi doku iskeleleriyle göz kası rejenerasyonu
Bu çalışma, "Hücresizleştirilmiş Sığır Gözü Kası ve PCL-Kas Matrisi Kompozit Doku İskeleleriyle Göz Kası Rejenerasyonu" başlıklı 1002 Hızlı Destek Projesi (Proje no: 119S915) kapsamında TÜBİTAK tarafından desteklenmiştir. Sunulan tez çalışması kapsamında, ciddi kas dokusu kaybı ve tiroid oftalmopati gibi patolojik durumlarda pratik uygulamalara elverişli ideal doku iskelesinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Çalışma kapsamında öncelikle, sağlıklı göz kası dokusu rejenerasyonunu desteklemek için poli(kaprolakton) (PCL), poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) ve hücresizleştirilmiş dana gözü kasından (HK) elde edilen ekstraselüler matris (ECM) tozu kullanılarak yeni bir hibrit doku iskelesi (greft) geliştirilmeye çalışılmıştır. Bu amaçla, PLGA membranları çözücü döküm yöntemi ile üretilmiş ve PCL nanofiberler bu membranlar üzerine elektroeğirme yöntemiyle toplanmıştır (PCL-PLGA). Ardından hücresizleştirilmiş ECM, liyofilizatörde kurutulmuş, toz haline getirilmiş ve jelleştirme yöntemi ile PCL-PLGA membranlar üzerine kaplanmıştır (ECM-PCL-PLGA). Taramalı elektron mikroskopi (SEM), enerji yayılımlı X-ışını analizi (XRD), Fourier transform kızılötesi spektroskopisi (ATR-FTIR) ve mekanik dayanım testleri gibi çeşitli analiz yöntemleriyle membranların karakterizasyonu yapılmış ve üretim başarısı doğrulanmıştır. Geliştirilen doku iskelelerinin kas doku oluşturma potansiyelleri in vitro ve in vivo analizlerle değerlendirilmiştir. İn vitro deneylerde geliştirilen malzemelerin fare miyoblast hücrelerinin (C2C12) tutunup çoğalmasını desteklediği görülmüş, 3-[4,5-dimetiltiyazol-2-il]-difeniltetrazolyum bromür (MTT) analizinde tüm doku iskelelerinin hücre proliferasyonunu desteklediği belirlenmiştir. Taramalı elektron mikroskobu ile yapılan görüntülemelerde ise C2C12 hücrelerinin, fiber yapıdaki doku iskeleleri boyunca kas dokusuna benzer şekilde hizalı bir şekilde tutunduğu görülmüştür. Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) analizleri ile çalışma kapsamında kullanılan ECM içeriklerinin farklılaşmaya olan etkisinin ilk 7 günde gerçekleştiği, sonraki günlerde farklılaşmadan ziyade hücre proliferasyon mekanizmasının daha baskın olabileceği düşünülmüştür. Kobay D.H.L. AŞ. Yerel Etik Kurulu'ndan 17.01.2019 tarih ve 336 numaralı onay kararı alındıktan sonra in vivo hayvan deneyleri 30 adet tavşan kullanılarak gerçekleştirilmiş ve tavşanların her iki gözünde vertikal rektus kaslarında insersiyodan itibaren 5 mm'lik tam kat defektler oluşturularak defektlere greftler sütüre edilmiştir. Erken dönem rejenerasyonu takip etmek için 15. gün sonunda, geç dönem için de 45.gün sonunda tavşanlardan kas dokuları alınmış ve elektrofizyoloji testleri ve histolojik analizlerle geliştirilen iskelelerin kas doku oluşturma potansiyelleri incelenmiştir. Cerrahi işlem sırasında hiçbir grupta enfeksiyon gözlenmemiş ve özellikle HK greftlerin sütürasyonunun diğer tüm greftlere göre çok daha kolay olduğu görülmüştür. Erken dönemde HK greftlerinde bazı olgularda ödem ve greftte şişlik belirginken, histopatolojik incelemede bu kaslarda yoğun inflamatuar reaksiyon, damarlarda dolgunluk ve vaskülarizasyonda artış görülmüştür. Geç dönemde tavşanların üst rektus kasları insersiyodan ayrılarak elektriksel uyarıya kasılma cevapları değerlendirildiğinde en iyi tek sarsı cevapları pozitif kontrol grubunda alınırken, HK, PCL-PLGA ve ECM-PCL-PLGA grupları benzer cevaplar sergilemiş ve PLGA grubunun cevabı düşük olarak bulunmuştur. Geç dönem histopatolojik incelemelerde ise kas dokusu gelişmesi HK, PCL-PLGA ve ECM-PCL-PLGA gruplarında benzer olup iyileşen kas fiberlerinin kornea uzaklığı en iyi pozitif kontrol grubunda bulunmuş ve PLGA grubunda ise en uzakta iyileşme tespit edilmiştir. Geç dönemde kas dokunun gelişmesi ve farklılaşması negatif kontrol grubunda diğer grupların gerisinde kalmıştır. Doku ve kas fiberlerinin organizasyonu geç dönemde HK greftlerinde daha iyi izlenmiştir. Sonuç olarak, hücresizleştirilmiş dana göz kası ve sentetik hibrit doku iskelelerinin kas doku rejenerasyonunu destekleyen biyomalzemeler olduğu görülmüştür. Doğal bir malzeme olan HK'nin hem cerrahi işlemlerde kolaylıklar sağladığı hem de geç dönemde düzenli fiberlerin gelişmesini hızlandırarak otogrefte alternatif olarak kullanılabileceği gösterilmiştir.
İlaç araştırmaları için 3-boyutlu mikroakışkan damar modelinin geliştirilmesi
Vasküler hastalıkların araştırılması, yeni ilaç adayı moleküllerin taranması, tespiti ve vasküler toksisitelerinin araştırılmasında kullanılabilecek in vivo damar fizyolojisi, anatomisi ve kan akışı kaynaklı oluşan sıvı gerilim kuvvetinin taklit edilebildiği 3-boyutlu (3B) damar modeline ihtiyaç duyulmaktadır. Son yıllarda insan doku ve/veya organların fizyolojik tepkilerini taklit etmek amacıyla modellenen mikroakışkan organ çipleri 3B doku/organların in vitro modellemesinde ilgi odağı olmuştur. Bu tez çalışmasında fizyolojik koşulları ve in vivo damar yapısını (tunika eksterna, tunika media ve tunika intima tabakaları) taklit eden perfüze edilebilir 3B damar çip modelinin geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla 3B yazıcı ile 35 mm çapında PDMS tabanına Pluronic F-127 kopolimeri ile 1,8 mm çap, 20 mm uzunluk ve 1,1 cm2 lateral alana sahip kanal oluşturulmuştur. Kanal önce dopamin hidroklorid (poliDOPA, 2 mg/mL), sonra kollajen veya fibronektin ile kaplanmıştır. Daha sonra sığır aort damarından izole edilip karakterize edilen vasküler düz kas hücreleri (vSMC), vasküler endotel hücreleri (vEC) ile insan (hFB) veya fare (L-929) kaynaklı fibroblast hücreleri PDMS kanallar içinde statik veya dinamik koşullarda (60 μL/dak.) koşullarda kültür edilmiştir. 3B damar yapısını oluşturmak için kültür süresi, substrat, hücre sayısı (50.000 hücre/çip veya 25.000 hücre/çip) test edilerek hücre davranışları araştırılmıştır. Daha sonra farklı i CellTracker® ile işaretlenmiş fibroblast hücreleri ve vSMC dinamik koşullarda PDMS kanalda ko-kültür edilerek perfüze edilmiş ve hücre varlığı, hücre lokalizasyon paterni ve hücre tabakalarının oluşumu incelenmiştir. Son olarak poliDOPA veya poliDOPA+kollajen ile kaplı PDMS kanallarda sırasıyla hFB, vSMC ve vEC (1:1:1) hücreleri kültüre edilerek üçlü direkt ko-kültür yapılarak dinamik koşullarda 3B damar modeli geliştirilmiş ve hücre tabakası ile endotel ve düz kas hücre spesifik proteinlerinin ifadesi açısından karakterize edilmiştir. Temas açısı ve FTIR sonuçları PDMS yüzeyin polidopamin ile kaplandığını ve hidrofilik bir yüzeyin elde edilebildiğini göstermiştir. Mikroskobik analiz, statik koşullarda test edilen farklı hücre sayısı, substrat tipi ve kültür süresinde vSMC'lerin benzer davranışlar göstererek yüzeye tutunabildiklerini, dinamik koşullarda ise test edilen tüm substrat ve hücre sayısında yüksek hücre canlılığına sahip mikro doku oluşturduklarını göstermiştir. Dinamik koşullarda, vEC ve fibroblast hücrelerinin statik koşullarda oluşturdukları hücre tabakası yapısını korudukları, sıvı gerilim kuvvetine maruz kalma süresine bağlı olarak vEC'lerin tabaka yapısını kaybetme, fibroblast hücrelerinin ise daha yoğun bir tabaka oluşturma eğilimi gösterdikleri tespit edilmiştir. vSMC-fibroblast ko-kültür çalışmaları fibroblast-vSMC direkt ko-kültürünün başarılı bir biçimde gerçekleştirildiğini, hücrelerin kültürde varlıklarını koruduklarını göstermektedir. Konfokal ve immünofloresan analizleri poliDOPA+kollajen ile kaplanmış PDMS kanallarda dinamik koşullarda üçlü ko-kültürün başarılı bir biçimde yapılarak fibroblast, düz kas ve endotel tabakalarını içeren 3B damar modelinin oluştuğunu göstermiştir.
Akciğer havayolu modellemesine yönelik oluşturulan deselülerize doku iskeleleri ile 3B hücre kültür sistemlerinin kurulması
Akciğerler, hücreler için gerekli oksijeni sağlamak ve metabolik olaylar sonucu oluşan karbondioksiti dışarı taşıma görevine sahiptir. Soluk alıp-verme olarak isimlendirdiğimiz bu süreç boyunca akciğerler, proteaz özelliğe sahip alerjen, virüs, bakteri, hava kirliliğine neden olan partiküller, sigara dumanı ve toksik kimyasallar gibi birçok zararlı madde ile karşılaşır. Havayoluna giren bu zararlı maddeler epitel hücre bütünlüğünü sağlayan sıkı bağlantı molekülleri üzerinde yıkıcı etki göstererek yapısal bütünlüğünün bozulmasına yol açar ve epitel bariyer hasarına neden olur. Çevresel etkenler ve genetik yatkınlıklar, astım, KOAH gibi kronik havayolu hastalıklarının ortaya çıkmasına neden olmakta ve hastalık şiddetinin artması veya azalmasında rol almaktadır. Kronik havayolu hastalıkları nedeniyle her yıl binlerce kişi hayatını kaybetmektedir. Bu hastalık mekanizmalarının anlaşılması ve tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi için çeşitli deneysel modellere ihtiyaç duyulmaktadır. Son yıllarda hızla gelişen rejenaratif tıp ve doku mühendisliği uygulamaları hastalık mekanizmalarının anlaşılması ve geliştirilmesinde önemli bir yere sahip olmuştur. Doku mühendisliği uygulamalarından biri olan doku ve organ deselülerizasyon (hücresizleştirme) yöntemi uzun zamandır hem deney hayvanlarında pre-klinik çalışmalar hem de klinik uygulamalarda başarılı şekilde kullanılmaktadır. Dokunun sahip olduğu doğal ekstraselüler matriks bileşeninin korunarak, olası immün yanıt hücrelerin uzaklaştırılmasıyla elde edilen deselülerize iskeleler, hücre kültür sistemlerinin geliştirilmesi için in vitro ortamlarda kullanılabildiği gibi donör organ yetersizliğini karşılamak amacıyla in vivo çalışmalarda kullanılabilecek olması bakımından oldukça önemlidir. Akciğer transplantasyonu için her zaman sağlıklı donör akciğerleri kullanıldığından; doku mühendisliği çalışmaları için üzerinde çeşitli hücre popülasyonlarının tutunup büyüyebileceği alternatif akciğer kaynaklarına ihtiyaç vardır. Bu tez çalışması kapsamında, insan akciğerine ksenojenik bir alternatif olarak hali hazırda bulunan koyun akciğeri önerilmiştir. Çalışmada koyun akciğer dokusu üzerinde fiziksel ve kimyasal deselülerizasyon yöntemleri uygulanarak doku iskelesi üretimi gerçekleştirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmanın ilk aşamasında karıştırma/çalkalama tekniğiyle SDS, Triton X-100 ve CHAPS gibi akciğer deselülerizasyonunda yaygın olarak kullanılan deterjanların yanında Sodyum kolat hidrat, NP-40 ve ASB-14 gibi akciğer deselülerizasyonunda kullanılmamış olan deterjanlarla akciğer dokusu için optimum bir hücresizleştirme metodu oluşturulması amaçlanmıştır. Fiziksel deselülerizasyon yöntemi olarak sCO2 kullanılmıştır. Fiziksel ve kimyasal yöntemlerle elde edilen sonuçlar karşılaştırılarak her iki metodun koyun akciğeri üzerindeki etkisi ortaya konulmuştur. Çalışmanın ikinci aşamasında ise elde edilen hücresizleştirilmiş akciğer doku iskelelerinin karakterizasyonu ve hidrojel sentezi gerçekleştirilmiştir. Karakterizasyon için öncelikli olarak deselülerize edilmiş ekstraselüler matriksin içerdiği DNA'nın doğal dokuya oranla yapıdan ne kadar uzaklaştırıldığı nicel olarak tayin edilmiştir. Ardından histolojik boyama yöntemiyle dokular nitel olarak değerlendirilmiştir. Doku iskelelerinde kalan kolajen, glukozaminoglikan (GAG) ve elastin oranlarına bakılarak nicel analizlerle etkinlikleri araştırılmıştır. Elde edilen iskelelerin yüzey karakterizasyonu için SEM görüntüleme analizleri yapılmıştır. Bu analiz sonucunda etkili olan koşula ait dokulardan hidrojel sentezi ve karakterizasyonu yapılarak, hücre kültür çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Karakterizasyon işlemi sonucunda akciğer deselülerizasyonu üzerinde etkili olan ASB-14, sodyum kolat hidrat ve SDS deterjanlarıyla yapılan yöntemler seçilmiştir. Bu yöntemler içerisinde ASB-14 ile elde edilen deselülerize dokudan hidrojel sentezi gerçekleştirilerek üzerine BEAS-2B hücre ekimi yapılmış ve ALI kültür üzerinde hücre çoğalması ve farklılaşması değerlendirilmiştir.
Deselülerize miyokard-elastomer yamaların hazırlanması ve ın vıtro performanslarının incelenmesi
Kalp yetmezliği, miyokard enfarktüsü gibi çoğu kardiyovasküler hastalığın son aşamasıdır. Kemik ve deri gibi diğer dokuların aksine, kalp dokusu kendisini yenileme ve onarma yeteneğinden yoksundur. Bu da enfarktüs geçirmiş hastaların kalp kaslarında geri dönüşü olmayan hücre ölümlerine neden olmaktadır. Son yıllarda kardiyak doku mühendisliği, miyokard doku yamalarının oluşturulmasında umut verici bir terapötik tedavi yöntemi sunar. Miyokard doku mühendisliği kapsamında bu tür durumların rejeneratif çözümüne yönelik kök hücreler ve hücre tabakası teknolojileri, deselülerize edilmiş ve sentetik olarak hazırlanmış kardiyak yamalar yaygın olarak çalışılmaktadır. Kardiyak doku yamalarının hücrelendirilmesi (reselülerizasyonu) ve yenilenmesini sağlamak için mekanik dayanımı yüksek ve immünolojik etkisi bulunmayan doku iskelelerin oluşturulması bu tedavi yöntemi için oldukça önemli bir basamaktır. Deselülerizasyon yöntemi ile hazırlanan doku iskelelerinin immünojenik tepkiyi azaltması nedeniyle, bu yöntemle hazırlanan yamaların nakli ve implantasyonu oldukça umut vericidir. Bu tez çalışması kapsamında kalp kası rejenerasyonu için hibrit ve kompozit yapıda kardiyak yamalar hazırlanmış, karakterize edilmiş ve kardiyomiyositler ile statik ve dinamik hücre kültür performansları incelenmiştir. Çalışmanın ilk aşamasında sığır kalp dokularından disekte edilen miyokardiyal kesitler kimyasal yöntem ve süperkritik CO2 akışkan yöntemi ile iki farklı şekilde deselülerize edilmiştir. Yapılan deselülerizasyon çalışmaları histoloji boyamaları, biyokimyasal analizler, yapısal analizler, kimyasal analizler, termal analizler ve makro ve nano mekanik analizler ile karakterize edilmiştir. Kimyasal yöntemle deselülerizasyonu ile elde edilen miyokard doku iskeleleri süperkritik CO2 akışkan yöntemi ile elde edilen doku iskeleleriyle kıyaslanmış ve süperkritik CO2 akışkan yönteminin deselülerizasyon etkisinde üstünlüğü ortaya konulmuştur. Tez çalışmasının ikinci aşamasında deselülerize doku iskeleleri poli(gliserol-sebakat) (PGS) polimeri ile katkılanarak hibrit formdaki kardiyak yamalar elde edilmiştir. Elde edilen hibrit kardiyak yamalar kimyasal, termal, morfolojik, mikroskobik ve mekanik olarak analiz edilmiştir. PGS polimerinin deselülerize dokular içerisinde çapraz bağlanabildiği kimyasal, termal ve mikroskobik olarak kanıtlanmıştır. Ayrıca, deselülerizasyon ve liyofilizasyon sonrasında doğal miyokard dokusunun zayıflayan mekanik özellikleri, hibrit formların eldesi ile iyileştirilmiştir. Bir sonraki aşamada deselülerize doku iskeleleri poli(gliserol-sebakat) (PGS) polimeri ve karbon nanotüp geometrileriyle katkılanarak kompozit formdaki kardiyak yamalar elde edilmiştir. Elde edilen kompozit kardiyak yamaların kimyasal ve mekanik analizleri yapılmış, mikroskop ve tomografi görüntüleri alınmış ve iletkenlik ölçümleri gerçekleştirilmiştir. PGS polimerinin karbon nanotüp katkısıyla beraber deselülerize dokular içerisinde çapraz bağlanabildiği kimyasal ve mikroskobik olarak gösterilmiştir. Tomografi analizleri ile karbon nanotüplerin yapı içerisinde homojen bir şekilde dağıldığı gösterilmiştir. Mekanik özelliklerin iyileştirilmesine ek olarak kompozit kardiyak yamaların hibrit kardiyak yamalara kıyasla iletken özellikte olduğu bildirilmiştir. Son olarak elde edilen tüm kardiyak yamalar insan kardiyomiyosit hücreleri ile tekrar hücrelendirilmiş; statik ve dinamik olarak in vitro kültürleri gerçekleştirilmiştir. Elde edilen kardiyak yamaların sitotoksisite analizleri yapılmış, kardiyomiyosit hücrelerinin kardiyak yamalarla etkileşimi sonrasında hücre metabolik aktiviteleri, hücre canlılıkları, hücre davranışları, GAG sekresyonları ve gen ekspresyonları incelenmiştir. Statik olarak incelenen kültür sonuçları, mekanik stimülasyona maruz bırakılan iskelelerin kültür sonuçları ile kıyaslanmıştır. Dinamik kültür koşullarının, statik koşullara göre hücre davranışları üzerindeki olumlu etkileri bildirilmiştir.
Centella asıatıca bitki özütü ile kaplı gümüş nanopartikül içeren polimer liflerin yara iyileştirici etkisinin ın vıtro ve ın vıvo araştırılması
Bu çalışmada, Centella asiatica'nın (CA) terapötik bitki ekstraktını kullanarak gümüş iyonlarından fonksiyonel gümüş nanopartikülleri (AgNPs) sentezledik. CA fonksiyonel grupları ile kaplı AgNP'ler (CA-AgNPs) oluşumu, yaklaşık 420 nm dalga boyunda karakteristik yüzey plazmon rezonans (SPR) pikleri ile kanıtlanmıştır. CA-AgNP'lerin ortalama zeta boyutu ve zeta potansiyeli, sırasıyla 29,5 nm ve -24,5 mV olarak bulunmuştur. Elde edilen nanopartiküllerin negatif yüzey yüküne sahip olduğu belirlenmiş ve sonuçlar CA-AgNP'lerin kararlı olduğunu göstermiştir. CA-AgNP'lerin fonksiyonel grup analizi, fourier transform kızılötesi spektroskopisi (FTIR) ile araştırılmış ve gümüş iyonlarının AgNP'lere indirgenmesinde karboksilat ve hidroksil gruplarının rol oynadığı belirlenmiştir. Ayrıca CA-AgNP'lerin, geçirimli elektron mikroskobu (TEM) ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) incelemeleri ile nano boyutlu ve küresel olduğu gösterilmiştir. CA ekstraktı ve CA-AgNP'lerin termal özellikleri, termogravimetrik analiz (TGA) ve diferansiyel tarama kalorimetrisi (DSC) ile incelenmiş, CA-AgNP'lerin nano boyutlu metalik gümüş içerdiği literatürde ilk kez TGA yöntemi ile fiziksel olarak kanıtlanmıştır. Sentezlenen CA-AgNP'lerin hem gram pozitif Staphylococcus aureus hem de gram negatif Escherichia coli üzerinde antibakteriyel aktiviteye sahip olduğu gözlenmiştir. CA ve farklı derişimlerdeki CA-AgNPs örneklerinin L929 fibroblast üzerindeki sitotoksisite etkileri MTT testi ile araştırılmış, 1mM'ın üzerindeki derişimlerde CA-AgNP'lerin sitotoksik etkiye sahip olduğu belirlenmiştir. Elektroeğirme yöntemi ile hibrit nanofiber örtü eldesinde; öncesinde PCL ve PEO'in uygun çözücüler ile farklı derişimlerde çözeltileri hazırlanmıştır. PCL için kloroform/metanol (7/3,v/v) karışımı, PEO için ise saf su çözücü sistemi olarak kullanılmıştır. %3,5'luk PEO ve %12'lik PCL çözeltileri ile optimum elektroeğirme koşullarında boncuksuz, pürüzsüz, uzun ve düzgün fiberler elde edilmiş, PEO ve PCL'in ortalama fiber çapları sırasıyla 177±21 nm ve 412±93 nm olarak belirlenmiştir. pH 7,4'e ayarlanmış 1mM CA-AgNPs çözeltisinden % 1, %5 ve %10 (v/v) CA-AgNPs içeren PEO (%3,5) çözeltileri hazırlanmış ve optimum elektroeğirme parametrelerinde boncuksuz ve sürekli nanofiberler (90 nm-160 nm) sentezlenmiştir. Hazırlanan CA-AgNPs-PEO ve PCL çözeltilerinin optimum elektroeğirme parametrelerinde, karşılıklı olarak eğrilmesiyle elde edilen hibrit nanofiberler FE-SEM, SEM-EDS, FT-IR, XRD, XRF, TGA, DSC, BET yöntemleri ile karakterize edilmiştir. Ayrıca sentezlenen nanofiberlerin mekanik özellikleri, hava geçirgenliği, su tutma kapasitesi, su temas açısı, in vitro degredasyonu, in vitro Ag salımı davranışları araştırılmıştır. Yapılan antimikrobiyal çalışmalarla %5 ve %10 CA-AgNPs içeren PEO/PCL nanofiberlerin S. aureus, E. coli ve C. albicans türlerine karşı etkili olduğu görülmüştür. Nanofiberlerin MTT testi ile sitotoksik özellikleri araştırılmış ve bütün konsantrasyonlarda hücre canlılığının %70'in üzerinde olduğu belirlenmiştir. Yara örtüsü olarak tercih edilen %10 CA-AgNPs-PEO/PCL nanofiberlerin in vitro çalışmalarla hücre tutunması, apoptotik-nekrotik, hemolitik ve genotoksik etkileri araştırılmıştır. %10 CA-AgNPs-PEO/PCL nanofiber örtünün in vivo deneylerle deri irritasyon, deri sensitizasyon ve yanık yarasını iyileştirme etkilerinin değerlendirildiği çalışmalarda; deri irritasyonu için sağlıklı genç yetişkin albino tavşanlar, deri sensitizasyon için sağlıklı genç yetişkin albino kobaylar (Guinea pig) ve yanık yarası için Sprague-Dawley cinsi sıçanlar kullanılmıştır. Ayrıca, sıçanların yara bölgelerinden alınan doku örnekleri üzerinde histolojik değerlendirmeler yapılmış, böylece nanofiber yara örtüsünün uygulandığı yüzeyin epitelizasyon üzerindeki etkisi de incelenmiştir.
Farklı hücre tiplerinin fotobiyomodülasyon ve askorbik asit varlığında hücre tabakası oluşturma potansiyellerinin incelenmesi
Bu çalışma "Farklı hücre tiplerinin fotobiyomodülasyon ve askorbik asit varlığında hücre tabakası oluşturma potansiyellerinin incelenmesi" başlıklı Lisansüstü Tez Projesi (FYL- 2020-18707) kapsamında Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından desteklenmiştir. Gerçekleştirilen tez çalışması kapsamında farklı morfolojik yapılara sahip hücrelerle polikromatik ışık kaynağı (600-1200 nm dalga boyunda) ve askorbik asit (vitamin C, VC) varlığında hücre tabakası elde edilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla üç tür hücre seçilmiştir. Bu hücreler; insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücreleri (GK-MKH), insan dermal fibroblast hücreleri (BJ) ve insan keratinosit epitel hücreleri (HS2) dir. Çalışmanın ilk kısmında GK-MKH'lerin karakterizasyon çalışmaları tamamlanmış ve bu hücrelerden hücre tabakası elde edebilmek için kültür ortamına 20 µg/mL VC eklemesi yapılmıştır. Daha sonra bu hücreler için uygun olan fotobiyomodülasyon (PBMT) parametreleri belirlenerek (20 cm mesafe, 2 dk ve gün aşırı uygulama) hücre tabakaları üretilmiştir. Sonuçta VC grubunda 5-7. günler arası, PBMT ve PBMT+VC gruplarında 6-7. günler arasında hücre tabakaları elde edilmiştir. Daha sonra elde edilen bu hücre tabakalarına ait karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Karakterizasyon çalışmalarında hücre tabakalarının hücre dışı matriks (ECM) yapısı, hücre morfolojisi, çekirdek yapısı ve farklı gen ifade düzeyleri incelenmiştir. Bu kapsamda yapılan immünofloresan ve Hematoksilen- Eozin (H&E) boyama sonuçları en yoğun çekirdek yapısının PBMT+VC grubuna ait olduğunu göstermektedir. Makroskobik ve mikroskobik gözlemler de en kalın ve opak hücre tabaka yapısının, PBMT+VC grubuna ait olduğunu göstermiştir. Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) analiz sonuçlarına göre VC ve PBMT varlığı ECM yapısını arttırmış, kök hücre gen ifadelerini anlamlı düzeyde etkilememiş, fakat PBMT osteojenik gen ifade düzeylerini (OCN, RUNX2) arttırmıştır. BJ fibroblast ve HS2 hücre hattı için de karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. BJ fibroblast hücre hattı ile hücre tabakası elde edebilmek için kültür ortamına 60 µg/mL vitamin C eklemesi yapılmış ve bu hücreler için uygun olan PBMT parametreleri belirlenerek (20 cm mesafe, 5 dk ve gün aşırı uygulama) hücre tabakaları üretilmiştir. Bu hücre hattı için PBMT grubunda hücre tabakası elde edilemezken, VC ve PBMT+VC grubunda 6-7. günlerde elde edilen hücre tabakaları arasında özellikler açısından anlamlı farklılıklar gözlemlenmemiştir. HS2 hücre hattı ile hücre tabakası elde edebilmek için kültür ortamına 20 µg/mL vitamin C eklemesi yapılmış ve bu hücreler için uygun olan PBMT parametreleri belirlenerek (20 cm mesafe, 5 dk ve gün aşırı uygulama) hücre tabakaları üretilmiştir. Bu hücre hattı için VC grubunda 8.gün ve PBMT+VC grubunda 8-9.gün günlerde hücre tabakası elde edilmiştir. Elde edilen hücre tabakaları arasında makroskobik ve mikroskobik incelemeler sonucu anlamlı farklılar gözlemlenmemiştir. Sonuç olarak çalışılan 3 farklı hücre tipinde de vitamin C varlığında etkin bir şekilde hücre tabakaları elde edilebilmiştir. Polikromatik ışıkla yapılan fotobiyomodülasyon uygulamasının çalışılan koşullarda hücre proliferasyonunu arttırıcı etkiye sahip olduğu, GK-MKH'ler ile HS2 hücrelerinde ise tek başına tabaka oluşumunu sağlayabildiği, ayrıca GK-MKH'lerde osteojenik farklılaşmada etkili olduğu görülmüştür. Elde edilen veriler klinik uygulamalar için umut vaat etmektedir.
Gıda örneklerindeki benzil penisilin hassas tayinine yönelik moleküler baskılanmış polimer temelli optik sensörlerin geliştirilmesi
Penisilin en sık kullanılan beta antibiyotiklerden olup, insan, çiftlik hayvanları, kümes hayvanları ve su ürünleri yetiştiriciliğinde çeşitli bakteriyel enfeksiyonların tedavisinde uzun süredir yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yüzden, gıda ve çevredeki bu antibiyotik kalıntılarının tespiti halk sağlığının korunması açısından hayati önem taşımaktadır. Bu çalışmada, yüzey plazmon rezonans sensör ile moleküler baskılama tekniği kullanılarak hem sulu çözelti hem de süt örneklerinden seçici ve hassas benzilpenisilin (PEN-G) antibiyotiğinin tayini gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, PEN-G baskılanmış, poli(2-Hidroksietil metakrilat- N-metakroil-(L)-sistein metil ester-altın nanopartiküller-N-metakroil-(L)-fenilalanin metil ester (MIP-AuNPs) nanosensör hazırlanmıştır. Yüzey plazmon rezonans sinyal yanıtını arttırmak amacıyla eklenen altın nanopartiküllerin (AuNPs) etkisini incelemek için eklenmeden hazırlanan nanosensör AuNPs (MIP) ile kontrol deneyleri gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, baskılama verimliliğini incelemek amacı ile, PEN-G baskılanmamış (NIP-AuNPs) nanosensör, PEN-G molekülünün eklenmesi dışında aynı polimerizasyon reçetesi kullanılarak hazırlanmıştır. MIP-AuNPs nanosensörü için baskılamanın verimliliği (I.F 7.83), NIP- AuNPs nanosensörü ile karşılaştırılarak tespit edilmiştir. MIP-AuNPs nanosensörün, hedef PEN-G molekülü için amoksisiline göre 9.87 kat ve ampisiline göre 16.78 kat daha seçici olduğu belirlenmiştir. MIP-AuNPs nanosensör, 0.01-5 ppb PEN-G konsantrasyon aralığı için, 0.9992 korrelasyon katsayısı ile doğrusal ilişki gösterdi. MIP-AuNPs nanosensörün tekrarlanabilirlik çalışmaları, 0.25 ppb PEN-G için istatistiksel olarak analiz edilmiş ve hesaplanan yüzde nispi standart sapma değeri (RSD%<1.7), aynı sensörün dört adsorpsiyon-desorpsiyon döngüsünden sonra PEN- G algılama yeteneğinde kayda değer bir kayıp olmadığını göstermiştir. Ayrıca gerçek gıda numunesi olarak, sütün içine 5 ppb PEN-G eklenerek sütteki PEN-G miktarı tespit edilmiştir. Validasyon çalışmaları yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) çalışmaları ile gerçekleştirilmiştir. Anahtar kavramlar: altın nanopartiküller, moleküler baskılanmış polimer, nanosensör, benzilpenisilin, yüzey plazmon rezonans.
Karaciğer tümörlerinin tedavisinde uygulanacak Y-90 mikrokürelerin aktivite miktarlarının hastaya özgü modelleme ile belirlenmesi için yöntem geliştirilmesi ve yöntemin standardize edilmesi
Yttrium-90 (Y-90) mikroküre tedavisi; hepatik arterin tümörü besleyen ilgili dalından Y-90 yüklenmiş mikrokürelerin, tümör mikro dolaşımına verilmesi ile yapılan internal radyonüklid tedavidir. Bu tedavinin temel prensibi; karaciğerde tümör hücrelerin ağırlıklı olarak hepatik arterden, sağlıklı hücrelerin ise portal venöz sistemden beslenmesine dayanır. Y-90 mikroküreler selektif olarak tümör hücrelerine yönlendirildiğinden; tümör hücreleri yüksek doz radyasyona maruz kalırken, sağlıklı karaciğer dokusu ve karaciğer dışında kalan diğer bölgeler radyasyonun olası yan etkilerinden olabildiğince korunmaktadır. Malignite cinsi, tümör sayısı ve histopatolojik davranış özelliklerinden bağımsız olarak; primer ve metastatik karaciğer tümörlerinin tedavisinde uygulanan bu teknik, klinik uygulamada önemli bir yer kazanmıştır. Y-90 mikroküre tedavisinde; diğer iyonize radyasyon tedavi uygulamalarında olduğu gibi kür oranlarının ve lokal bölgesel kontrolün arttırılması, sağlıklı dokular üzerindeki toksik etkilerin ortadan kaldırılması amaçlanmalıdır. Ancak bu tedavinin önemli kısıtlarından biri şantlar aracılığıyla radyomikrokürelerin istenmeyen bölgelere kaçması ve tedavi alanına komşuluk dolayısıyla normal karaciğer dokusu ve akciğer üzerinde olumsuz etkilerin oluşabilmesidir. Tümör içi radyomikroküre dağılımının heterojenlik göstermesi ve soğurulan doz hesabı, tedavide uygulanabilir Y-90 mikroküre aktivite miktarının hala net olarak yapılamaması bu tedavinin bir diğer limitidir. Y-90 mikroküre tedavisinin yukarıda açıklanan limitlerini aşabilmek, tedavide radyasyona bağlı erken ve geç etkileri ortadan kaldırmak, hastaya özgü dozimetri çalışması ile o hastaya ait tedavi parametrelerini net olarak ortaya koymak, kişiselleştirilmiş tedavi yaklaşımı ile uygulanan tedaviden maksimum yarar sağlamak adına bu tez çalışmasından elde edilen verilerin rehber nitelik taşıması planlanmıştır. Bu çalışmada, 2012-2018 yılları arasında Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Nükleer Tıp Anabilim Dalı'nda Y-90 cam mikroküre tedavisi gerçekleşmiş 56 hasta için tek loblu, 17 hasta için iki loblu olmak üzere toplamda 90 adet tedavi, retrospektif olarak ilgili hastaya özgü yeniden planlandı. Planlamalarda, hastaya ait anatomik ve fonksiyonel kesit görüntüleri üzerinden voksel tabanlı dozimetrik yaklaşım sunan bir yazılım kullanıldı. Retrospektif olarak gerçekleştirilen her hastanın planı, hedeflenen efektif tümör dozu ve kritik organ dozları açısından değerlendirildi. Tedaviler öncesi klasik dozimetrik yaklaşımla hesaplanan Y-90 cam mikroküre aktivitelerinin; perfüze doku hacmi, perfüze doku tümör hacmi ve soğurulan dozlar ile ilişkisi araştırıldı. Bu çalışmada kullanılan yazılıma ait planlama basamakları, dozimetrik sonuçları etkileyecek parametreler açısından incelendi ve bu parametreler için bir standart tanımlandı. Retrospektif planlama sonuçlarına göre; mevcut koşullarda kullanılan ve tek başına lobar hacmin 120 Gy'lik doz soğurmasını referans alarak hesaplanan Y-90 cam mikroküre aktivite miktarlarının, bazı tedavilerde eksik kaldığı bazılarında ise kritik organ tolerans dozları göz önüne alındığında olması gerektiğinden fazla olduğu belirlenmiştir. Bu tez çalışması; ilgili hastanın anatomik varyasyonunu, farklı tümör boyutunu, lokalizasyonunu dikkate alan kişiselleştirilmiş dozimetrik yaklaşımın, iyonize radyasyonun yasal mevzuatlar çerçevesinde bilinçli kullanımı bakımından yaşamsal önem taşıdığını ortaya koymuştur. Bu tez çalışmasında kullanılan kişiye özgü modellemeye dayanan dozimetrik yaklaşım ile, Y-90 mikroküre tedavisinde karaciğerdeki tümör odaklarında daha yüksek tedavi etkinliği oluşturacak yüksek dozlara erişilmesi ve aynı zamanda normal dokunun soğuracağı dozu minimumda tutmak için gereken aktivite miktarının hassas biçimde hesaplanması mümkün olmuştur. Çalışma sonuçlarının bu alanda gelecekte kurgulanacak klinik çalışmalara ışık tutacağı ve tedavi optimizasyonuna önemli katkı sağlayacağı düşünülmektedir.
Poli(poliol)sebakat bazlı biyobozunur elastomerlerin sentezi ve jiro eğrilmiş fiber destekli hidrojel doku iskelelerinin geliştirilmesi
Poli(poliol) sebakat (PPS) bazlı polimerler değiştirilebilir mekanik özellikleri, biyobozunur ve biyouyumlu olmaları nedeniyle biyomedikal ve doku mühendisliği uygulamalarında umut vaat eden polimerlerdir. Ancak sentez koşullarının zorluğu, sentez süresinin uzun olması ve üretim koşullarındaki zorluklar PPS elastomerlerin yaygın kullanımını kısıtlamaktadır. Bu tez çalışmasında PPS bazlı polimerlerin sentezindeki zorlukların mikrodalga polimerizasyonu ile aşılması, PPS elastomerlerine poli(etilen glikol) (PEG) katılarak fiber üretim koşullarının iyileştirilmesi ve doku iskelesi olarak kullanımı hedeflenmiştir. Bu amaçla tez çalışmasının ilk bölümünde poli(gliserol) sebakat (PGS), poli(ksilitol) sebakat (PXS), poli(gliserol)sebakat-ko-poli(etilen glikol) (PGS-ko-PEG) ve poli(ksilitol)sebakat-ko-poli(etilen glikol) (PXS-ko-PEG) polimerleri mikrodalga polimerizasyonu ile yaklaşık 4 dakikada sentezlenmiştir. Termal çapraz bağlanma reaksiyonları düşük basınç ve yüksek sıcaklıkta gerçekleşmiştir. Ksilitol içeren PXS ve PXS-ko-PEG polimerlerinde serbest hidroksil gruplarına bağlı olarak çapraz bağlanma süresinin uzadığı tespit edilmiştir. PEG'in poli(poliol) sebakat polimerlerine katılması ile elastik modülüs değerleri 1.20±0.01 MPa'dan, 0.060±0.004 MPa'a azalırken, kopma noktasındaki % uzamanın ~%99'dan ~%160'a arttığı görülmüştür. Polimerlerin termal özellikleri incelendiğinde camsı geçiş sıcaklıklarının -28.53 ve -35.48 ºC aralığında olduğu ve vücut sıcaklığında elastik davranış sergilediği görülmüştür. Aynı zamanda % kütle kaybının 21 günde % 4.4'den 9.3'e arttığı gözlenmiştir. PEG'in polimer yapısında su tutma kapasitesini arttırarak hidrolitik bozunma hızını artırdığı sonucuna varılmıştır. Sentezlenen polimerlerin L929 fibroblast hücrelerinde toksik etki göstermediği tespit edilmiştir. Tezin ikinci bölümünde sentezlenen PPS polimerlerinden elektrohidrodinamik (EHD) taşınabilir tabanca ve basınçlı jirasyon teknikleri kullanılarak fiber üretimi gerçekleştirilmiştir. EHD sistemi ile jirasyon tekniğine göre daha düşük çaplı (~ 1 μm) fiberler elde edilirken, polimer çözeltisinin iletkenliği ve yüzey gerilimine bağlı olarak uygulanan elektrik alan artış göstermiştir. Yapıya PEG'in katılması ile PXS-ko-PEG ve PGS-ko-PEG polimer çözeltilerinin iletkenlik değerlerinde yaklaşık 3.5 kat artış gözlenmiştir. İletkenlik değerlerindeki bu artış, şırınga jet oluşumundaki mesafeyi kısaltırken, toplayıcıdaki fiber alanın artmasına neden olmuştur. EHD ile üretilen PPS fiberlerin hücre tutunması ve proliferayonunu desteklediği belirlenmiştir. Özellikle PXS-ko-PEG fiberlerin 7 gün sonra hücre canlılığı diğerlerine göre anlamlı derecede artış göstermiştir. Basınçlı jirasyon tekniği ile üretilen fiber çapları (~ 10 μm) EHD sistemi ile üretilen fiberlere kıyasla artış göstermektedir. Jiro-eğrilmiş fiber üretiminde dönüş hızı, basınç, çözelti konsantrasyonu ve viskozitesinin fiber oluşumunu doğrudan etkilediği belirlenmiştir. Ayrıca jiro-eğrilmiş fiberlerin artan çaplarının, yığın yapıda oluşan poroziteyi arttırdığı ve hücrelerin üç boyutlu yapı içerisinde yayılarak çoğalmasına imkân vermiş olduğu belirlenmiştir. Üç-boyutlu jiro-eğrilmiş fiber yüzeyine fibroblast hücrelerin tutunduğu ve yayıldığı mikroskobik incelemelerle belirlenmiştir. Tezin son bölümünde jelatin metakrilat (Gel-M) hidrojeli sentezlenerek, farklı derişimlerde hazırlanan hidrojelin su tutma kapasitesi, degradasyon ve viskoelastik özellikleri belirlenmiştir. Elastomerik PPS fiber yapıları, sentezlenen jelatin metakrilat (Gel-M) jeline entegre edilerek, UV kürleme ile hibrid doku iskeleleri elde edilmiştir. Fiberlerle güçlendirilmiş hibrid doku iskelelerinin fibroblast ve keratinosit hücrelerin ko-kültürlerini desteklediği, hücre canlılıklarını ve proliferasyonunu artırdığı gözlenmiştir. Sonuç olarak geliştirilen hibrid doku iskelelerinin dermal doku mühendisliğinde kullanım potansiyellerinin yüksek olduğu sonucuna varılmıştır.
Adipoz kökenli mezenkimal kök hücrelerin polietilenglikol dimetakrilat hidrojellerde kahverengi ve beyaz adipoz dokuya farklılaşmalarının incelenmesi
Bu çalışma "Adipoz Kökenli Mezenkimal Kök Hücrelerin 3 Boyutlu Hidrojellerde Kahverengi ve Beyaz Adipoz Dokuya Farklılaşmalarının İncelenmesi" başlıklı Lisansüstü Tez Projesi (FYL-2018-17299) kapsamında Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Koordinasyon Birimi tarafından desteklenmiştir. Sunulan çalışmada amaç; beyaz adipoz doku kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (AKH), iki boyutlu (2B) ve üç boyutlu (3B) in vitro kültür koşullarında kahverengi yağ dokusuna farklılaşma potansiyellerinin incelenmesidir. Çalışma kapsamında ilk olarak polietilen glikol (PEG) polimeri mikrodalga enerjisi (1100 Watt, 5 dk) kullanılarak, metakrilik anhidrit (MA) ile fonksiyonelleştirilip %99.4 metakrilatlanma derecesine sahip polietilen glikol dimetakrilat (PEGDM) sentezlenmiştir. Sentezlenen ve karakterize edilen PEGDM foto çapraz-bağlayıcı ajan Irgacure2959 (%0.1, w/v) ile çözelti haline getirilip 150 sn UV ışığa maruz tutularak 3B hücre kültürleri için doku iskelesi olarak kullanılacak olan hidrojel yapıları elde edilmiştir. Tezin sonraki aşamasında ise sıçan kaynaklı AKH'leri 35 gün boyunca, 2B ve 3B in vitro hücre kültür koşullarında, roziglitazone ve triiyodotironin (T3) içeren kahverengi adipogenik farklılaştırma ortamında kültüre edilmiştir. İki boyutlu kültürlerde hücreler çok gözlü hücre kültür kaplarında üretilirken, 3B kültür çalışmalarında PEGDM hidrojellere enkapsüle edilmiştir. Ayrıca kronik soğuk maruziyetinin (2B kültürler için, gün aşırı, 16°C, 15 dk; 3B kültürler için, gün aşırı, 16°C, 1 sa) AKH'lerin in vitro adipogenik farklılaşmalarına olan etkisi de incelenmiştir. Her 2 kültür koşulunda da farklılaşan hücrelerdeki lipit vakuolleri Oil Red O ile boyanmış ve optik mikroskopla görüntülenmiştir. Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) analizleriyle kahverengi adipositlere özgü olan UCP-1, Cidea genleri ve tüm adiposit türlerinden eksprese olan PPAR-γ geninin ekspresyon seviyeleri tespit edilmiştir. Ayrıca immünositokimyasal ve immünohistokimyasal analizlerle farklılaşan hücrelerdeki UCP-1 ve PPAR-γ proteinlerinin varlıkları görüntülenmiştir. Ancak in vitro koşulda uygulanan soğuk indüksiyonunun AKH'lerin kahverengi adipositlere farklılaşmasında belirgin bir etkisinin olmadığı görülmüştür. Sonuç olarak AKH'ler, 2B ve 3B in vitro hücre kültür koşullarında kahverengi adipositlere farklılaştırılmıştır. Ayrıca AKH'lerin PEGDM hidrojellere enkapsüle edilmesiyle elde edilen 3B hücre kültürleri, in vitro koşullarda kahverengi adiposit elde edilmesi için uygun bir sistem olarak önerilmektedir.
Selection and validation of aptamers against osteosarcoma by cell-selex method
Osteosarcoma is known as the most common malignant mesenchymal stem cell development by endochondral ossification. Treatment resulting from an early diagnosis of such aggressive pediatric bone cancer can greatly increase the survival rate of the patient. For this purpose, aptamers comprise a cheaper and stable alternative product compared to antibodies. The ability of these short nucleotide sequences to be synthetically designed and used either for diagnostic or therapeutic purposes by targeting the relevant cell receptors has been attracting the interest of many researchers. Aptamers are single-chain DNA or RNA oligonucleotides that bind to a variety of targets, from small organic molecules to proteins. Single-chain oligonucleotide libraries can theoretically form three-dimensional structures that can be combined with various types of target molecules. Aptamers can be selected through SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) if the target is known or cell-SELEX if the target is unknown. Cell-SELEX enables aptamers selection using whole cells as a target. Advantages of aptamers include repeatable denaturation and renaturation, easy synthesis and preservation of chemical modifications of the targeted aptamers throughout the selection cycles. In this thesis, a 80-100 nt aptamer (ssDNA) library was designed to select by cell-SELEX, aptamers that specifically recognize the osteosarcoma cell line (MG-63) with high selectivity and sensitivity using osteoblast cells (control normal cells) for counter-selection. The work also include designing the vector system for proliferation of aptamers, sequence and homology analysis of the potential aptamers followed by flow cytometry and confocal microscopy. We have successfully generated an aptamer against MG-63 cells for the first time, after 10 cycles of enrichment using cell-SELEX. Out of 36 potential sequences, 14 sequences were full-length, and out of these, three aptamer sequences were analyzed by flow cytometry and one aptamer was selected for further analysis. This aptamer was found to be specific against MG-63 cells as compared to osteoblasts and other cancer cell lines, exhibiting a nanomolar range Kd value, namely 11.9±0.9 nM. Internalization of the aptamer was observed by confocal microscopy when MG-63 cells were incubated with the aptamer at 37C, but not at 4C. This dual characteristic of the selected aptamer highlights its potential to be used for treatment at 37C (in case it is found to interfere with any relevant receptor or cascade inhibiting cancer proliferation) and for diagnostics at 4C (if coupled for instance with a fluorescence molecule). Overall, the aptamer herein selected and characterized against osteosarcoma is a powerful and valuable tool for its detection and treatment, given the high selectivity and sensitivity of the aptamer.
Effectiveness of single and dual release of melatonin and BMP-2 in bone homeostasis
In the present thesis, it was aimed to develop single and dual release systems to achieve the prolonged delivery of melatonin (MEL) and bone morphogenetic protein two (BMP-2) and to investigate their synergistic effect on bone homeostasis. Two different release systems were constructed. The first construct which consisted of chitosan and hydroxyapatite composite scaffolds (chitosan/HAp) embedded with MEL-loaded and BMP-2-loaded microparticles, was used to compare the efficacy of single and dual release on osteoblast differentiation. Meanwhile, the second construct which consisted of MEL and BMP-2 embedded chitosan/HAp scaffolds was used to investigate whether the osteoclast activation mediated by BMP-2 high dose could be minimized by the inhibitory effect of melatonin. For osteoblastogenesis studies, MEL and BMP-2 were first encapsulated in poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles (MPs) by double emulsion solvent evaporation method using different formulations. After the characterization of MPs prepared by different formulations, MEL MPs and BMP-2 MPs which had diameters of approximately 2 µm and 11µm, respectively, were selected for cell culture studies. The in vitro cell culture studies were performed by seeding MC3T3-E1 cells into MEL MPs and/or BMP-2 MPs embedded chitosan/HAp scaffolds. Relative expression of alkaline phosphatase (ALP) and Runt Associated Transcription Factor 2 (RUNX2), mineralization detected by alizarin red and von Kossa stains were higher in scaffolds containing dual release system than that of single release ones. Additionally, according to haematoxylin and eosin staining and SEM analysis, number of cells were higher and morphology of cells was more similar to osteoblasts in dual release group than that of single release ones. Results suggest that the dual release of MEL and BMP-2 could enhance bone formation mediated by osteoblasts in more effective manner than when one of them was used. On the other hand, MEL and/or BMP-2 were directly embedded within chitosan/HAp scaffolds and their synergistic effect on osteoclastogenesis was investigated by seeding RAW 264.7 cells into embedded scaffolds. The higher number of tartrate resistant acid phosphatase positive (TRAP+) cells, the high expression of cathepsin K and nuclear factor of activated T cells one (NFATC1) genes, TRAP activity and the excessive formation of large osteoclasts in the fields of SEM images demonstrated that BMP-2-embedded scaffolds have enhanced osteoclast formation than that of MEL-embedded and dual release groups. However, relative expression of cathepsin K, NFATC1 and TRAP genes, TRAP activity, number TRAP+ cells and osteoclasts observed in TRAP staining and SEM, respectively, were lower in MEL and BMP-2 embedded scaffolds than that of BMP-2-embedded scaffolds. Results indicate that the inhibitory effect of melatonin on osteoclast formation has effectively minimized osteoclast formation caused by BMP-2 high dose. Taking all things into account, controlled release of MEL and BMP-2 from PLGA microparticles using relatively low doses has effectively enhanced bone formation by the activation of osteoblast formation. However, in some cases it would be more preferable when the engineered construct has both osteoblast-inductive and osteoclast-inhibitive properties and this is what has been demonstrated in the second system as melatonin has inhibited osteoclast formation induced by BMP-2 at the same time the used dose of BMP-2 could also induce osteoblast formation.
Tiyol-metakrilat polimerizasyonu ile affinite monolitlerinin sentezi ve histidin işaretli protein izolasyonunda kullanımı
Proteinlerin saflaştırılması için günümüzde birçok yöntem kullanılmaktadır. Saflaştırma işleminin mümkün olduğu kadar az kademede, yüksek verimlilikle ve kısa sürede gerçekleştirilmesi önemlidir. Bu yüzden izolasyon işlemi ile saflaştırılacak olan proteinin özellikleri (amino asit kalıntısı - histidin, triptofan veya sistein gibi) göz önünde bulundurularak en verimli ve etkili ayırma yöntemini seçmek gerekmektedir. Tez kapsamında immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) kullanılarak, histidin-işaretli proteinlerin seçici ve güvenilir bir şekilde ayrılması için histidin ve geçiş metali iyonları arasındaki metal koordinasyon etkileşimi kullanılmıştır. Histidin grupları iki değerlikli metal iyonu olan Ni2+ ile koordinasyon kompleksi oluşturmaktadır. İç çapı 300 μm olan kapiler kolonda hidrofilik ligand olarak MSA, ana monomer ve çapraz bağlayıcı olarak POSS-MA ve termal başlatıcı olarak AIBN kullanılarak tek basamakta tiyol-metakrilat polimerizasyonu ile monolitik dolgu materyali sentezlenmiştir. NiCl2 çözeltisi kolon içerisinden geçirilerek Ni2+ iyonlarının monolit yüzeyine immobilize olması sağlanmıştır. Ni2+ iyonu immobilize edilmiş MSA-(POSS-MA) kapiler monolitik kolon (IMAC sorbenti) histidin işaretli protein olan yeşil floresan proteinin (green fluorescent protein, GFP), E. coli bakteri lizatından seçici bir şekilde ayrımı için kullanılmıştır. SEM görüntüleri, monolit yüzeyinin kolon iç çeperine başarılı bir şekilde tutunduğunu ve gözenekli yapıda olduğunu göstermiştir. Mikro ve makro gözenek yapıcı ajanların (n-bütanol ve etilen glikol) kullanılması nedeniyle monolit dolgu materyali önemli bir yüzey alanına sahiptir. BET analizi sonucuna göre MSA-(POSS-MA) monolitinin yüzey alanı 143 m2/g, Ni2+-MSA-(POSS-MA) monolitinin yüzey alanı ise 116 m2/g olarak bulunmuştur. Sentezlenen Ni2+-MSA-(POSS-MA) kapiler monolitik kolonda 4 µL/dk akış hızında, 3.5 mg/mL başlangıç protein konsantrasyonunda farklı desorpsiyon koşullarında çalışılarak imidazol konsantrasyondaki değişimin protein izolasyonu üzerinde etkisi incelenmiştir. SDS-PAGE analiz sonuçlarına, göre uygun çalışma koşullarında monolitik kolona 25.55 µg GFP adsorplanmış ve 18.74 µg GFP desorplanmıştır. Monolitik sistemde aynı protein konsantrasyonuna (2.1 mg/mL) sahip lizat ile akış hızı taraması yapılarak akış hızının protein izolasyonuna etkisi incelenmiştir. Akış hızı 2 µL/dk iken adsorpsiyon verimi % 61.9, desorpsiyon verimi % 100 olarak tayin edilmiştir. Başlangıç protein konsantrasyonu değişiminin protein izolasyonuna etkisini belirleyebilmek için sentezlenen standart monolitik kapiler kolonlarda 0.4 µL/dk akış hızında, farklı protein konsantrasyonu içeren lizatlar ile çalışılmıştır. Başlangıç protein konsantrasyonu 1.2 mg/mL iken adsorpsiyon verimi %87.6, desorpsiyon verimi %100, izolasyon verimi ise %89.3'tür. Başlangıç protein konsantrasyonu 2.1 mg/mL iken adsorpsiyon verimi %77.6, desorpsiyon verimi %73.9, izolasyon verimi ise %57.3 olarak tayin edilmiştir. Ni2+ iyonunun protein izolasyonuna etkisini belirleyebilmek için Ni2+ içermeyen ve Ni2+ ve MSA içermeyen kolonlar sentezlenmiştir. Adsorpsiyon verimleri Ni2+ iyonu ve MSA içermeyen kolon için % 9, Ni2+ içermeyen kolon için %45.8 ve Ni2+-MSA-(POSS-MA) kolon için ise %77.6 olarak bulunmuştur. Ni2+ iyonu içermeyen kolonun desorpsiyon verimi %19.8, izolasyon verimi ise %9'dur. Ni2+-MSA-(POSS-MA) kolonun da desorpsiyon verimi %73.9, izolasyon verimi ise %57.3 olarak tayin edilmiştir.
Investigation of waste paper-derived carbon aerogel/elastomer system as a cardiac patch
Cardiovascular diseases (CVDs) are blamed for the major number of deaths around the world. Among of these is Myocardial Infarction (MI) which occurs when the flow of the blood through one of the coronary arteries is blocked, depriving the cardiomyocytes in the myocardial area under the occlusion from the nutrients and oxygen. If the perfusion does not be restored rapidly, the cardiomyocytes are exposed to chronic damages resulting in a significant cardiomyocyte loss within the myocardium. Since cardiomyocytes lack a self-replication mechanism, they cannot regenerate after such an injury. Therefore, the survivals from the acute MI end up with Heart Failure; where the left ventricle expands and the left ventricle wall becomes thinner. Ultimately, the heart becomes unable to pump a sufficient amount of blood to the different parts of the body, leading finally to the death of the patient. The current therapeutic strategies of heart failure following MI are confined to slowing the progression of the end-state condition. Myocardial Tissue Engineering (MTE) is a newly emerging field in which a combination of healthy cardiac cells and engineered cardiac patch is expected to be an excellent therapeutic strategy to regenerate the infarcted myocardium. However, finding the optimal culture substrate to be a successful cardiac patch is still an open question. Therefore, this study aimed at synthesizing novel conductive elastomer-based composite and evaluate its potential as a cardiac patch for myocardial tissue engineering. In particular, we describe, for the first time, the synthesis of an electrically conductive composite of Carbon Aerogel-embedded poly (glycerol sebacate) (CA-PGS) system. In this work, electrically conductive Carbon Aerogel, which is a waste-derived and cost-effective carbon source that its utilization in cardiac tissue engineering applications has not been explored to date, was combined to the biodegradable PGS matrix to obtain a cardiac construct with optimal properties. The resulting composite was characterized by Scanning Electron Microscopy (SEM), Fourier Transform Infrared (FTIR) Spectroscopy, X-ray Diffraction (XRD), and Contact Angle Measurements. Furthermore, the mechanical and electrical properties of the developed system as well as the cell-material interactions were also assessed to evaluate the potential of using this novel elastomeric composite as a cardiac patch for myocardial tissue engineering. The results showed that incorporating Carbon Aerogel Microbelts (CAMs) to the polymeric matrix notably enhanced the elastic modulus and the deformability of the developed constructs, making the resulting construct matching the native cardiac tissue in terms of mechanical properties. Moreover, the addition of CAMs made the developed construct electrically conductive with a conductivity value falling within the range of that reported for the human myocardium. In the cell-matrix interaction context, the results of MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide) assay demonstrated that CA-PGS composite showed no cytotoxic effects for the L929 mouse fibroblast cells in vitro. In addition, it was shown that H9C2 rat cardiac myoblast cells attached and proliferated on the composite, which gave further confirmation of composite biocompatibility and its suitability for MTE application. Taking together, it is concluded that our developed system is a promising candidate for myocardial tissue engineering for cardiac repair.
Kemik çimentolarında yumurta kabuğu zarı proteininin kullanımı
Sunulan tez çalışması kapsamında, protein katkılı kemik çimentolarının biyoçözünürlük ve mukavemet anlamında potansiyel vadettiği düşünülmektedir. Bu nedenle kalsiyum sülfat bazlı kemik çimentolarına (CSC) protein eklenmesiyle, çimentonun mekanik dayanımının değiştirilebilmesi ve CSC'lerde faz dönüşümlerinin sağlanabilmesi hedeflenmiştir. Her yıl milyonlarca ton atık olarak ortaya çıkan yumurta kabuğundan elde edilen yumurta kabuğu zarı (YKZ) yüksek oranda protein içeriğiyle CSC'lerle kullanılabilecek doğal bir biyomalzeme olarak seçilmiştir. Yumurta kabuklarından ayrılan YKZ'den % 62.57 verimle yumurta kabuğu zarı proteini (YKZP) elde edilmiş, kalsiyum sülfat (CaS) bazlı kemik çimentosu sentezlenerek kalsiyum sülfat dihidrat (CSD) ve kalsiyum sülfat hemihidrat (CSH) olmak üzere iki farklı CaS fazında toz elde edilmiş, elde edilen YKZP kullanılarak CSD ve CSH fazlarının mekanik dayanımına, morfolojisine ve yapısına katkısı incelenmiştir. Elde edilen YKZP, su ve CaCl2 sulu çözeltisi içerisine farklı katkı maddeleri eklenerek sertleşme çözeltileri hazırlanmış ve YKZP çözünürlük çalışmaları yapılmıştır. Hazırlanan sertleşme çözeltileri içerisinde en iyi çözünme sonuçlarına YKZP-Su, YKZP-Üre, YKZP-CaCl2(aq), filtrelenmiş YKZP-CaCl2(aq), YKZP- CaCl2(aq)-Üre ve filtrelenmiş YKZP-CaCl2(aq)-Üre karışımları ile ulaşılmıştır. CaS sentezi kısmında farklı fazlarda CaS tozu (PPTN1, PPTN2 ve PPTN3) üretilmiştir. Elde edilen PPTN1, PPTN2 ve PPTN3 tozlarının, yapılan analizleri ile sırasıyla CSH, CSD ve CSD fazları içerdiği belirlenmiştir. CSH fazı içeren PPTN1 tozuna CaCl2 sulu çözeltisinde YKZP eklenilmesi, yalnızca su veya su ve YKZP eklenilmesi durumundan % 45 fazla mekanik dayanım sağlamasına neden olduğu görülmüştür. CSH fazı içerdiği tespit edilen PPTN1 tozu su ile karıştırıldığında CSH fazında değişiklik olmazken su/YKZP ile karıştırıldığında yapısında az miktarda CSD fazının olduğu ve YKZP/CaCl2 sertleşme solüsyonu ile karıştırıldığında ise CSH faz yapısının tamamen CSD faz yapısına dönüştüğü görülmüştür. CSD fazı içeren PPTN3 tozuna YKZP eklenilmesi, su, su/YKZP/EtOH ve su/YKZP/Üre eklenilmesi durumundan yaklaşık % 240 fazla mekanik dayanım sağlanmasına neden olduğu görülmüştür. CSD fazı içeren PPTN3 tozu ile su, su/YKZP, su/YKZP/EtOH ve su/YKZP/üre ile karıştırıldığında CSD fazının değişmediği görülmüştür. CaCl2 sulu çözeltisinin CSD fazı içeren PPTN3 tozunun mekanik dayanımına etkisi olmadığı, CaCl2/YKZP ile karıştırıldığında CSD fazının mekanik dayanımını %300 fazla artırdığı görülmüştür. CSD fazı içeren PPTN3 tozu ile CaCl2 (aq), YKZP/CaCl2 ve YKZP/CaCl2/üre sertleşme solüsyonları karıştırıldığında CSD fazının değişmediği görülmüştür. Yapılan çalışmalarda CSH fazı ile başlayıp YKZP ve CaCl2 ile karıştırıldığında CSD fazına geçiş yapan çimentoların mekanik dayanımının arttığı, mekanik dayanımı düşük olan CSD fazının faz dönüşümüne uğramaksızın üzerine eklenen proteinin çözünürlüğü artırıldığında CaCl2 gibi +2 yüklü iyon değerliğindeki bir malzeme ile tepkimeye girdiğinde mekanik dayanımının arttığı ve oluşturulan CaS bazlı kemik çimento sisteminin kemik doku onarımında kemik çimentosu olarak kullanılmasının mümkün olduğu görülmektedir. Anahtar Kelimeler: kemik çimentosu, kalsiyum sülfat, yumurta kabuğu zarı proteini, protein çözünürlüğü, sertleşme solüsyonu, sertleşme reaksiyonu, sertleşme zamanı, enjekte edilebilirlik
Akciğer kanserinde kannabinoidlerin CB reseptörleri aracılı antiproliferatif ve proapoptotik etkisinin araştırılması
Akciğer kanseri, hızlı metastaz özelliği ve geç tanı alması nedeniyle dünyada en sık ölüme yol açan kanser olarak bilinmektedir. Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK), tüm akciğer kanseri vakalarının %80'ini oluşturmaktadır. Endokannabinoidler, vücutta sentezlenen ve genellikle klasik kannabinoid reseptörleri üzerinden etki gösteren lipid yapılı endojen esrar ligandlarıdır. Endokannabinoid sisteminin fizyolojik koşullarda akciğerde bulunduğu ve kanser patogenezinde bileşenlerinin artış göstererek CB1 reseptörleri aracılı rol oynayabileceği bildirilmiştir. Pankreas ve endometriyum kanserlerinde antiproliferatif etkisi bildirilen Araşidonilsiklopropilamid (ACPA), psikoaktif etki göstermeyen, kan-beyin bariyerini geçmeyen, lipid yapılı sentetik spesifik CB1 agonistidir. ACPA, CB1 reseptör agonizması aracılı olarak KHDAK'nde çoğalmayı azaltıcı ve apoptozu uyarıcı etki gösterebilir. ACPA'nın akciğer tümörüne hedefli ilaç adayı olarak kontrollü salımını sağlayabilecek biyouyumlu ve biyodegradasyon hızı düşük polikaprolakton yapılı nanopartiküler sistem kullanılabilir. Kurgulanan varsayımı test etmek üzere in vitro koşullarda, deney ve kontrol grubu içeren gözlemsel bir deney tasarlanmıştır. Tez çalışmasında ilk olarak in vitro koşullarda insan kökenli ticari, altı KHDAK hattında (A549, H1299, H358, H838, H1975 ve SW-1573) qRT-PCR, akım sitometrisi ve immünositokimya yöntemleriyle kannabinoid reseptörlerinin varlığı ve düzeyleri gösterilmiştir. Buna göre A549, H1299, H358 ve H838 hatlarında yüksek CB1 reseptör ekspresyonu saptanmıştır. İkinci aşamada kannabinoid 1 reseptörünü yüksek düzeyde eksprese eden A549, H1299, H358 ve H838 hücre hatlarında WST-1 ve gerçek zamanlı impedans temelli proliferasyon analizi yöntemleriyle ACPA'nın doz ve zaman bağımlı antiproliferatif etkisi ve akım sitometrisi tekniğiyle kantitatif olarak apoptozu arttırıcı etkisi ortaya konmuştur. ACPA'nın, WST-1 tekniğiyle incelenen hücre hatlarındaki antiproliferatif etkili doz aralığı 10-12 – 10-9 M olarak belirlenmiştir. Bu doz aralığına göre çalışılan gerçek zamanlı proliferasyon analizinde hücreler için etkili doz (IC50) 1.39x10-12 M olarak hesaplanmıştır. Üçüncü aşamada ACPA'nın stabilite çalışmalarında molekülün tek başına hücre kültür süpernatanlarında 1-3. günlerde stabil olmadığından hareketle ACPA yüklü polikaprolakton yapılı nanopartiküler sistem çöktürme yöntemiyle geliştirilmiş ve optimizasyonu sağlanmıştır. Ardından ACPA'nın nanopartiküller ile kontrollü ve uzun süreli salımı sağlanmıştır. Son aşamada ACPA yüklü polikaprolakton yapılı nanopartikül sistemi gerçek zamanlı impedans temelli proliferasyon analizinde KHDAK hatlarına uygulanmıştır. Sonuç olarak 1.39x10-12 M ACPA dozu salan polikaprolakton nanopartiküllerin genellikle antiproliferatif etkiyi sürdürdüğü sonucuna varılmıştır. Polikaprolakton nanopartiküler salım sistemiyle uzun süre etkili ve hedefli formülasyonu geliştirilen ACPA, CB1 agonizması aracılı olarak klinikte küratif tedavisi olmayan KHDAK için yeni bir ilaç adayı olabilir. Bu doğrultuda, tez çalışması kapsamında elde edilen çıktılar ile Hacettepe Teknokent Teknoloji Transfer Merkezi Patent Ofisi'ne buluş başvurusunda bulunulmuştur.
Mikroakışkan çiplerde biyomoleküllerin ve hücrelerin difüzyonunun incelenmesi
Mikroakışkan sistemler, analitik kimya, ilaç keşif ve geliştirme araştırmaları, tanı amaçlı kitler, taşınabilir hasta başı kitleri, enzimatik-kimyasal sentez, biyolojik moleküllerin tayini, çip-üstü-organ uygulamaları gibi tıp ve yaşam bilimleri çalışmalarının birçok alanında geniş bir kullanıma sahiptir. Mikroakışkan çipler çok düşük hacimlerde bile hızlı sonuç verebilme, yüksek verimlilik ve tekrarlanabilirliğe sahip sonuçlar elde edebilme gibi avantajlarından dolayı son zamanlarda oldukça ilgi görmektedir. Mikroakışkan teknolojilerin temel hedefi, biyoteknoloji, biyomedikal ve ilaç endüstrilerine yenilikçi ve düşük maliyetli mikroakışkan cihazlar sunabilmektir. Bu nedenle, mikroakışkan sistemlerde hücre ve biyomoleküllerin taşınım olaylarının anlaşılması oldukça önemli olmaktadır. Bu tez çalışmasında saponin glikozidlerinin biyokatalitik dönüşümlerini gerçekleştirebilen bir mikroakışkan çipte substrat moleküllerin difüzyon olayları incelenerek, matematiksel modellemesi yapılmıştır. Bunun için sisteme akış eşliğinde zamana bağlı olarak belirli konsantrasyondaki substrat solüsyonu beslenmiş ve çıkış akımları toplanmıştır. Zamana bağlı çıkış akımı madde konsantrasyonları analizlenmiş ve Fick yasası difüzyon modelinden yararlanılarak moleküllerin hidrodinamik yayılım katsayıları belirlenmiştir. Ardından sistem değişkenleri arasındaki ilişkiyi gösteren, sistem dinamiklerinin tanınması ve ölçek büyütme için model oluşturan matematiksel model denklikleri oluşturulmuştur. Mikroakışkan çiplerde biyomoleküllerin difüzyonuna yönelik çalışmanın yanısıra, in vivo koşulları simüle eden, perfüzyon özelliğine sahip, sferoid tabanlı üç boyutlu (3B) çip-üstü-akciğer platformu geliştirilmiş ve potansiyel ilaç molekülünün sferoid yapıları içinde oluşturulan akciğer karsinoma hücre hattı üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Bunun için potansiyel ilacın A549 akciğer karsinoma ve MRC-5 akciğer fibroblast hücre hatları üzerindeki sitotoksik aktivitesi belirlenmiş, ardından canlı doku arasında köprü niteliğinde olan in vivo 3B dinamik mikroakışkan hücre kültürü sistemlerinde uygulanan ilacın etkinliği araştırılmıştır. Mikroakışkan çiplerde 3B yapının oluşturulması için matrijel matriks tabanlı sferoid kültürü yapılmıştır. Sferoidlerin morfolojileri zamana bağlı olarak ışık mikroskobu ile gözlenmiş ve sferoid boyutu ve sayıları ImageJ analizi ile belirlenmiştir. Ayrıca sferoidlerin hücre canlılığı, deneme sonunda canlı ve ölü floresan boyama testi ile incelenmiştir. Bu çalışmada çip-üstü-akciğer platformunda geliştirilen 3B akciğer sferoid kültürü iyi organize edilmiş sferoid oluşumunun yanısıra, aynı zamanda kanser mikroçevresini taklit eden hücre-hücre etkileşim etkisinin niceliksel ve niteliksel olarak daha iyi anlaşılmasına da katkı sağlamıştır.
Dental implant destek malzemelerinde yüzey modifikasyonlarının in vitro değerlendirilmesi
Titanyum (Ti) ve alaşımları, yüksek mukavemet, yüksek biyouyumluluk, mükemmel korozyon direnci ve hafiflik özellikleriyle diş hekimliğinde giderek daha fazla kullanılmaktadır. Dental implantlarda vida başarısı ve osteointegrasyonun yanı sıra abutment seçimi ve peri-implantitisin önlenmesi de tedavinin genel başarısını etkileyen önemli faktörlerdendir. Bu çalışmada, diş implant tedavisinde genellikle gözden kaçan gingival doku adaptasyonu ve titanyum abutment yüzey modifikasyonlarına odaklanılmıştır. Titanyum alaşımlı diskler (Ti6Al4V) üzerinde asitle aşındırma ve mikroark oksidasyon ile yüzey modifikasyonu gerçekleştirilmiş ve yüzeyler antimikrobiyal özellik kazandırılması amacıyla çinko asetat (ZnC2H3O2) ile kaplanmıştır. Yüzey pürüzlülüğü profilometre ile belirlenmiş, çinko asetat kaplama X-ışını kristalografisi (XRD) ile incelenmiş, yüzey morfolojisi taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile ve yüzey ıslanabilirliği temas açısı ölçümü ile analiz edilmiştir. In vitro hücre kültür analizleri, insan gingival fibroblast (HGF) ve periodontal ligament fibroblast (PDLF) hücre hatları ile gerçekleştirilmiştir. Hücre canlılığı, 4, 7 ve 14. günlerde MTT canlılık analizi ve SEM görüntüleme ile analiz edilmiştir. İki farklı bakteriyel suş ile antimikrobiyal özelliklerin belirlenmesi için disk difüzyon testleri yapılmıştır. Elde edilen yüzeylerdeki en yüksek pürüzlülük mikro-ark oksidasyon işleminde başarılmıştır. Hücre kültürü çalışmalarında mikro ark ile işlem görmüş yüzeylerde hücre tutunmasının fazla olduğu, çinko asetat kaplı titanyum disklerde de antimikrobiyal etki görülmüştür. Anahtar sözcükler: Diş implantı, dental abutment, asit aşındırma, mikroark oksidasyon, biyouyumluluk.
Alternatif bir astaksantin üreticisi olarak Chlamydomonas nivalis'in üretim süreci ve astaksantin potansiyelinin incelenmesi
Endüstriyel alanda en çok üretimi yapılan karotenoit çeşitlerinden biri olan doğal astaksantinin birincil üreticisi konumundaki mikroalgler, içerdiği diğer pek çok metabolit sayesinde enerji, farmasötik, kozmesötik, nutrasötik, atık su arıtımı gibi alanlarda sıklıkla kullanılan mikroorganizmalardır. Bu tezde ılıman iklim kuşağında yaygın kullanılan türler dışında düşük sıcaklıkta yaşayabilen Chlamydomonas nivalis'in farklı stres koşullarında ve fotobiyoreaktörlerde kültivasyonu ile astaksantinin alternatif üreticisi olarak kullanılabilirliği araştırılmıştır. Aksenik olarak UTEX kültür koleksiyonundan alınan ekstremofilik yeşil mikroalg Chlamydomonas nivalis'in üretimindeki stres faktörlerinin belirlenmesi amacıyla kabarcık kolon fotobiyoreaktörlerde farklı sıcaklık, besin ortamı ve ışık şiddetleri kullanılarak hücre sayısı ve yoğunluğu, kuru ağırlık, pH, sıcaklık, fotosentetik aktivite, klorofil ve karotenoit miktarları takip edilmiş ve astaksantin içeriğinin belirlenmesi için HPLC analizi yapılmıştır. Petri ve laboratuvar tüplerinde küçük ölçekteki kültivasyonundan 5L'lik panel, tübüler ve karıştırmalı tank fotobiyoreaktörlerdeki üretimine kadar ölçek büyütmesi yapılarak üretimde fotobiyoreaktör çeşidinin etkisi araştırılmıştır. Chlamydomonas nivalis'in 28°C'ye kadar sıcaklığı tolere edebildiği ve kırmızı kistik form gözlenmese de HPLC sonuçlarına göre astaksantin üretimi en fazla BBM besin ortamı içeren kabarcık kolon fotobiyoreaktörde 0.137 mg/g olarak elde edilmiştir.
3B in vitro hücre kültürlerinde biyoempedans modeli
İki ve üç boyutlu (2B ve 3B) hücre kültürleri sırasında hücresel aktivitelerin karakterizasyonu doku mühendisliği uygulamalarında büyük önem taşımaktadır. Bu tez çalışmasında, hücre kültürlerinde, hücre büyümesini ve çoğalmasını izlemek amacıyla non-invaziv çoklu-elektrot tabanlı bir elektrik empedans ölçüm platformu geliştirildi. Biyoempedans ölçüm platformu, iki terminal (2T) ölçüm konfigürasyonunda kullanılan dört dikey gümüş kaplı elektrotlu dairesel bir kültür odasından yapıldı. Prostat kanser hücreleri (Du145), hücre kültür sistemlerinde (2B ve 3B) kültive edilerek hücre büyümesi ve çoğalması biyoempedans değişimlerini ölçme yoluyla incelendi. Gerçek zamanlı deneysel empedans ölçüm değerlerinin, hücre kültür süresi boyunca kolorimetrik hücre canlılık ölçümleri ile bağlantılı olarak arttığı görüldü. Bu teknik, kanser ilaç denemelerinde ve 3B biyobaskılı yapılarda hücre canlılığının çevrimiçi izlenmesi için kullanılabilir. Anahtar sözcükler: Biyoempedans, 2B ve 3B hücre kültürleri, hücre büyümesi ve çoğalması