Biber tohumlarından polifenol oksidaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu

Enzimler canlı organizmalar için yürüyen reaksiyonlarda düzenleyici görev aldıklarından, yüksek ve büyük bir seçicilikle katalizlediklerinden bazen istenmeyen durumlarda organizmaya negatif etki ederek bozukluklara sebep olmaktadırlar. Bu sebeplerin ortadan kaldırılması ancak o enzimleri karakterize ederek mekanizmalarını belirlemek ve onlara uygun inhibitörlerin belirlenmesi ile mümkün olmaktadır. Son yıllarda in vitro çalışmalarda enzimlerden yararlanma çalışmaları hızla artmaktadır. Günümüzde yapı ve mekanizması bilinen birçok enzim tıp, biyoteknoloji, gıda gibi birçok alanda kullanılmaktadır. Enzimatik esmerleşme tarım sektörünü, hem ürünlerin bozulması hem de ekonomik açıdan olumsuz yönde etkilemektedir. Bu yüzden bu esmerleşmeye sebep olan enzimler üzerinde yapılan çalışmalar bu alanda yarar sağlayacaktır. Bu çalışmanın amacı, PPO enziminin güneydoğu bölgesinde yetiştirilen yeşil top biber tohumunda saflaştırılması ve karakterize edilmesidir. Bu amaçla biber tohumundan izole edilen enzim daha sonra amonyum sülfat çöktürmesi, diyaliz, ultrafiltrasyon ve jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırılmıştır. Enzimin özellikleri, optimum pH ve sıcaklık, sıcaklık stabilitesi, inhibitör ve karbonhidratların etkisi belirlenmiştir. Elde edilen bulgulardan; denenen substratlardan enzim ilgisinin en yüksek olduğu substratın 4-metilkatekol olduğu, termal stabilitesinin yüksek olduğu, sodyum azidin % 64,4 EDTA'nın % 60,10, SDS'nin % 36,6 ve askorbik asidin ise % 65,7 oranında enzimi inhibe ettiği tespit edilmiştir. Ayrıca etkisi araştırılan karbonhidratlardan ribozun enzimi % 34 oranında aktif ettiği, glikozun ve sukrozun ise enzimi inhibe ettiği ortaya çıkmıştır. 4-metilkatekol subsratı kullanıldığında PFO enziminin optimum sıcaklık 40 OC, katekol kullanıldığında ise optimum sıcaklık 30 ºC olarak tespit edilmiş, optimum pH değerleri ise katekol ve 4-metilkatekol substratları kullanılarak sırasıyla 7 ve 5 olarak tespit edilmiştir. Ayrıca PFO'nın substrat spesifikliği ve sıcaklık stabilitesi incelenmiştir. PPO enziminin uygun değer pH ve sıcaklıkta katekol ve 4-metil katekol substratları için Km ve Vmax değerleri Linewear-Burk yöntemi ile bulunmuştur. Vmax/ Km değerlerine göre PPO enzimi için en uygun substratın 4-metilkatekol olduğu bulunmuştur. Ayrıca artan ısı inaktivasyon süresine paralel olarak PFO aktivitesinin bariz bir şekilde azaldığı gözlemlenmiştir.