Candida boidinii kaynaklı NaD+ bağımlı format dehidrogenaz enziminin üretilmesi, enzim aktivitesinin ve termal stabilitesinin artırılması

Farklı endüstrilerde geniş bir kullanım alanına sahip olan enzimler, hastalıkların tanısında kullanılan biyokimyasal analizler için de önemlidir. Format (formik asit) tek karbonlu endojen bir metabolit olup, insan serumunda ve idrarında belirli seviyelerde bulunur. Format düzeylerinin insan serumu ve idrarında özellikle metanol intoksikasyonu, vitamin B eksiklikleri, astım, çeşitli psikiyatrik bozukluklar ve farklı patolojik durumlara bağlı olarak arttığı gösterilmiştir. Format Dehidrojenaz (FDH), format için mutlak özgüllük gösteren ve ortamda bulunan formattan elektronları NAD+'ye transfer eden bir enzimdir. Reaksiyonun sonunda oluşan NADH + H miktarı, reaksiyona giren formatın miktarı ile doğru orantılıdır. Tez projesi ile amacımız, NAD+ bağımlı FDH enzimininin rekombinant DNA teknolojisi ile üretilmesi, enzim aktivitesinin ve termal stabilitesinin artırılmasıdır. Çalışmamızda, Candida boidinii (Cbo) FDH proteinini kodlayan 1095 baz çift geni, bir şablon olarak kullanılarak Polimez Zincir Reaksiyonu (PZR) ile çoğaltıldı. Ürün pET-23b (+) ifade vektörüne klonlandıktan sonra ekspresyon için Escherichia coli (E.coli) BL21 (DE3) hücrelerine transfer edildi. Üretilen CboFDH enziminin saflaştırılması için afinite His-Trap kolonu kullanıldı. Enzim aktivitesi ölçümleri 340 nm'de NADH miktarının fotometrik ölçümü ile gerçekleştirildi. Moleküller arası etkileşimler üzerinde yapılan mutasyonların etkisini tahmin etmek için, Gaussian 09 yazılımına mevcut kristal yapı (PDB: 5DN9) tanıtıldı ve mutasyon yapılacak bölgeler tahmin edildi. Daha sonra, enzim aktivitesini ve termal stabilitesini artırmaya yönelik olarak Val120Thr, Phe285Thr, Gln287Glu, His311Gln ve Phe285Thr/His311Gln mutasyonları gerçekleştirildi. Mutasyonla aminoasitleri değiştirilmiş enzimin yapısı geometrik optimizasyon ile kendi ortamında gerçek forma en yakın şekilde modellendi. Sonuçlar Pymol paket yazılımı ile görselleştirilerek tartışıldı. Hem yabanıl tip hem de mutant FDH'ler için kinetik ve termostabilite çalışmaları yapıldı. Çalışmada ayrıca, yabanıl tip FDH ve mutant FDH suşlarının enzim aktivitesi üzerinde farklı metal iyonlarının ve organik çözücülerin etkisi araştırıldı. Yabanıl tip ve mutant enzimlerin ikincil yapıları ve termal stabilite çalışmaları dairesel dikroizm (CD) spektroskopisi ile incelendi. Çalışma sonucunda rekombinant DNA teknolojisi ile üretilen yabanıl tip CboFDH için uygun pH 7.4, optimum sıcaklık ise 40 °C bulunurken; mutant enzimler için optimum pH ve sıcaklıklar, Phe285ThrFDH için pH 7,sıcaklık 40 °C , Val120ThrFDH için pH 7, sıcaklık 40 °C , Gln287GluFDH için pH 7, sıcaklık 60 °C , His311GlnFDH için pH 7, sıcaklık 65 °C ve Phe285Thr/His311GlnFDH için pH 8, sıcaklık 65 °C olarak bulundu. CD cihazı ile α-heliks ikincil yapıları belirlenen yabanıl tip ve mutant enzimlerin termal denatürasyon (Tm) sıcaklıkları yabanıl tip CboFDH için 64 °C , Gln287GluFDH için 70 °C, His311GlnFDH için 77 °C ve Phe285Thr/His311GlnFDH için 73 °C olarak saptandı. Enzim kinetiği çalışmaları ile yabanıl tip CboFDH için format için KM değeri 2 mM, Kcat değeri 9.2 x 102 S-1, NAD için KM değeri 1.5 mM, Kcat değeri 2.62 x 104 S-1; Phe285ThrFDH için format için KM değeri 0.97 mM ve Kcat değeri 6.23 x 103 S-1,NAD için KM değeri 2.3 mM ve Kcat değeri 4.59 x 103 S-1; Val120ThrFDH için format için KM değeri 1.3 mM ve Kcat değeri 6.23 x 103 S-1, NAD için KM değeri 7.9 mM ve Kcat değeri 1.04 x 104 S-1; Gln287GluFDH için format için KM değeri 1.65 mM ve Kcat değeri 4.42 x 103 S-1, NAD için KM değeri 3.3 mM ve Kcat değeri 9.51 x 103 S-1; His311GlnFDH için format için KM değeri 1.5 mM ve Kcat değeri 3.28 x 103 S-1, NAD için KM değeri 1.6 mM, Kcat değeri 8.2 x 103 S-1; Phe285Thr/His311GlnFDH için format için KM değeri 1.4 mM ve Kcat değeri 6.95 x 103 S-1, NAD için KM değeri 7 mM, Kcat değeri 1.21 x 104 S-1olarak hesaplandı. Farklı konsantrasyonlardaki 11 farklı metalin enzim aktivitesine etkisi sonuçlarında yabanıl tip CboFDH ve mutant FDH'ler için CuCl2 harici tüm metallerin aktiviteyi %80'e kadar artırdığı gözlenirken; CuCl2'ün artan konsantrasyonlarda %77'ye kadar enzim aktivitesini düşürdüğü bulundu. Farklı konsantrasyonlardaki 5 farklı organik çözücünün enzim aktivitesine etkisi sonuçlarında ise yabanıl tip CboFDH ve tüm mutant FDH'lerde aseton, etanol, metanol ve propanolün enzim aktivitesini %20-%31 aralığında artırdığı ancak kloroformun artan konsantrasyonlarda enzim aktivitesini %97'ye kadar düşürdüğü bulundu. Bu çalışma, bazı patolojik durumlardaki seviyeleri önemli bir belirteç olan formata mutlak spesifik ayrıca endüstriyel kullanım alanları geniş NAD+-bağımlı FDH enziminin yerli ve büyük ölçekte üretilebilmesinde veri sağlaması açısından önemlidir. Anahtar Kelimeler: Candida boidinii, Format Dehidrogenaz, Format, Protein Mühendisliği, Rekombinant DNA Teknolojisi, Termal Stabilite