Candida türlerinin restriksiyon enzim analizi ile identifikasyonu

İmmun baskılanmış hastalarda en sık rastlanan ve en önemli fungal patojenler mayalar olup; bunlar arasında da en sık Candida türlerinin izlendiği bildirilmektedir. Klinik örneklerden soyutlanan Candida türünün belirlenmesi, antifungal ilaçlara duyarlılık hakkında bilgi verdiği gibi ampirik sağaltım seçimine de ışık tutabilmektedir. Bu nedenle soyutlanan suşların hızlı, güvenilir ve doğru identifikasyonu büyük önem taşımaktadır. Çalışmamız, ciddi klinik tablolardan soyutlanan ve klasik yöntemler ile tanımlanmış olan Candida albicans ve non-albicans Candida türlerinin daha hızlı ve güvenilir identifikasyonu amacıyla restriksiyon enzim analizi yönteminin uygulanması ve sonuçların karşılaştırılması amacıyla planlanmıştır. Araştırmamıza Dokuz Eylül Üniversitesi Hastanesi Mikoloji laboratuvarına gönderilen sistemik örneklerden soyutlanan toplam 146 Candida suşu (40 C. albicans, 27 C. parapsilosis, 26 C. tropicalis, 25 C. glabrata, 11 C. kefyr, 10 C. krusei, 7 C. guilliermondii) ile birlikte C. albicans ATCC 14053, C. parapsilosis ATCC 90018 ve C. krusei ATCC 6258 numaralı kalite kontrol suşları dahil edilmiştir. Çalışmaya alınan tüm Candida suşları %50 gliserol içeren beyin kalp infüzyon buyyonunda -80°C'de stoklanmıştır. Sabouraud dekstoz agar'a iki kez pasajlanan suşlar 37°C'de 24- 48 saat inkübe edilmiştir. Üreyen suşlar çimlenme borusu testi, mısır unu tween 80 agar, CHROMagar Candida (CHROMagar, Fransa) besiyerlerindeki morfolojik özellikleri ve API 20C AUX (Biomérieux, Fransa) otomatik identifikasyon işlemi sonucuna göre tanımlanmıştır. Tüm Candida suşlarının DNA eldesi ?Nucleospin Tissue Kit? (Macherey-Nagel, Almanya) ile EDTA, litikaz ve sorbitol tampon kullanılarak üretici firma önerileri doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. Daha sonra uygulanan polimeraz zincir tepkimesi için ITS1, 5.8S rDNA ve ITS2 bölgelerini hedef alan öncül1 ve öncül3 kullanılmıştır. Amplifikasyon ürünleri ?GeneMark PCR Clean-Up Kit? kullanılarak saflaştırılmış ve takiben MwoI enzimi ile restriksiyon enzim analizi uygulanmıştır. İncelenen C. albicans suşlarının 36 tanesinde 141, 184 ve 261 bç `lik üç adet bant saptanırken, dört suşun 184 bç, 141 bç ve yaklaşık 165 bç, 95 bç'lik dört adet bant oluşturduğu gözlenmiştir. Çalışmaya alınan C. parapsilosis ve C. tropicalis suşları aynı enzim ile kesim sonucunda sırasıyla 336, 146, 88 bç'lik ve 325, 154, 97 bç'lik üçer adet bant oluşturmuştur. Bu iki türün birbirinden ayırt edilebilmesi için ek olarak BslI enzimi ile de kesim yapılmış ve C. parapsilosis suşları 413, 94, 63 bç'lik üç bant oluştururken, C. tropicalis suşları için 326, 187 ve 63 bç'lik bantlar izlenmiştir. Araştırmamıza alınan C. glabrata suşları MwoI enzimi ile kesim sonucunda 414, 174, 171, 86, 80 bç'lik bantlar oluştururken, C. kefyr suşları için 370, 430 bç'lik iki adet bant ve C. krusei suşları için 289, 134, 83, 54 bç'lik dört adet bant elde edilmiştir. MwoI enzimi ile kesilen yedi adet C. guilliermondii suşunun beş tanesi 355 ve 302 bç'lik, kalan iki suş ise yaklaşık olarak 390 ve 300 bç'lik iki adet bant oluşturmuş; BslI enziminin kullanılmasıyla söz konusu iki suşun diğer beş suştan tamamen farklı bir kesim paterni gösterdiği saptanmıştır. C. albicans suşlarında MwoI enzimi ile uygulanan yöntemin duyarlılık, özgüllük, pozitif ve negatif prediktif değerleri sırasıyla %90, %100, %100, %96,4 olarak elde edilmiştir. Aynı yöntemin C. parapsilosis ve C. tropicalis türleri için bu değerler sırasıyla %100, %78,2- 81,5, %49,1- 50,9, %100 olarak saptanmış; BslI enziminin kullanılmasıyla ise tüm değerler %100'e yükselmiştir. C. glabrata, C. kefyr, C. krusei ve C. guilliermondii türleri için MwoI enziminin kullanıldığı restriksiyon enzim analizi duyarlılıkları %100 iken, özgüllükleri %98,6- 100, pozitif prediktif değerleri %71,4- 100 ve negatif prediktif değerleri %100 olarak saptanmıştır. Çalışmada yer alan C. albicans suşlarından MwoI enzimi ile diğerleriyle farklı bölgelerden kesilerek dört bant oluşturan dört ve aynı bölgelerden kesilerek üç bant oluşturan iki adet suş ile farklı ve aynı bölgelerden kesilen ikişer adet C. guilliermondii suşuna çift yönlü dizi analizi uygulanmış ve sonuçlar Bio-Edit version 7.0 programı ile değerlendirilmiştir. Dizi analizi sonuçları incelendiğinde, MwoI enzimi ile farklı kesim paterni gösteren C. albicans suşlarının üçünde adenin yerine guanin nükleotidinin geldiği nokta mutasyonu, bir tanesinde de insersiyon/delesyon tipi mutasyon saptanmıştır. Bu mutasyonlar sonucunda suşlarda MwoI enziminin kesim bölgesine uyan nükleotid dizilimi meydana geldiği ve böylelikle kesim sonucunda diğer suşlardan farklı olarak dört adet bant oluştuğu gözlenmiştir. C. guilliermondii suşlarına ait dizi analizi sonuçları değerlendirildiğinde, her iki enzimle de diğer suşlardan farklı bölgelerden kesilen iki adet suşun Gen bankasında DNA dizisi verilen C. guilliermondii var guilliermondii dizilerine göre (% 66,6) C. guilliermondii var membranaefaciens suşlarına gerek nükleotid dizilimi ( % 91,2) gerekse aminoasit dizilimi açısından çok daha fazla benzerlik gösterdiği belirlenmiş ve bu suşlar C. guilliermondii var membranaefaciens olarak kabul edilmiştir. Araştırmamızda, Candida türlerinin identifikasyonu için altın standart olarak kabul edilen klasik yöntemlerle tanımlamada sorun yaşanan Candida türlerinin identifikasyonunda veya hızlı tanımlama gerektiğinde MwoI ve BslI enzimleri ile uygulanan restriksiyon enzim analizinin kullanabileceği, ancak bu yöntemde de bazı farklılıkların izlenebileceğinin göz önünde bulundurulması gerektiği sonucuna varıldı. Anahtar Sözcükler: Candida türleri, identifikasyon, restriksiyon enzim analizi