D-limonen'in escherichia coli üzerindeki antimikrobiyal etkinliğinin metabolomiks yaklaşımı ile belirlenmesi

Bu tezde doğal bir monoterpen olan D-limonenin Escherichia coli (E. coli) üzerindeki antimikrobiyal etkileri, hedefsiz (untargeted) Gaz Kromatografisi Kütle Spektrometrisi (GC-MS) tabanlı metabolomik analiz yöntemiyle araştırılmış ve bu aktif maddenin mikroorganizma üzerine potansiyel etkileri değerlendirilmiştir. Çalışmalarda D-limonen'in kuyucuk difüzyon testi ile minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değeri belirlenmiş ve ardından 4000 µL/L olarak belirlenen subinhibitör konsantrasyonda E. coli'ye uygulanarak 6, 12 ve 24 saatlik inkübasyonlara bırakılmıştır. Metabolomik analizler kapsamında E. coli 'de intraselüler ile ekstraselüler fraksiyonlardan metabolitler toplanarak türevlendirilmiş ve GC-MS analizleri gerçekleştirilmiştir. Elde edilen veriler MS-DIAL yazılımı ile değerlendirilmiştir. İstatistiksel değerlendirmeler MetaboAnalyst platformunda gerçekleştirilmiş ve anlamlı farklılık gösteren metabolitler belirlenmiştir. Elde edilen bulgulara göre; biyolojik numunelerin MS-DIAL'de yapılan Kovats (EI) Kütüphane kıyaslamasında çok sayıda metabolit sinyali (feature) elde edilmiş; ancak bu veriler, RT benzerliği, toplam eşleşme skoru ve sinyal/gürültü oranı gibi kalite kriterlerine göre filtrelenmiş ve yalnızca güvenilir şekilde tanımlanan 60 metabolit istatistiksel analizlere dahil edilmiştir. D-limonen uygulaması sonucunda özellikle L-(-)-malik asit, urasil ve 3-aminopropiyonitril gibi metabolitlerde artış, buna karşılık sitrik asit, bütandioik asit (diğer adıyla süksinat), kadaverin ve ornitin gibi metabolitlerde azalma gözlenmiştir (p<0,05). Örnekler arasındaki genel varyasyonu değerlendirmek amacıyla yapılan PCA ve PLS-DA skor analizlerinde, D-limonen uygulanan gruplar ile kontrol grupları arasında belirgin ayrımların oluştuğu saptanmıştır. Gruplar arası metabolit değişimlerini daha detaylı değerlendirmek için gerçekleştirilen sıcak harita (heatmap) analizlerinde ise, özellikle ekstraselüler fraksiyonlarda metabolit düzeylerinde belirgin farklılıkların oluştuğu ortaya konulmuştur. Zenginleştirme analizleri ve yolak analizleri sonuçlarına göre D-limonenin, glisin-serin-treonin metabolizması (p<0,001; etki değeri=0,52), glutatyon metabolizması (p<0,001; etki değeri=0,06), alanin, aspartat ve glutamat metabolizması (p<0,001; etki değeri=0,52) ve TCA döngüsü (p<0,001; etki değeri=0,18) gibi temel biyokimyasal yolları anlamlı şekilde etkilediği belirlenmiştir. Çalışmada ayrıca, pozitif kontrol grubu olarak kullanılan gentamisin antibiyotiği ile kıyaslamalı analizler gerçekleştirilmiş ve D-limonenin bazı metabolik etkilerinin antibiyotik benzeri mekanizmalarla örtüştüğü gözlemlenmiştir. Bu bulgular, D-limonenin yalnızca membran yüzeyinde etki göstermediğini, aynı zamanda hücresel metabolizmayı hedef alarak sistemik metabolik stres oluşturduğunu göstermektedir. Sonuç olarak, D-limonenin antibiyotik benzeri çok yönlü bir etki mekanizmasına sahip olduğu ve potansiyel bir alternatif antimikrobiyal ajan olarak değerlendirilebileceği metabolomik yaklaşımı ile desteklenmiştir.