Domateste su kullanım etkinliğinin CRISPR/Cas9 yöntemi ile artırılması

Domates (Solanum lycopersicum), dünya çapında önemli bir sebzedir. Ancak, giderek artan sıcak ve kurak koşullar altında sığ kök sistemi ve yüksek terleme ihtiyacı nedeniyle, su stresine karşı oldukça hassastır. Tarımsal sulamanın Türkiye'nin su rezervlerine önemli yük getirdiğinin bilinmesi, domates gibi tarımsal ürünlerin su kullanım verimliliğini (WUE) artırmak, verim istikrarını ve su kaynaklarının korunmasını sağlamak amacıyla bitki ıslah stratejilerinde bir zorunluluk haline gelmiştir. Bu çalışmada, CRISPR/Cas9 gen düzenleme sistemi, absisik asit (ABA) düzenlemesinden bağımsız olarak reaktif oksijen türleri (ROS) sinyal yolakları aracılığıyla stoma kapanmasının düzenlenmesinde rol oynadığı düşünülen Rho benzeri bir GTPaz olan domates SlROP9 genini hedeflemek için kullanılmıştır. SlROP9'un ekson 4'ünü hedeflemek için yüksek spesifikliğe sahip bir kılavuz RNA (gRNA) tasarlanmış ve ikili vektör pco-Cas9'a klonlanmıştır. Yapı, Agrobacterium tumefaciens suşu EHA105'e başarıyla aktarılmış ve Agrobacterium aracılı transformasyon yoluyla domatese aktarılmıştır. Çalışmada kullanılan 267 domates genotipi düşük rejenerasyon verimliliği ve glufosinat seleksiyonuna aşırı duyarlılık sergilese de, seçim koşulları optimize edilerek transgenik hatlar elde edilmiştir. PCR ve Sanger dizileme, dört farklı T₀ bitkisinde CRISPR kaynaklı mutasyonların varlığını doğrulamış, ve indel analizi, SlROP9 kodlama dizisini bozan hem biallelik hem de kimerik mutasyonların varlığını ortaya çıkarmıştır. T0 bitkilerinden olgunlaşmamış meyvelerin embriyo kültürü yoluyla elde edilen T₁ bitkileri ve olgun meyvelerden elde edilen T₁ tohumları başarıyla çoğaltılmıştır. T1 generasyonunda yapılacak mutasyon analizleri sonucu homozgigot mutant bitkiler belirlenecek ve tohumları çoğaltılacaktır. Bu bitkilerden, Çalışma, SlROP9'da başarılı hedefli mutagenezin kanıtını sunarak, kuraklığa dayanıklılığı ve WUE'si iyileştirilmiş domates hatlarının geliştirilmesi için zemin hazırlamaktadır. SlROP9 mutasyonunun su kullanım verimliliği, kuraklığa dayanıklılık ve genel verimlilik üzerindeki işlevsel etkisini doğrulamak için daha fazla fizyolojik karakterizasyon, çok nesilli ve tekerrürlü saha denemeleri ve su kullanım parametreleri önerilmektedir. ANAHTAR KELİMELER: Agrobacterium transformasyon, CRISPR/Cas9, Domates, Gen düzenleme, Kuraklık stresi, SlROP9, Stoma düzenleme, Su kullanım etkinliği