Theses supervised by Prof. Dr. Nedim Mutlu
18 theses · Akdeniz University
Biberde (Capsicum annuum L.) çinko etkinliğinin belirlenmesi ve haritalanması
Yürütülen bu çalışmada, çinko eksikliğine karşı dayanıklılığı kontrol eden genlerin/QTL'lerin kromozom bölgelerinin belirlenmesi, bu genlere bağlı moleküler markırların tespit edilmesi ve Inter Primer Binding Sites (IPBS) markırlarının biber genomunda ilk defa haritalanması amaçlanmıştır. Elde edilen bulgular ve yöntemler, biberin (Capsicum annuum L.) üyesi olduğu Solanaceae familyasına ait diğer bitki türleri için de kullanılabilir nitelikte olabilir. Bu çalışmada Alata/Mersin Bahçe Kültürleri Araştırma Merkezine ait çinko (Zn) etkinliği yüksek Capsicum annuum L. hattı Alata21A ile Zn etkinliği düşük Capsicum frutescens L. PI281420'nin melezlenmesi ile oluşturulan 93 adet F2 bireyine ait F2;3 popülasyonu kullanılmıştır. Genetik haritalama çalışması F2 populasyonunda, çinko etkinliği testlemeleri seçici genotipleme ile belirlenen 93 F2 bitkisine ait F2;3 projenileri kullanılarak yürütülmüştür. Zn etkinlik testlemeleri, her F2;3 projenisine yirmidört (24) bitkinin yarısı çinko destekli, diğer yarısı çinko desteksiz bitki düşecek şekilde üç tekerrürlü tesadüf blokları deneme desenine göre kurulmuştur. Yetiştirilen bitkiler 0-5 skalasına göre puanlanmış ve kuru madde miktarları her birey için ayrı ayrı belirlenmiştir. Hesaplamalar ile elde edilen sonuçlar, karakteri kontrol eden genleri/QTL'leri barındıran kromozom bölgelerinin yerinin tespitinde kullanılmıştır. Haritalama için kullanılan her bağlantı grubu dominant SRAP (Sequence-Related Amplified Polymorphism), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), IPBS (Inter Primer Binding Sites) markırları ve ko-dominant SSR (Simple Sequence Repeat) markırları kullanılarak belirlenmiştir. Markır analizleri sonucu elde edilen veriler ile JoinMap 4.1 programında genetik harita oluşturulmuş ve MapQTL 6 programıyla da genlerin/QTL'lerin yerleri tespit edilmiştir. Çinko etkinliğini kontrol eden 36 QTL 2, 3, 5, 8.1, 8.2, 10.2, 11, 12, X1, X3 ve X4 kromozomlarında tespit edilmiştir. Yapılan bu çalışma ile ilk defa IPBS markırları (44 adet) biber genomunda haritalanmıştır. Bu araştırma ile saptanan sonuçlar, çinko eksikliğine bağlı olarak ortaya çıkan gizli ve görünür verim kayıplarını gidermek için kullanılabilir niteliktedir. Çinko etkinliğinin genetik mekanizmasının anlaşılması ve bu karakteri kontrol eden genlerin bağlantı gruplarının belirlenmesi, çinko etkinliği yüksek biber çeşitlerinin geliştirilip ülkemizin dünyada bir adım öne taşınması sağlanabilir.
Asmada (Vitis vinifera L.) CRISPR/Cas9 genom düzenleme teknolojisi ile küllemeye (Erysiphe necator) dayanıklı bitkilerin geliştirilmesi
Dünya çapında asma yetiştiriciliğinde ekonomik açıdan en büyük kayıplar Erysiphe necator'un neden olduğu külleme hastalığından kaynaklanmaktadır. Dünyada toplam üzüm üretiminin yaklaşık %90'ına karşılık gelen çeşitlerin oluşturduğu Vitis vinifera L. türüne ait asmaların yaklaşık tamamının bu hastalığa hassas olduğu kabul edilmektedir. Patojenin dünyadaki üzüm yetiştirme bölgelerine yayılmış olması, bağcılıkta sık ilaçlama programlarının kullanımını gerektirmektedir. Bu amaçla kullanılan kimyasallar, yetiştiriciler için ek üretim maliyeti olmakla birlikte bağda çalışanlar ve bağda bulunan faydalı organizmaların sağlığını da olumsuz etkilemektedir. Son yıllarda pek çok araştırma, S (susceptible) genleri olarak tanımlanan, bitki ve patojen arasındaki uyumlu etkileşime olanak sağlayan genlerin dirençli tür ıslahında kullanım potansiyeli bulundurduğunu göstermektedir. MLO adı verilen lokuslarda bulunan S-genlerinin susturulması ile bitkilere külleme direnci kazandırılabileceğine yönelik çeşitli araştırmalar bulunmaktadır. A. thaliana, arpa, domates gibi bitkilerde bu uygulamanın başarılı sonuçları, asmada MLO genleri ile gerçekleştirilecek gen susturma çalışmaları için umut olmuştur. Çalışmada, CRISPR teknolojisinin uygulama alanlarından; gen susturma ve baz düzenlemesi birlikte kullanılarak MLO ve ALS (asetolaktat sentaz) genlerinde mutasyonlar oluşturulması hedeflenmiştir. Bunun için Agrobacterium tumefaciens ve CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak, ilgili kılavuz RNA'lardan asmaya hem geçici hem de kalıcı olarak aktarılanların seçilmesi hedeflenmiştir. Bu kapsamda, MLO genlerini susturmaya yönelik hazırlanmış vektör tasarımının yanında ALS (asetolaktat sentaz) genlerini hedefleyen ek bir tasarım, bitkiye A. tumefaciens EHA105 suşu aracılığıyla entegre edilmiştir. Bunun için öncelikle ALS genlerine yönelik hazırlanan transformasyon vektörünün ilgili genlerde baz değişimi (C→U(T)) gerçekleştirmesi, Prolin (ALS1 geni için Pro 74, ALS2 geni için Pro175) amino asidinin Serin'e dönüştürülmesi hedeflenmiştir. Bu değişikliğin bitkilerde sülfonil üre grubu herbisitlere karşı dayanım geliştirdiği literatürde yer alan çok sayıda çalışma ile gösterilmiştir. Geçici transformasyon sonrası seçilen embriyojenik kalluslar sülfonil üre grubu herbisit seleksiyonundan geçirilerek bitki rejenerasyonları sağlanmıştır. Çalışma sonunda Siyah Kişmiş çeşidinde rejenere edilen 132 bitkinin 28'inde transformasyonun kalıcı olarak gerçekleştiği belirlenmiştir. Bunlar arasında 2 bitkide Gly177 rezidülerde tek baz mutasyonları izlenmiştir. Geçici entegrasyonun değerlendirildiği, kalan 104 bitkide mutasyon izlenmemiştir. Çalışmadan elde edilen sonuçların, asmada Siyah Kişmiş çeşidinde izlenecek gen aktarma çalışmalarında etkin olarak kullanılabileceği, transgen taşımayan ve MLO genleri yönünden mutant bitkilerin elde edilmesi için ise gelecekte yapılacak çalışmalara yol göstereceği beklenmektedir.
Sivri ve dolma biberlerde genel ve özel kombinasyon yeteneklerinin incelenmesi
Tüm dünyada sebze üretiminin başında hibrit tohumları yer almaktadır.Bu hibrit tohumları çeşitli ıslah yöntemlerinin yardımıyla oluşturulmaktadır. Bu yöntemler sayesinde en verimli ve istenilen kalitede ürün yetiştirmek mümkün hale gelmektedir.Genel ve özel kombinasyon yeteneğinin incelenmesi ıslah çalışmalarında yeni ve istenilen melezlerin oluşturulması açısından önem arz etmektedir. Genel kombinasyon yeteneği testinde, elde bulunan tüm hatlar ayrı ayrı tek bir ebeveyn ile melezlenir ve elde edilen hibritlerde kendi aralarında karşılaştırılır. Böylece üstün özellikleri taşıyan hatlar genel kombinasyon yeteneği üstün olarak seçilir. Genel kombinasyon yeteneği testinde seçilmiş olan ebeveyn adayları ikinci aşamada özel kombinasyon testine tabi tutulur. Özel kombinasyon yeteneği, ebeveyn adaylarının değişik hatlarla melezlendiklerinde bunlardan hangileri ile daha iyi uyuştuğunu ifade eden bir özelliktir.Bu çalışmada mevcut olan seçilmiş hatlar belli melezlemelere tabi tutulmuştur. Melezlemede üstün performans sergileyen hibritler yani genel kombinasyon yeteneği sonrasında, seçilmiş ebeveynlerimiz özel kombinasyon yetenekleri inceleme aşamasına geçilmiştir. Özel kombinasyon yeteneği sonrasında seçilen en ilginç F1 melezleri değişik lokasyonlarda ve zamanlarda birkaç kez denenerek tescil için hazırlanır.
RBD ve nucleocapsıd füzyon proteininin mühendisliği, üretimi ve karakterizasyonu
SARS-CoV-2, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2, is a singlestranded RNA virus that causes the infection known as COVID-19 in humans. SARSCoV-2 has led to the COVID-19 pandemic, which has caused loss of life in millions deficit worldwide. Since the first days of the COVID-19 pandemic, the development of preventive and curative treatments has gained importance. The rapid variation of SARSCoV-2 and the low response of the virus to treatments have brought the issue of a universal COVID-19 vaccine as topic. The RBD subunit of the spike protein of SARSCoV-2 recognizes the host's ACE2 receptor and initiates the infection by binding. The conservation of the RBD subunit among SARS-CoV-2 variants has led to the development of therapeutic agents. The specific biochemical structure of the nucleocapsid protein, its role in the infection process brought about its use as a therapeutic protein bring a different interpretation from other studies. Recombinant RBD and nucleocapsid fusion protein acts as an antigen by triggering immunity before infection develops in the host. The aim of this thesis was the production of a recombinant fusion protein comprising of RBD and nucleocapsid proteins in Nicotiana benthamiana plants and compare its functional activity with antigen cocktail, comprising of recombinant RBD and nucleocapsid, which was previously produced in Mammedov's laboratory and characterized. For this purpose, the engineered fusion protein was expressed using plant expression vector and produced fusion protein was purified from N. benthamiana plant and characterized. The production and characterization of the fusion protein within the scope of this master's thesis is still ongoing in our laboratory. Immunogenicity studies will examine the antibody titers in mice. When the immunogenicity studies are completed, it is expected that the fusion protein may induce high antibody titers like the cocktail antigens and will be a promising approach for vaccine research against SARSCoV-2.
CBDP ve CEAP moleküler markırlar kullanılarak nerium oleander l.'nin genetik çeşitliliği ve tanımlanması
Nerium oleander, Türkiye'de süs ve tıbbi amaçlarla değerlendirilen önemli bitkilerden biridir. Antioksidan ve anti-nematosidal özelliklerin kaynağıdır. İncelenen literatüre göre, Türkiye'de bitkinin genetik çeşitliliğini araştıran herhangi bir çalışma henüz yapılmamıştır. Bu çalışmanın amacı, Türkiye'deki Nerium oleander'in genetik çeşitliliğini ve popülasyon yapısını değerlendirmektir. Bu çalışmada, Türkiye'nin 3 bölgesinden (Doğu Akdeniz, Batı Akdeniz ve Ege) toplanan 101 Nerium oleander örneğinin genetik çeşitliliğini değerlendirmek için CAAT box derived polymorphism (CBDP) ve Cis element amplified polymorphism (CEAP) moleküler markırlarının 10 primeri kullanılmaktadır. CBDP ve CEAP primerleri sırasıyla primer başına ortalama 11 ve 10 bant ile 89 (%80,91) ve 83 (%80,59) polimorfik bant üretmiştir. Ortalama PIC, CBDP'de (0.35) CEAP'den (0.30) daha yüksekti. Polimorfizm, beklenen heterozigotluk, efektif multipleks oranı, ayırıcı güç, çözme gücü parametreleri daha yüksek olan N. oleander genotiplerinin ayrımında CBDP'nin CEAP'a göre daha etkili olduğu görülmüştür. Komşu birleştirme (Neighbor joining) dendrogramına dayalı grafik elde edildiğinde, genotiplerin kısmen lokasyona göre kümelendiği ve ayrıca antropojenik ile doğal ortama göre kümelendiği ortaya çıkmıştır. Bayesian Structure analizine dayalı popülasyon yapısı analizi, genotipleri iki alt popülasyona ayırmıştır, SP1 esas olarak doğal N. oleander ve SP2 antropojenik N. oleander genotiplerinden oluşmaktadır. Bu sonuçlar, temel bileşen analizi (PCA) ve dendrogram ile doğrulanmıştır. Bu çalışma, CBDP ve CEAP'ın N. oleander genotiplerini ayırt etmede etkili olduğunu ve N. oleander'ın Türkiye'de yüksek genetik çeşitliliğe sahip olduğunu ortaya koymuştur. Genetik çeşitlilik doğal N. oleander genotiplerinde antropojenik genotiplerden daha yüksekti. Bu çalışma, gelecekteki koruma çabaları, haritalama ve ıslah amacıyla farklı karakterlerle ilişkili genlerin tanımlanması için temel oluşturmaktadır.
Domateste su kullanım etkinliğinin CRISPR/Cas9 yöntemi ile artırılması
Domates (Solanum lycopersicum), dünya çapında önemli bir sebzedir. Ancak, giderek artan sıcak ve kurak koşullar altında sığ kök sistemi ve yüksek terleme ihtiyacı nedeniyle, su stresine karşı oldukça hassastır. Tarımsal sulamanın Türkiye'nin su rezervlerine önemli yük getirdiğinin bilinmesi, domates gibi tarımsal ürünlerin su kullanım verimliliğini (WUE) artırmak, verim istikrarını ve su kaynaklarının korunmasını sağlamak amacıyla bitki ıslah stratejilerinde bir zorunluluk haline gelmiştir. Bu çalışmada, CRISPR/Cas9 gen düzenleme sistemi, absisik asit (ABA) düzenlemesinden bağımsız olarak reaktif oksijen türleri (ROS) sinyal yolakları aracılığıyla stoma kapanmasının düzenlenmesinde rol oynadığı düşünülen Rho benzeri bir GTPaz olan domates SlROP9 genini hedeflemek için kullanılmıştır. SlROP9'un ekson 4'ünü hedeflemek için yüksek spesifikliğe sahip bir kılavuz RNA (gRNA) tasarlanmış ve ikili vektör pco-Cas9'a klonlanmıştır. Yapı, Agrobacterium tumefaciens suşu EHA105'e başarıyla aktarılmış ve Agrobacterium aracılı transformasyon yoluyla domatese aktarılmıştır. Çalışmada kullanılan 267 domates genotipi düşük rejenerasyon verimliliği ve glufosinat seleksiyonuna aşırı duyarlılık sergilese de, seçim koşulları optimize edilerek transgenik hatlar elde edilmiştir. PCR ve Sanger dizileme, dört farklı T₀ bitkisinde CRISPR kaynaklı mutasyonların varlığını doğrulamış, ve indel analizi, SlROP9 kodlama dizisini bozan hem biallelik hem de kimerik mutasyonların varlığını ortaya çıkarmıştır. T0 bitkilerinden olgunlaşmamış meyvelerin embriyo kültürü yoluyla elde edilen T₁ bitkileri ve olgun meyvelerden elde edilen T₁ tohumları başarıyla çoğaltılmıştır. T1 generasyonunda yapılacak mutasyon analizleri sonucu homozgigot mutant bitkiler belirlenecek ve tohumları çoğaltılacaktır. Bu bitkilerden, Çalışma, SlROP9'da başarılı hedefli mutagenezin kanıtını sunarak, kuraklığa dayanıklılığı ve WUE'si iyileştirilmiş domates hatlarının geliştirilmesi için zemin hazırlamaktadır. SlROP9 mutasyonunun su kullanım verimliliği, kuraklığa dayanıklılık ve genel verimlilik üzerindeki işlevsel etkisini doğrulamak için daha fazla fizyolojik karakterizasyon, çok nesilli ve tekerrürlü saha denemeleri ve su kullanım parametreleri önerilmektedir. ANAHTAR KELİMELER: Agrobacterium transformasyon, CRISPR/Cas9, Domates, Gen düzenleme, Kuraklık stresi, SlROP9, Stoma düzenleme, Su kullanım etkinliği
Gen düzenleme teknolojisi (CRISPR) kullanılarak canavar otu (Orobanche spp., Phelipanche spp.)' na dayanıklı domates ıslahı
Domates (Solanum lycopersicum), dünya genelinde yaygın üretimi ve yüksek tüketim oranlarıyla öne çıkan, önemli ekonomik değere sahip temel tarım ürünlerinden biridir. Ancak çevresel koşullar, toprak yapısı, bitki besleme stratejileri, sulama sistemleri ve çeşitli patojenler gibi üretimi sınırlandırıcı faktörler, domates tarımında verim ve kalite kayıplarına yol açabilmektedir. Özellikle dünya çapında ve Türkiye'de domates üretimini kısıtlayan önemli sorunlardan biri, tamamen parazitik yaşam sürdüren ve yaşam döngüsünü konukçu bitki üzerine kuran Orobanche spp. ve Phelipanche spp. gibi "canavar otu" türleridir. Uygun çevresel şartlar altında, konukçu bitkilerin köklerinden karotenoid metabolizması aracılığıyla sentezlenip salgılanan strigolakton hormonları sayesinde çimlenen canavar otu tohumları, domates bitkisine tutunarak ciddi zararlar meydana getirmektedir. Bu çalışmada, kök paraziti Orobanche spp. ve Phelipanche spp. türlerine karşı dayanıklı domates (Solanum lycopersicum) hatlarının geliştirilmesi amacıyla, strigolakton biyosentezinde görev alan SlCCD8 genine yönelik CRISPR/Cas9 gen düzenleme teknolojisi uygulanmıştır. Bu kapsamda özgün rehber RNA (gRNA) dizileri tasarlanarak, Cas9 proteini ile birlikte Agrobacterium aracılığıyla domates bitkilerine aktarılmış ve bitki transformasyonu gerçekleştirilmiştir. Gen düzenleme sonrası oluşan "çerçeve içi (in-frame)" mutasyonlar taşıyan T1 ve T2 generasyonlar, hem hidroponik sistemde hem de saksı denemelerinde T3 generasyonu ise hidroponik sistemde canavar otu dayanıklılığı açısından test edilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre, mutasyona uğramış D38 genotipinde canavar otu tüberkül gelişiminin gözlenmemesi, bu mutasyonun parazite karşı etkin bir dayanıklık sağladığını ortaya koymuştur. Ayrıca D38 hattı, biyotik stres koşullarına rağmen gelişim şeklini korumuş, bu da elde edilen genotiplerin ıslah programlarında doğrudan kullanım potansiyelini göstermiştir. Moleküler düzeyde yapılan RT-qPCR gen ifade analizleri sonucunda, mutant bitkilerde CCD8 gen ekspresyonunun kontrol grubuna göre anlamlı şekilde arttığı; buna karşılık CCD7 ve MAX1 genlerinde istatistiki olarak anlamlı bir fark bulunmadığı belirlenmiştir. Bu çalışma, klasik kimyasal mücadele yöntemlerinin sınırlarını aşan, çevre dostu ve hedefe yönelik bir dayanıklılık ıslah stratejisi sunmakta; aynı zamanda CRISPR/Cas9 sisteminin domateste parazit yabancı otlara karşı fonksiyonel genetik yaklaşım olarak kullanılabilirliğini göstermektedir. Elde edilen bulgular, CRISPR/Cas9 ile gen düzenleme temelli dayanıklılık mekanizmalarının, gelecekte domates gibi stratejik tarım ürünlerinde sürdürülebilir ıslah programlarına katkı sağlayabileceğini göstermektedir.
Nicotiana benthamiana bitkisinde G protein varyantlarının mühendisliği, üretimi, karakterizasyonu ve hayvanlarda immünojenisite çalışmaları
Kuduz, merkezi sinir sistemini etkileyen ve nihayetinde beyin hastalıgına ve ölüme yol açan kuduz virüsünün (Lyssavirus) neden olduğu viral bir hastalıktır. Kuduz genellikle evcil köpekler ve vahşi etçil hayvanlar arasında genelikle ısırık yoluyla bulaşır. Kuduz virüsü (RABV), merkezi sinir sistemini enfekte ederek beyinde hastalığa ve ölüme neden olmaktadır. Kuduz hastalığı tedavi edilmezse %100 ölümcüldür ve sonuçta dünya çapında, özellikle gelişmekte olan ülkelerdeki çocuklar arasında yılda 70.000'den fazla ölüme neden olmakdadır. Kuduz aşı ile önlenebilir. Kuduza karşı birkaç insan ve hayvan aşısı mevcut olmasına rağmen, bunlar yüksek maliyetli ve nispeten düşük immünojenikliğe sahip ve ayrıca üretilmesi de zordur. Bu nedenle, büyük miktarlarda üretilebilen daha ucuz, daha immünojenik ve güvenli kuduz aşılarına acilen ihtiyaç duyulmaktadır. Geçici bitki ekspresyon sistemi, aşılar, antikorlar, memeli kompleks proteinleri dahil terapötik proteinler gibi çok çeşitli rekombinant proteinlerin ekspresyonu için daha çekici ve umut verici bir platform haline gelişdirildi. Bu çalışmada, Nicotiana benthamiana bitkisinde ilk kez geçici ekspresyon sistemini kullanarak kuduz virüsünün kesilmiş bir glikoprotein (G proteini) varyantlarının monomerik (RG2) ve trimerik (RG3) formalarını tasarladık ve üretildi. Bitki tarafından üretilen RG2 ve RG3 proteinleri, Ni-NTA kolon kromatografisiyle saflaştırıldı. RG2 proteinin saflaştırma verimi ~32, RG3 proteinin saflaştırma verimi ise ~ 20 mg/kg bitki yaprağı olmuştur. İmmünojenisite çalışmalarının sonuçları, bitkinin G-protein varyantlarının üretildiğini, farelerde önemli ölçüde yüksek antikor titrelerini ortaya çıkardığını gösterdi. 5 ug RG3 ile aşılanan fareler, aynı miktarda RG2 protein ile aşılanan ile karşılaştırıldığında daha yüksek titreli antikor ortaya çıkardı. Bitki tarafından üretilen G-protein varyantları, uygun maliyetli, güvenli ve yüksek oranda immünojenik bir kuduz aşısı aday olabilecektir.
Ayçiçeği ıslahında moleküler markır yardımlı seleksiyon ile restorer (Rf/rf) allellerinin tespiti
Ayçiçeği ıslahında moleküler markır yardımlı seleksiyon ile idameci (maintainer) ve restorer (Rf) nükleusu taşıyan bitkilerin tespiti amaçlanmıştır. Yerli hibrit ayçiçeği ıslahında moleküler markır yardımlı seleksiyon ile idameci (maintainer) ve restorer (Rf) nükleusu taşıyan bitkilerin tespiti için kodominant SCAR ve dominant markırları Rf1/rf1 allellerinin belirlenmesinde kullanılanlarıdır. B hattı geliştirmek için fertil sitoplazma taşıyan B grubu bitkilere heterozigot Rfrf nükleusu taşıyan bitkilerle yapılan geriye melezleme çalışmalarında %50 rfrf, %50 Rfrf geriye melez populasyonları elde edilmektedir ve ayrıca heterozigot Rfrf B grubu bitkilerin kendilenmesi sonucu RfRf, Rfrf, ve rfrf genotipindeki F2 genotipik açılımları (BCnF2) de ortaya çıkmaktadır. Bu rfrf genotipindeki bitkilerin belirlenebilmesi için test melezlemeleri yapılıp bir sonraki generasyonda F1 döllerinde çiçekler uygun iklim koşullarında testlenerek ayrıştırılarak aynı zamanda Rf/rf ayrımı yapan moleküler markılar kullanılıp istenilen genotiplerin markırlarla doğru ve verimli bir şekilde belirlenip belirlenemediği kontrol edilmektedir. Bir başka ifade ile, idameci (B) hatlarında sitoplazmaları fertil olduğundan nükleuslarındaki Rf/rf allellerinin durumunu tespit etmek mümkün değildir. B hatlarının nükleusunda Rf/rf durumunu ancak kısır (A) hatlarına test melezlemesi ve elde edilen F1 bitkilerinin yetiştirilip kısır ya da fertil olup olmamasının gözlemlenmesi ile anlaşılmaktadır. B hatlarında Rf/rf allellerinin moleküler markırlar ile tespiti hem maliyet hemde ıslah süresini azaltmak için önemlidir.
CRISPR Cas9 teknolojisini kullanarak patlıcan genomunun düzenlenmesi
Eggplant (Solanum melongena L.,) is one of the most important vegetables in many countries. It has a long growing season, which makes it one of the vegetables more exposed to pests, disease attack, environmental stress and parasitic weeds. Orobanche spp, also known as broomrape, is one of the parasitic weeds that can cause great damage to eggplant yields. It is known that in order to germinate, the seeds of these parasites must be exposed to certain chemicals called strigolactones [SLs], which are released by the roots of the host. The CCD8 gene is involved in the synthesis of strigolactones and plays an important role in controlling growth and development. CRISPR-Cas9 was used to manipulate the SmCCD8 gene in eggplant (Solanum melongena L). The objective of the was study to create eggplants resistant to broomrape by knocking out or modifying the SmCCD8 gene. Yamula eggplant cultivar was used for transformation. Using Agrobacterium-mediated plant transformation method, gRNA and Cas9 were transferred to eggplant. Eggplant cotyledons were used as the plant material for Agrobacterium transformation. Successful editing of eggplant lines was confirmed by Sanger sequencing. The induced mutations were stably inherited in T1 and T2 progenies. Our results based on CRISPR-Cas9 technology open the way to the development of eggplant genotypes resistant to parasitic weeds.
Lygus spp.'ye karşı dayanıklı patlıcan (Solanum melongena) kaynaklarının araştırılması
Eggplant, an important species of Solanacae family, is rich for vitamins and minerals with a vegetable of great economic value. In Turkey, eggplant is produced both in open fields and greenhouses, and there are many problems that limit production and quality of eggplants. Lygus spp. is one of the emerging pest problems. Lygus is generally known as a cotton pest. But in recent years, open-field eggplant tests particularly in Korkuteli-Antalya, showed potentially economic damage of the pest on eggplant production. This problem has increased in open-field eggplant cultivation in recent years. To date, a line resistant to Lygus spp has not been reported. The objective of the study was to identify resistant sources of this pest in eggplant through field test. A replicated field trial involving, seven different varieties of eggplant, 250 different plants have been studied and observed in Korkuteli-Antalya region (2019). The eggplant genotypes were scored for resistance against Lygus damage. In the observations, especially meristem and flower damage were taken into account. Lygus damage to orobanche (Orobanche spp.) and potato beetle (Leptinotarsa decemlineata) have also been identified and measured. The data related to the findings obtained in this study was used in excel for statistical analysis. In this study, all forms of damage from Lygus spp. it is understood that eggplant's major damage was on the stem of the flowers. For this purpose, meristem and stalk observation method were used to test eggplant plants. And two genotypes with potential resistance against Lygus were identified. These sources are both S.macrocarpon, MM1127 and MM12209 materials, and they showed more than 60% resistance in both materials.
Domates sarı yaprak kıvırcıklık virüsü (Ty-3) ve domates lekeli solgunluk virüsü (Sw-5)'e dayanıklı domates (Solanum lycoperscum L.) hatlarının moleküler marker yardımlı geri melezleme yöntemi ile ıslah edilmesi
Çeşitli virüsler domates üretiminde önemli verim ve kalite kayıplarına sebep olmaktadır. Bu çalışmanın amacı; verim ve kalite özellikleri bakımından ticarileşme potansiyeli olan fakat önemli iki virüs etmenine hassas bahar yetiştiriciliğine uygun sırık sofralık domates çeşit adayının ebeveyn hattına ilgili virüslere karşı dayanıklılık kazandırmaktır. Domates Solgunluk Virüsü ve Domates Sarı Yaprak Kıvırcıklığı Virüsüne karşı dayanıklılık veren genler markır yardımlı geriye melezleme programı ile ebeveyn hatta aktarılmıştır. Bunun için, TYLCV'ye ve TSWV'ye hassas "51" numaralı ebeveyn hat çift dayanım taşıyan donör "202 F1" numaralı hibritle melezlenmiştir. Elde edilen ilk popülasyon (pseudo-BC1F1) fide döneminde moleküler markırlar ile taranmış, Ty-3 ve Sw-5 taşıyan bitkiler serada yetiştirilmiş, "51" numaralı tekrarlanan ebeveyne geriye melezlenmiştir. Bitkisel ve agronomik karakterler bakımından üstün olan bitkilerden elde edilen BC2F1 tohumlarından tekrar fide yetiştirilmiş ve yukardaki işlemler tekrar edilmiştir. Çift virüs dayanımlı tekrarlanan ebeveynin özelliklerini sergileyen BC2F1 bitkileri kendilenmiş ve homozigot çift virüs dayanımlı BC2F2 bitkileri elde edilmiştir. Çift dayanımlı (Ty-3 ve Sw-5) bitkiler ilgili moleküler markırlar yardımıyla belirlenmiş ve BC2F2 aşamasına kadar getirilmiştir. Ty-3 ve Sw-5'e genlerini homozigot taşıyan 12 adet bitki tekrarlanan ebeveynin yerine ve çift virüs dayanımlı hibrit domates adaylarının geliştirilmesinde kullanılacaktır. Ty-3 ve Sw-5 geniyle bağlantılı moleküler markırlar kullanılarak ikili dayanımlı hatlar geliştirilmesi, domateste önemli ekonomik kayıplara neden olan TYLCV ve TSWV virüslerine karşı yerli ve dayanıklı çeşit geliştirilmesini sağlayacaktır. Çalışma ile markır destekli seleksiyon yöntemlerini kullanarak Sw-5 ve Ty-3 genlerini taşıyan ebeveyn hatlar geliştirilmiştir. Dayanıklılık genlerini taşıyan hibritlerin ticarileşmesi ile bu etmenlerden kaynaklanan verim ve kalite kayıpları önlenecektir.
Gen düzenleme teknolojisi (CRISPR) kullanılarak canavar otuna (Orobanche spp., Phelipanche spp.) karşı dayanıklı domates geliştirilmesi
Tomato is one of the main cultivated plants with economic value and extensive production-consumption in the World. The factors limiting production and affecting yields, such as environmental conditions, soil structure, plant nutrition practices, irrigation methods, and pathogens, are also quite restrictive in tomato cultivation. Broomrape (Orobanche spp. / Phelipanche spp.) is a completely parasitic weed that survives depending on its host and causes yield and quality losses in tomato in the World, including Turkey. Under suitable environmental conditions, broomrape seeds germinate by a "strigolactones" signal, a plant hormone synthesized by the carotenoid pathway and secreted from the host plant's roots. In this thesis, SlCCD7 and/or SlCCD8 (Carotenoid Cleavage Dioxygenase 7 and 8) genes, that are known to play a critical role in strigolactone synthesis in tomato, were manipulated by CRISPR-Cas9 gene-editing technology. Guide RNAs and Cas9 designed in this method were transferred to tomato using the Agrobacterium-mediated plant transformation method. Among the many transgenic events, deletion/insertion knockouts and in-frame modifications of slccd7, slccd8, and slccd7-slccd8 were generated. The significant homozygous biallelic "in-frame" mutation between Thr42- Val105 in the SlCCD7-exon 1 region of slccd7 T2 mutants has been characterized. The in-frame mutation may negatively affect the strigolactone pathway and provide resistance against Orobanche spp. / Phelipanche spp. Mutants with this "in-frame" mutation have the potential to be an essential breeding material in terms of their agronomic characteristics and -possible- broomrape resistance genetic source.
Domates ıslahında TSWV, TYLCV, FORL dayanımlarının hibrit verimine etkisi
Bu çalışmanın amacı; verim ve kalite bakımından ticari potansiyele sahip olan fakat Domates sarı yaprak kıvırcıklık virüsü (TYLCV), Domates lekeli solgunluk virüsü (TSWV), Fusaryum kök ve kökboğazı çürüklüğüne (FORL) karşı hassas olan; sırık sofralık baharlık segmente uygun (213♀x51♂) 17-52 F1 hibrit domates çeşidinin, 51♂ numaralı baba ebeveynine moleküler markır yardımlı geriye melezleme yöntemi ile ilgili dayanıklılık genlerinin aktarılmasıdır. Ve ilgili dayanıklılık genlerinin tek başlarına ve/veya birlikte hibrit verimine, bitki ve meyve özelliklerine etkilerini olup saptamaktır. Dayanıklılık veren genler (Ty-3, Sw-5, Frl) moleküler markır yardımlı geriye melezleme ıslah programı ile hassas elit hatta aktarılmıştır. 51♂ numaralı elit hassas hat ile üçlü (TYLCV, TSWV, FORL) heterozigot dayanıklı donör kaynak "4293 F1" melezlenmiştir. Melezleme sonucu elde edilen ilk populasyonun (pseudo.BC1F1) fideleri moleküler markırlar yardımıyla taranmış ve heterozigot dayanıklı bitkiler ile geriye melezleme döngüsüne devam edilmiştir. p.BC3 F1 aşamasında çiftli dayanıklı Ty-3, Sw-5 genlerini tek veya birlikte taşıyan moleküler markır yardımlı seleksiyon ve agronomik karakterler bakımından elit hatta benzerlik gösteren bitkiler kendilenerek p.BC3 F2 aşamasına getirilmiştir. p.BC3 F2 kendileme populasyonu FORL için klasik testlemeye tabi tutulmuştur. Ty-3 ve Sw-5 bakımından tekli veya çift dayanıma sahip 128 homozigot dayanıklı bitki moleküler markırlar yardımıyla tespit edilip hassas 17-52 F1 hibrit çeşidinin 213♀ numaralı orjinal anne ebeveyn ile melezlenmiştir. Elde edilen 106 yeni hibrit; 2021 bahar döneminde piyasada satılan ticari şahit çeşitlerin ve hassas 17-52 F1 hibrit çeşidininde olduğu tekerrürlü deneme dikimi yapılarak bahar dönemi verim denemesine tabi tutulmuştur. Deneme süresi boyunca beğenilen hibritlerin gözlem verileri alınmıştır. En verimli hibrit çeşit adaylarının bitki kök başına ortalama verim değerleri, orijinal 17-52 F1 değerleri ile t-testi analizi sonucu önemli bir farklılık bulunmamıştır. Ticarileşme potansiyeli olan dayanıklı, verimli ve en beğenilen hibrit çeşit adayları seçilmiş ve tescil denemesine alınmıştır. ANAHTAR KELİMELER: TSWV, TYLCV, FORL, domates ıslahı, geriye melez, hibrit verimi, linkaj sürüklenmesi
Farklı ploidi seviyesine sahip bermuda çimi (Cynodon dactylon L. Pers.) genotiplerinde kendileme ve yabancı döllenme oranlarının moleküler markırlarla belirlenmesi
Bu çalışmada, farklı ploidi düzeylerine sahip olan bermuda çimi (Cynodon dactylon) genotiplerinin kendilenme ve yabancı tozlanma oranlarının moleküler markırlar ile belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmada 4 farklı hekzaploid (6x), 4 adet tetraploid (4x) ve 3 adet de diploid (2x) genotip kullanılmıştır. Bu genotiplerden iki farklı şekilde populasyonlar elde edilmiştir. Birincisi, izole koşullarda elde edilen kendileme populasyonları, ve ikincisi açık tozlanma koşullarında oluşmuş tohumlardan elde edilen half-sib bireylerdir. Bu genotipler ve bu genotiplerden elde edilen tohumlar çimlendirilererk fideler elde edilip, DNA izole edilmiş, ve kendileme ve yabancı tozlanma oranlarının tespiti için 15 SSR primeri ile polimorfizm taraması yapılmıştır. İlk önce ebeveyn genotipler bu 15 SSR primeri ile taranmış bu tarama sonucunda her populasyon için hangi primerlerin kullanılacağı belirlenmiştir. Çalışmada kendilenme populasyonlarından sadece birinde (K-184 (4x)) %1,6 oranında yabancı döllenme görülmüş diğer hiçbir kendileme populasyonunda yabancı döllenme tespit edilmemiştir. Açık tozlanma populasyonlarında ise çok yüksek derecede yabancı döllenme olduğu tespit edilmiştir. Hekzaploid (6x) populasyonlardan sadece A-183 (6x) populasyonunda %3,6 oranında kendine döllenme tespit edilmiş, tetraploid (4x) populasyonlarının hiç birinde kendine döllenme tespit edilmemiş ve diploid (2x) populasyonlarda ise 3 populasyondan 2 sinde A-97 (2x) populasyonunda %6,58 ve A-128 (2x) populasyonunda %0,2 oranında kendine döllenme tespit edilmiştir.
Kışlık ve yazlık Kolzada (Brassica napus) genetik tabanın genişletilmesi ve vernalizasyon kalıtımının tahmin edilmesi
ÖZET KIŞLIK VE YAZLIK KOLZADA (Brassica napus) GENETİK TABANIN GENİŞLETİLMESİ VE VERNALİZASYON KALITIMININ TAHMİN EDİLMESİ Emrullah GÜLDEMİR Yüksek Lisans Tezi, Tarımsal Biyoteknoloji Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Nedim MUTLU Nisan 2019; 48 sayfa Kolza vernalizasyon ihtiyacı olan kışlık ve olmayan yazlık çeşitlerden oluşmaktadır. Yüksek verim amacıyla yapılan hibrit ıslahı her iki grup içindeki genetik varyasyonu daraltmıştır. Çalışmanın amacı, kışlık ve yazlık kanola melezleri yoluyla genetik tabanın genişletilmesi ve vernalizasyon ihtiyacı kalıtımının belirlenmesidir. Bu amaçla, verim ve kalite (yağ kalitesi daha iyi, hastalık zararlı ve olumsuz iklim şartlarına karşı daha toleranslı vb.) açısından elit hatlar/çeşitler ıslah edilmesi gerekir. Bunu sağlayabilmenin en etkili yöntemi ise genetik tabanın genişletilmesidir. Bu hedefleri gerçekleştirebilmek amacıyla beş adet kışlık F1 ticari ve bir adet kışlık standart çeşitler ile altı adet yazlık F1 ticari ve dört adet yazlık standart çeşitler birbirleriyle resiprokal melezlemeler yapılmıştır. Bu melezlerden elde edilen yeni bitkiler aynı yıl Eylül/Ekim aylarında ekilerek çiçeklenme tarihleri kayıt edilmiştir. Açılım gösteren popülasyonlardaki kışlık/yazlık oranları vernalizasyon ihtiyacının kontrol eden genlerin kalıtımını hesaplamakta kullanılmıştır. Bu melezlemeler sonucu F1, F2, BC1 ve yapılan melezlerin kontrol grubu olarak kullanılan ebeveynleri dahil 3,5 yıl boyunca yaklaşık olarak 15000 bitki yetiştirilmiş ve çiçeklenme tarihleri not edilmiştir. Bu bitkilerden 5008 adedi maintainer (idameci), 4796 adedi sitoplazmik erkek kısır (CMS) ve 2265 adedi restorer hatları temsil etmektedir. Birbirinden oldukça farklı genetik yapıdaki hatlar/çeşitler (yazlık × kışlık) melezlendiği için geniş bir genetik açılım gözlenmiştir. Kışlık:Yazlık açılımı sonuçları vernalizasyon ihtiyacının (kışlık özelliği) tek dominant gen tarafından kontrol edildiğini ortaya koymuştur. Bu hatların saflaştırılmasından sonra yapılacak olan melezlemeler sonucu ortaya heterosis yeteneği yüksek kışlık ve yazlık CMS, idameci ve restorer hatların çıkacağı düşünülmektedir.
Markır yardımlı geriye melezlme ile fusarıum solgunluğuna (Fusarıum oxysporum Schlecht. f. Sp. melongenae) karşı dayanıklı patlıcan geliştirilmesi
Eggplants are produced in both greenhouse and open field, and fungal diseases cause significant yield loss. Fusarium oxysporum Schlecht. f. sp. melongenae, FOM) is a major soil-borne pathogen, causing vascular wilt disease in eggplant. A molecular marker tightly linked to single dominant gene (FOM) was previously available for use in marker assisted selection (MAS). The aim of the study was to develop eggplant lines resistant to Fusarium wilt by using a marker assisted backcross breeding approach. Donor parents were advanced eggplant lines known to have fusarium wilt resistance originating from "LS2436" (Solanum melongenae) lines. The eggplant breeding materials was first screened with the molecular markers linked to the FOM gene. Then, the 533 young seedlings representing various populations claimed to be resistant to the pathogen were both root-dip inoculated with FOM isolate obtained from BATEM institute (Antalya, Turkey), and screened with the molecular marker. All the seedlings identified as resistant using the markers survived the infection. Marker assisted selection and backcross programme was continued to BC1F1. The seedlings of BC1F1 population along with the parents and checks were again screened with molecular marker and then classical test. Results showed that all the plants selected by MAS showed resistance response to FOM in classical test. Resistance vs susceptible ratio was 1:1 as expected in BC1F1 generation. In conclusion, the marker is reliable for selection against FOM and developing new eggplant cultivars resistant to FOM via marker assisted backcross selection is feasible.
Ruanda yaygın fasulyelerinde (Phaseolus vulgaris L.) antraknoz ve yaygın fasülye mozaik virüsüne karşı dirençlilik için moleküler ıslah
Bean anthracnose and Bean common mosaic virus (BCMV) are the diseases devastating the yield of common beans and constrain common bean production especially in East and Central Africa. Pyramiding resistance genes for bean anthracnose and BCMV diseases in Rwandan common bean varieties would ensure stability of the crop yield. However, there might be side effects of pyramided genes on plant agronomic traits. Cleaved Amplified Polymorphic Sequences (CAPS) and Sequence characterized amplified regions (SCAR) markers were used to facilitate the process of pyramiding two anthracnose and two BCMV resistance genes into four popular susceptible market-class bean varieties G54, RWR 1668, RWR 2355 and RWV 2361. Gene pyramiding was fulfilled through concurrent backcrossing and then selfing to fix the target genes. Resistance genes in backcross populations and advanced lines were evaluated with the aid of markers. The 92 F2, 52 BC1, 51 BC2, 44 BC3 and 76 BC3F2 families with resistance genes in different combinations were obtained. Marker-assisted gene pyramiding of anthracnose and BCMV resistance genes was successfully achieved for Rwandan common beans with bc-3+Co-1+I and bc-3+Co-2+I resistance genes combination and the lines developed are expected to confer resistance to all bean anthracnose races and BCMV strains and protect bean crop against bean anthracnose and BCMV diseases. Analysis of comparisons of means between recurrent parents and their respective advanced lines in regards to; days to emergence, days to flowering , plant height, number of pods per plant, pod length, number of seeds per pod, days to physiological maturity, seed weight per plant and 100-seed weight was done with paired students t-test. The highest student's t-test values significant at the two-tailed level were 10.45 and 9.47 obtained in regard to number of pyramided genes in two seasons, followed by 5.04 and 4.89 obtained in regard to seed weight per plant. The student's t-test values 3.14 and 4.64 recorded in regard to days to flowering between two groups were significant for first and second seasons respectively. The change in number of pods per plant between two groups was significant with t-values 3.91 and 3.02 in first and second season respectively. Another objective of this study was to determine the effect of pyramided genes on other plant agronomic traits with the help of correlation and path coefficient analyses. Correlation and path analyses were used to assess the relationship between number of pyramided genes and different plant agronomic characters. The number of pyramided genes was significantly negatively correlated with pod length (-0.33), number of seeds per pod (-0.342) and plant height (-0.243). The non-significant negative correlation was found between number of pyramided genes and days to emergence (-0.059), number of pods per plant (-0.125), number of days to physiological maturity (-0.057) and 100-seed weight (-0.042). Non-significant positive correlations were exhibited between number of pyramided genes and seed weight per plant (0.128) and days to flowering (0.011). The 100-seed weight and plant height had correlation coefficients (0.950 and 0.051) almost equal to the direct path coefficients (0.957 and 0.072), respectively. Number of pyramided genes had negative indirect effect on seed weight per plant through days to emergence (-0.017), days to flowering (-0.007), plant height (-0.056), pod length (-0.008), number of pods per plant (-0.002), days to physiological maturity (-0.013) and 100-seed weight (-0.057). The correlation coefficient between number of pyramided genes and direct effect was low and non-significant. Pyramiding number of resistance genes would affect yield through independent variables. Therefore, it is important for breeders to take into consideration the number of pyramided genes with yield related traits.