Fibrinolitik enzim olan nattokinaz'ın Aspergillus oryzae'de üretimi ve saflaştırılması

Dünyadaki ölümlerin büyük bir kısmı trombotik hastalık kaynaklıdır. Trombotik hastalıklar, kan hastalığı olarak bilinse de günümüzdeki yaygın birçok hastalığın sebebi olabilir; bunların içinde en ciddi ve ölüme sebep veren hastalıklardan biri de kardiyovasküler hastalıklardır. Bu hastalıkların tedavisi için uzun yıllardır antikoagülan ve antiplatelet ilaçlar kullanılmaktadır, ancak bu ilaçlar trombozu çözmede yeterli etki göstermemektedirler. Fakat fibrinolitik enzimler, kan damarı içindeki fibrin pıhtısını parçalama ve pıhtı üzerinde hareket etme yeteneğine sahiptirler. Bu nedenle fibrinolitik enzimler, kardiyovasküler hastalıklar başta olmak üzere birçok trombotik hastalığın tedavisinde büyük önem taşımaktadır. Nattokinaz adlı bir fibrinolitik enzim, Bacillus subtilis natto'nun aprN geni tarafından kodlanır. Nattokinaz, soya fasulyesi ürünü natto'nun fermantasyonu sırasında Bacillus subtilis tarafından üretilir. Nattokinaz, trombolitik ve kardiyovasküler hastalıkların tedavisinde kullanılan ve ileri çalışmalar için umut vadeden bir enzimdir. Nattokinaz, antitrombotik, antihipertansif, antikoagülan, anti-aterosklerotik ve nöroprotektif etkilere sahiptir. Ayrıca nattokinaz, birçok ülkede "nutrasötik" olan doğal bir üründür. Oral uygulamaya uygun olup kanıtlanmış bir güvenlik profiline sahiptir, kullanımı ucuzdur ve diğer farmasötik ürünlere göre birçok avantaj sağlamaktadır. Bu nedenle çalışmamızda Nattokinaz enziminin Aspergillus oryzae'de üretilmesi ve saflaştırılması hedeflenmiştir. Bu çalışma literatürde bir ilk niteliğindedir. A. oryzae, kolay kültüre edilebilme, optimize edilebilme, hızlı büyüme, güçlü protein salgılama yeteneklerine sahiptir. Ayrıca A. oryzae, yüksek verimli, güvenli ve düşük maliyetli olması nedeniyle bu çalışma için seçilmiştir. Son zamanlarda, enzim üretiminde konak hücre olarak kullanılmaya başlanmıştır. Bunun sebebi ise A. oryzae'nin amilolitik ve proteolitik enzimler gibi büyük miktarlarda hidrolitik enzim üretebilme yeteneğidir. Bu yetenek sayesinde A. oryzae, homolog ve heterolog enzim üretimi için önemli bir kaynak oluşturmaktadır. Bu çalışmada Nattokinaz geni, C-Terminaline 8xHis-tag etiketlenerek, Aspergillus kodon optimizasyonuna uyarlanmış ve Amilaz genine füzyon edilmiş şekilde GenScript tarafından sentezlenmiştir. Ardından kalsiyum klorür yöntemi ile kompetent bakteriye (Escherichia coli One Shot) transforme edilmiştir. Ampisilin dirençli LB besiyerinden koloni seçilerek plazmit izolasyonu yapılmıştır. Plazmit, restriksiyon enzimleriyle doğrusal hale getirilmiş ve Agaroz Jel Elektroforezi yapılmıştır. Jelden hedef DNA tespit edilerek ve izolasyonu yapılarak A. oryzae'e transformasyonu gerçekleştirilmiştir (Protoplast Aracılı Transformasyon). Örnekler CD Agar plakalarına ekilmiş ve 5-7 gün 30oC'de inkübe edilmiştir. Koloniler SDS-PAGE'de kontrol edilmiştir. Seçilen koloniler DPY besiyerinde kültür edilmiş ve 5-7 gün 30oC'de inkübe edilerek ekspresyonları gerçekleştirilmiştir. Daha sonra ekspresyonu tamamlanan proteinlerin saflaştırılması için IMAC metodu kullanılmıştır. Ekspresyon kontrolü ve protein analizi için SDS-PAGE ve ardından Western Blot yapılarak protein saptanmıştır. Yapılan Western Blot sonucunda, Nattokinaz enziminin füzyon şekilde üretimi ve saflaştırılmasının başarıyla gerçekleştirildiği görülmüştür. Çalışma sonucunda 106.66 mg/L NTK enzimi üretilmiştir. İki adet aktivite testi yapılmıştır. Protrombin zamanı testinde, NTK'nın pıhtılaşmayı yaklaşık 8sn yavaşlattığı, pıhtılaşma yüzdesini ciddi oranda düşürdüğü ve INR sonucunda pıhtılaşmayı ciddi oranda yavaşlattığı görülmüştür. Yapılan diğer aktivite testi ise titanyum tüplerde kandan elde edilmiş fibrin parçalarının enzim olan mikrosantrifüj tüplerine aktarılması ve parçalanmanın olup olmadığını gözlemlemek esasına dayanır. Gözlem sonucunda 5-7 gün içinde fibrinin tamamen parçalandığı görülmüştür. Yapılan aktivite testleri sonucunda NTK'nın biokatif bir enzim olduğu kanıtlanmıştır. Anahtar kelimeler: Aspergillus oryzae, Fibrinolitik enzim, Nattokinaz, Protein saflaştırma, Protein üretimi, Transformasyon