İlaç preparatlarında etken madde ve katkı maddelerinin HPLC ile bir arada tayini

Bu çalışmada çeşitli şurup preparatlarında etken madde olarak kullanılan efedrin hidroklorür ve guaifenesin ile katkı maddeleri olarak kullanılan metil paraben, propil paraben, ponso 4R ve sakarinin bir arada tayini için gradient HPLC yöntemi geliştirildi. Yöntemin optimizasyonu 4 faktörlü, 3 seviyeli Box-Behnken tasarımı kullanılarak yapıldı. Faktör olarak pH, akış hızı, hareketli faz oranı ( tetrabütil amonyum hidroksit(TBAH) içeren fosfat (H2PO4-/HPO42-) tamponu ve metanol çözücü sisteminde % fosfat tamponu) ve %TBAH miktarları seçildi. Seviyeler pH için 6,5-7,0-7,5; akış hızı için 0,6-0,8-1,0, %fosfat tamponu için 45-50-55 ve %TBAH için ise 0,1-0,2-0,3 olarak belirlendi. Faktörlerin düşük seviyeleri için (–1), orta seviyeleri için (0) ve yüksek seviyeleri için (+1) kodları kullanıldı. Sırası rastgele belirlenen toplam 27 deney yapıldı. HPLC kromatogramındaki piklerin ayırma gücü üzerine bu faktörlerin hem kendi başlarına hem de birbirleri ile olan etkileşimlerinin etkileri incelendi. Optimizasyon tasarımı ile elde edilen verilere regresyon analizi yapıldı. ANOVA yapılarak sonuçların doğruluğu test edildi. Yapılan çalışmalarda pH , akış hızı ve hareketli faz oranı ile hareketli faz oranı ve pH'nın ikinci dereceden etkilerinin ayırma gücü üzerinde etkili olduğu görüldü. Regresyon sonuçları kullanılarak ayırma gücüne ait matematiksel bir model elde edildi. Elde edilen modelden teorik ayırma gücü değerleri bulundu. Modelin uygunluğunu test etmek için teorik ayırma gücü değerleri ile deneysel ayırma gücü değerleri arasındaki ilişki incelendi. Regresyon katsayısı 0,9195 olarak bulundu ve modelin uygun olduğuna karar verildi. Modele göre kromatografik şartlar; hareketli fazın pH'sı 6,5; oranı ve bileşimi % 0.15 TBAH içeren fosfat tamponu/metanol (52:48); akış hızı 0,6 mL/dak olarak belirlendi. Gradient program 0-8,5 dak. %52 fosfat tamponu, 8,5-25 dak. %40 fosfat tamponu olacak şekilde uygulandı. Belirlenen bu şartlarda maddelerin kromatogramları 210 nm'de spektrofotometrik dedektör kullanılarak kaydedildi. Geliştirilen yöntemin validasyonu doğrusallık, tekrarlanabilirlik, doğruluk (% geri kazanım), tanıma- tayin sınırı (LOD-LOQ) ve dayanıklılık parametreleri incelenerek yapıldı. Doğrusallık için yapılan çalışmalarda regresyon katsayıları (R2) efedrin hidroklorür, guaifenesin, metil paraben, propil paraben, ponso 4R ve sakarin için sırasıyla 0,9981; 0,9995; 0,9994; 0,9970; 0,9993; 0,9999 olarak bulundu. Efedrin hidroklorür, guaifenesin, metil paraben, propil paraben, ponso 4R ve sakarin için güniçi tekrarlanabilirlik testlerinde %RSD değerleri sırasıyla; 0,56-1.62; 0,09-0,89; 1,20-1,60; 0,40-099; 0,59-1,02; 0,77-1,60, günlerarası tekrarlanabilirlik testlerinde ise %RSD değerleri yine sırasıyla 0,78-1,89; 1,02-1,9; 1,44-1,88; 0,80-1,34; 0,98-1,20 1,32-1,85 aralığında bulundu. Doğruluk için, incelenen maddeleri içeren örnek çözeltisi, içine 3 farklı konsantrasyonda efedrin hidroklorür, guaifenesin, metil paraben, propil paraben, ponso 4R ve sakarin ilave edilerek analiz yapıldı. Sırasıyla %100,86-%102,50; %96,47-%101,22; %99,00-%101,20; %99,67-%101,80; %95,00-%99,80; %100,70-%102,58 aralığında geri kazanım değerleri elde edildi. Efedrin hidroklorür, guaifenesin, metil paraben, propil paraben, ponso 4R ve sakarin için sırası ile tanıma sınırı; 0,25; 0,02; 0,18; 0,12; 0,11; 0,008 μg/ mL, tayin sınırı; 0,83; 0,07; 0,60; 0,40; 0,38; 0,03 μg/ mL olarak hesaplandı. Çözeltilerin stabilitelerini incelemek amacıyla çalışılan maddeler su ve hareketli faz içerisinde, oda sıcaklığında ve 4Co'de belli sürelerde bekletilerek analiz edildi. Efedrin hidroklorür, guaifenesin, metil paraben, propil paraben, ponso 4R ve sakarinin bir arada analizi için geliştirilen HPLC yöntemi Brodil ve Broksin adlı şurup preparatlarına başarıyla uygulandı. Bu preparatların 1,044 - 1,320 mg/mL metil paraben, 0,139 mg /mL propil paraben, 0,153-0,154 mg/mL ponzo 4R ve 3,223-5,095 mg /mL sakarin içerdiği saptandı. Etken maddeler için 99,39-103,82 aralığında % geri kazanım değerleri bulundu.