İnsan plasental ribonükleaz inhibitörünün heterolog ekspresyonu ve saflaştırılması

İnsan plasental ribonükleaz inhibitörü (RI), in vivo olarak RNaz aktivitesini düzenleyen ve in vitro olarak RNaz kontaminasyonunun potansiyel bir problem olduğu çeşitli moleküler biyoloji uygulamalarında yaygın olarak kullanılan sitoplazmik bir proteindir. RI, hidrofobik lösin açısından zengin tekrar motiflerinden oluşması ve yüksek miktarda indirgenmiş sistein kalıntıları içermesi gibi benzersiz özellikleri ile ayırt edilmektedir. Rekombinant RI ekspresyonunun, Escherichia coli sitoplazmasında çözünür formda yüksek seviyelere ulaşması son derece zordur. Bu çalışmada RI' nın çözünür ifadesini geliştirmek için N-terminal füzyon ortağı, moleküler şaperonlar seti, indirgeyici ajanlar ve yeniden katlama prosedürleri kullanılmıştır. 6x-His etiketi, sfGFP füzyon etiketi ve TEV proteaz bölgesi içeren bir rekombinant ekspresyon vektörü oluşturularak, ekspresyon için konakçı organizma olarak E. coli BL21 (DE3) suşu tercih edilmiştir. Rekombinant plazmit, BL21 hücrelerine başarılı bir şekilde transforme edilmiştir. İnklüzyon cisimciklerinden geri kazanılan proteini saptamak için SDS-PAGE analizi gerçekleştirilmiştir. 78 kDa moleküler kütleye sahip tek bir bant gözlenmiştir. N terminal etiketi, doğal RI oluşturmak için üretilen TEV proteaz ile uzaklaştırılarak NiNTA agaroz ile protein saflaştırması yapılmıştır. RNA elektroforezi kullanılarak RI' nın aktif olduğu tespit edilmiştir.