Mentha x piperita L. bitkisinde soğuk stres toleransında etkili olduğu düşünülen bazı genlerin transkripsiyonel düzeyde ekspresyonlarının real-time PCR ile tespit edilmesi

Lamiacea ailesine ait en önemli tıbbi aromatik bitkilerden biri olan Mentha x piperita L., su nanesi ile kıvırcık nanenin çaprazlanmasından oluşan hibrit bir türdür. İçerdiği sekonder metabolitler ile birçok ilacın etken maddesini oluşturmasının yanı sıra, değerli uçucu yağları sayesinde baharat olarak gıda sektöründen kozmetik endüstrisine geniş bir yelpazede kullanılmaktadır. Fakat, geçmişten günümüze iklim koşullarında meydana gelen sıcaklıklardaki ani değişimler gibi abiyotik faktörler ve antropojenik faaliyetler birçok bitki türünü olumsuz etkilemektedir. Bitkilerin üreme, büyüme ve gelişmelerini negatif etkileyen bu durumlarla başa çıkmak adına bitki stres tolerans mekanizmalarının ve sinyal yolaklarında rol alan moleküllerin keşfedilmesi gerekmektedir. Tıbbi ve ekonomik açıdan oldukça önemli olduğu bilinen M. piperita'nın tohumla üretilememesi ve ani bir şekilde değişen çevre şartlarından kolay etkilenmesi bir yana henüz bitkide soğuk stres üzerinde herhangi bir gen ekspresyon çalışması olmaması bu alanda çalışmaların yapılması gereksinimini ortaya koymaktadır. M. piperita bitkisinin farklı parametreler denenerek uzun süreli olarak koruma sağlayan kriyoprezervasyon uygulamasından sonra başarılı bir şekilde rejenere olduğu yapılan çalışmalar sonucunda belirlenmiş olup M. piperita bitkisi için kriyoprezervasyonda soğuk alıştırmanın etkili olup olmadığını bilinmemektedir. Bu amaç doğrultusunda M. piperita bitkisinde soğuk stresiyle ilişkisi olduğu düşünülen altı genin ekspresyon seviyeleri Real-Time PCR ile tespit edilmiştir. Bunun için ilk olarak M. piperita'da soğuk stres genlerine ilişkin bir sekans verisi olmadığından model organizma olan Arabidopsis thaliana'da soğuk stresle ilişkili genler tespit edildi ve ardından NCBI veritabanında iki tür arasında BLAST yapılarak hedef genlere en çok eşleşen sekanslar belirlendi. Bu sekanslara özgü primerler yine NCBI veritabanı kullanılarak tasarlandı. İlgili genlerin M. piperita bitkisinde soğuk stresiyle korelasyonunu transkripsiyonel düzeyde belirlemek adına, in vitro ortamda yetiştirilen deney materyalleri 24, 72 ve 168 saat boyunca soğuk strese maruz bırakıldı. Üç farklı deney grubu ile kontrol grubuna ait yaprak ve gövde örneklerinden total RNA izolasyonu gerçekleştirildi. Real-time PCR'da kullanılmak üzere reverse transkriptaz enzimi ile total RNA'lardan cDNA sentez edildi. Hedef genlerin mRNA ekspresyon seviyelerini kantitatif olarak tespit etmek amacıyla Real-Time PCR yapıldı. Sonuçlardan elde edilen CT değerleri, 2-ΔCT yöntemi kullanılarak 18S rRNA normalizasyonu ile altı genin kontrol grubuna kıyasla mRNA ekspresyon grafikleri oluşturuldu. Sonuçların anlamlılığı için TTEST yapıldı ve p ≤ 0.05 değerinde olanlar anlamlı kabul edildi.