Pankreatik lipaz enziminin kompozit taşıyıcılarda immobilizasyonu ve karakterizasyonu

Lipazlar (triaçilgliserol hidrolazlar, EC 3.1.1.3), yağların hidrolizini veya sentezlenmesini katalizleyen enzimlerdir. Biyokimyasal ve fizyolojik özelliklerinin yanında endüstriyel uygulamaları nedeniyle de araştırma konusu olmaktadırlar. Lipazlar, katı ve sıvı yağları, serbest yağ asitleri, diaçilgliseroller, monoaçilgliseroller ve gliserollere hidroliz eden, oldukça yaygın olarak bulunan enzimlerdir. Bunun yanı sıra organik çözgenlerde esterifikasyon, transesterifikasyon, aminoliziz gibi çok çeşitli reaksiyonun katalizini de gerçekleştirirler. Katalizledikleri bu çok çeşitli reaksiyonlar nedeniyle rasemik karışımların ayrılması, yeni sürfaktanların ve farmasötiklerin sentezi, yağ dönüşümleri, deterjan üretimi gibi oldukça geniş endüstriyel kullanım alanına sahiptirler. Ekonomik açıdan düşünüldüğünde, lipazın endüstriyel ölçekte kullanımı immobilizasyonunu gerektirmektedir. İmmobilize enzimler birçok kez ve uzun süre kullanılabilmesi, sürekli işlemlere uygulanabilmesi, kararlı olması, çevre koşullarına(pH, sıcaklık, vs) dayanıklı olması gibi sebeplerden dolayı doğal enzimlere göre daha çok tercih edilirler. Bu çalışmada porsin pankreatik lipaz enzimi doğada bol miktarda bulunan, ekonomik ve ucuz bir biyopolimer olan kitosan ile hazırlanan kompozit taşıyıcılar üzerine kovalent olarak immobilize edildi. Kitosan laboratuvar ölçekli çalışmalarda enzim immobilizasyonu için yaygın olarak kullanılmasına rağmen endüstriyel uygulamalarda bazı engeller vardır. Çapraz bağlı kitosan boncukları büyük mekanik dayanıklılığa sahiptir ancak yine de operasyonel uygulamalarda sorunlarla karşılaşılmaktadır. Boncuk yoğunlukları suya çok yakındır ve dokusu çok yumuşaktır. Bu çalışmada kitosan, mekanik kararlılığı artırmak için karbon nanotüp (Multiwalled carbon nanotube, MWCN) ve perlit gibi materyaller ile karıştırıldı, hazırlanan süspansiyon tripolifosfat içerisine damlatılıp kompozit boncuklar oluşturuldu. Bu şekilde kitosan boncukların yoğunluk ve mekanik gücü artacak ve uygulama alanları genişleyecektir. Hazırlanan kompozit taşıyıcıların kararkterizasyonu fourier transform infrared (FTIR) spektroskopisi, taramalı elektron mikroskopu (SEM) ve termal gravimetrik analiz (TGA) ile yapıldı. İmmobilizasyon koşulları optimizasyonu amacıyla çapraz bağlama süresinin etkisi, enzim bağlama süresinin etkisi ve enzim konsantrasyonunun etkisi incelendi. ECH ile optimum çapraz bağlama süresi kitosan-perlit kompozit boncuklar için 4 saat, kitosan-MWCNTs kompozit boncuk için 17 saat bulundu. Lipaz enziminin optimum bağlanma süresi çapraz bağlı her iki kompozit boncuk içinde 24 saat ve optimum enzim konsantrasyonu 2 mg/ml bulundu. Bununla birlikte hem serbest hem de immobilize lipaz aktivitesi üzerine pH'ın etkisi ve sıcaklığın etkisi incelendi. Optimum pH değeri serbest enzim için pH 7,0, iki farklı taşıyıcıya immobilize edilmiş enzim için ise bir birim alkali bölgeye kayarak pH 8,0 bulundu. Serbest enzim için optimum sıcaklık düzeyi 40 °C olarak belirlenirken kitosan-perlit ve kitosan-MWCNTs için bu değer 50 °C olarak belirlendi. Serbest ve immobilize enzimin sıcaklık, pH ve depolama stabiliteleri karşılaştırılarak, immobilize lipaz enziminin tekrar kullanılabilirliği incelendi. Kompozit taşıyıcılar üzerine immobilize edilen lipaz enziminin yüksek sıcaklıklarda serbest enzime göre daha stabil olduğu görüldü. Geliştirilen yöntemle immobilize lipazın her pH düzeyinde stabilitesinin arttığı ve pH stabilite aralığının genişlediği görüldü. Serbest ve immobilize enzimlerin depolama stabiliteleri incelendiğinde, immobilize enzimlerin serbest enzime kıyasla daha yüksek stabilite gösterdiği gözlemlendi. 40 günün sonunda; +4 °C de kitosan-perlit kompozit boncuk üzerine immobilize edilen lipaz için % kalan aktivite değeri %59; kitosan-MWCNTs kompozit boncuklar üzerine immobilize edilen lipaz için % kalan aktivite değeri %63 olarak hesaplanırken bu değer serbest enzimde %20 olarak ölçüldü. Oda sıcaklığında ise kitosan-perlit kompozit boncuk üzerine immobilize edilen lipaz için % kalan aktivite değeri %48; kitosan-MWCNTs kompozit boncuklar üzerine immobilize edilen lipaz için % kalan aktivite değeri %55 olarak belirlenirken bu değer serbest enzimde %5 olarak bulundu. Ayrıca immobilize lipazın tekrar kullanılabilirliği incelendiğinde; kitosan- perlit ve kitosan- MWCNTs kompozit taşıyıcı üzerine immobilize edilen lipaz enziminin sırasıyla 15 kez ve 13 kez tekrar kullanım sonrasında % 50 aktivitesini koruduğu gözlendi.